You are on page 1of 2

Protocolos simplificados para la preparacin de ADN genmico De cultivos bacterianos

Introduccin

El desarrollo de metodologas para el anlisis de microorganismos y ecologa microbiana, a nivel


molecular (es decir, cidos nucleicos, protenas, lpidos y sus genes), ha progresado fenomenalmente en
los ltimos aos. Cada metodologa tiene ventajas y desventajas especficas, o complicaciones. Sin
embargo, los avances en PCR, clonacin, sondaje de genes, secuenciacin e impresin de huellas han
permitido que las tcnicas que explotan los cidos nucleicos se utilicen ampliamente para el anlisis de
microorganismos. A menudo, tales protocolos requieren, en primer lugar, que los cidos nucleicos se
extraigan en una forma que pueda emplearse para los anlisis. Esto puede, en algunos casos, ser ms
difcil de lo previsto inicialmente, ya que muchas bacterias son extremadamente resistentes a la
alteracin celular. Tpicamente, se trata de bacterias Gram-positivas (por ejemplo, Mycobacterium spp.,
Peptococcus spp., Rhodococcus spp., Etc.), as como algunas Archae (por ejemplo, metangenos), con
paredes celulares gruesas de polisacrido o pseudopeptidoglucano y muchas especies De hongos y
algas.

Consideraciones Generales

Varios protocolos han sido desarrollados y descritos para la preparacin de ADN gentico a partir de
bacterias, comenzando con el mtodo prototpico de Marrnur [16], que involucr: a) la disrupcin
celular por lisis enzimtico-detergente; B) extracciones con disolventes orgnicos; Y c) recuperacin
del ADN por precipitacin con alcohol. Los protocolos subsiguientes han implicado usualmente alguna
modi fi cacin de uno o ms de estos pasos generales.

Interrupcin celular
El paso ms difcil e incierto en la obtencin de ADN a partir de cultivos bacterianos es el de
interrumpir las clulas. Las dificultades se derivan, en parte, de las limitaciones impuestas en el manejo
de las preparaciones, que son necesarias para obtener ADN genmico de alto peso molecular. Por lo
tanto, en general, el medio ms deseable para interrumpir las clulas bacterianas para obtener ADN
genmico es a travs de digestin enzimtica y lisis de detergente. Tal estrategia se potencia mediante
el tratamiento previo de clulas con un agente quelante de metales, tal como cido etilendiamino-
tetraactico (EDTA). Si la pared celular del organismo es susceptible a tales tratamientos, se puede
obtener un ADN genmico de peso molecular relativamente alto que sea aplicable para un nmero de
tcnicas analticas. Adems, la lisis debe llevarse a cabo en un medio tamponado (pH 8-9) que contiene
EDTA. El pH alcalino reduce las interacciones electrostticas entre el ADN y las protenas bsicas, ayuda
a desnaturalizar otras protenas celulares e inhibe las actividades de la nucleasa. EDTA se une a
cationes divalentes, en particular Mg2 + y Mn2 +, reduciendo la estabilidad de las paredes y membranas
y tambin inhibe nucleasas que tienen un requisito para cationes metlicos.
Interrupcin celular por tratamientos enzimticos
La lisozima, aislada comercialmente a partir de clara de huevo de pollo, es un miembro de la amplia
clase de muramidasas que catalizan la hidrlisis de la unin -1,4-glicosdica entre la unidad repetitiva
de cido N-acetilmurmico-N-acetilglucosamina, que comprende una parte principal de La capa
peptidoglycan de las paredes celulares de la mayora de las bacterias [18]. Lysozyme es especialmente
eficaz en la interrupcin de las clulas bacterianas cuando se utiliza en combinacin con EDTA [15]. La
lisozima y los enzimas relacionados son tiles para interrumpir las clulas de una amplia gama de
especies bacterianas, aunque muchas especies no son particularmente susceptibles al tratamiento con
muramidasa debido, presumiblemente, a capas de protena o lodo capsular, que protegen el
peptidoglicano. Adems, como sus paredes celulares no contienen peptidoglicano, todas las especies
descritas de Archae son resistentes a la actividad de la lisozima.
La proteinasa K, una serina proteasa producida por el hongo Tritirachium album, se adhiere adyacente
a los grupos carboxilo de aminocidos alifticos y aromticos implicados en el enlace peptdico [4],
incluyendo aquellos que comprenden las interpolaciones peptdicas de reticulacin de las capas
peptidoglicanas de las paredes celulares De bacterias. La aplicabilidad de la proteinasa K para
interrumpir las paredes celulares bacterianas se ve reforzada por su insensibilidad a agentes quelantes
especficos, lo que permite utilizarlo en combinacin con EDTA y lisozima. Sin embargo, las
interpolaciones peptdicas de las paredes celulares de diferentes especies, formadas por diferentes
combinaciones de aminocidos componentes, con susceptibilidades inherentemente diferentes a la
escisin, pueden ser ms o menos resistentes a la lisis de Proteinasa K.
Aunque la lisozima y la proteinasa K son, probablemente, las enzimas ms comnmente usadas para la
disrupcin de las clulas bacterianas, tambin se han reportado otras enzimas que alteran las clulas
bacterianas con especificaciones amplias o estrechas. Otras muramidasas, la mutanolisina y la
lisostafina reaccionan, anlogamente a la lisozima, a los enlaces peptdicos en las paredes celulares,
aunque las especies que son susceptibles a estas enzimas difieren de aquellas que estn afectadas por la
lisozima [2, 20, 26]. Subtilisinas