UNIVERSIDAD DE COLIMA

FACULTAD DE MEDICINA
Centro Universitario de Investigaciones Biomdicas

MODIFICACION DEL CURSO DE LA CIRROSIS EXPERIMENTAL

CON EXTRACTOS TOTALES DE ROMERO
(Rosmarinus of ficinalis) .

Que para Obtener el Grado de:

MAESTRO EN CIENCIAS
En la. especialidad de :

FARMACOLOGIA
Presenta:

Asesor: Patricia Yahuaca Mendoza

COLIMA, COL., FEBRERO DE 1994.

 Con gratiud, a mis padres:

Gabriel Alvarez Mendoza

Graciela Amezcua Eudave

A mis hermanos:
Ma. Rosario, Elsa, Horacio,
Maria Elizabeth y Gabriel;
por su apoyo y convivencia
armnica.

A una gran amiga:

Anabel Ramrez Guerrero.

 El desarrollo de este trabajo
intervinieron d e manera directa e indirecta numerosas
personas e instituciones. El reconocimiento y
agradecimiento de su ayuda y valioso tiempo constituyen
para mi una grata obligacin.

AGRADEZCO:

A las autoridades de la Universidad de Colima y del

Centro Universitario de Investigaciones Biomdicas, por
la oportunidad brindada.

A los Drs. en Cs.: J. Antonio Snchez Chapula,

Miguel Huerta Viera y jess Muiz Murguia por el apoyo e inters
en mi formacin acadmica.

A los compaeros Jess Juan Jos, Ricardo,

Armando y Sergio), por su ayuda tan animosa durante mi
estancia en el CUIB.

Muy especialmente al personal tcnico del CUIB:

Lupita Rodrguez, Mayita, Vicky, Jess Dueas,
Candelario Uribe, Nieves, Silvia, Daniel y Joel.

A las autoridades de la Universidad Autnoma de

Zacatecas.
Al Dr, Rodolfo Garca Montoya, Director de la
Facultad de Medicina Humana y Ciencias de la Salud de la
UAZ, por el apoyo ofrecido durante mi estancia en el
departamento de Farmacologa de la misma Facultad.
A la Dra. en Cs. Patricia Yahuaca, por dejarme
conocer todas sus experiencias y actitudes que deben
tomarse durante la realizacin de un trabajo cientfico.
Al personal del UCOBI de la Facultad de Medicina
Humana y Ciencias de la Salud de la UAZ, especialmente
al Lic. Juan Antonio Surez Pantoja.
 A la M. en Cs. Ma. Guadalupe Mndez Rodrguez, Jefa
del Departamento de Documentacin de la Biblioteca
General de la UAZ, por su decidido apoyo.
A la Dra. Elsa Villegas Salas, por su contribucin
a la ciencia al proporcionar el Romero necesario para la
realizacin de este trabajo.
Al M. en Cs. Oscar Prez Veyna, Coordinador del
cuc, por su arduo trabajo en el preciso anlisis
estadstico.
Al Dr, Reynaldo Gurrola,por sus acertadas
descripciones histopatolgicas.
A Ascencin Rodrguez (chonito), por su invaluable
trabajo en la preparacin de cortes histolgicos.
As mismo agradezco muy especialmente el apoyo
tcnico brindado por los Q.F.B.: Arcelia Gonzlez
Garca, Mario Zapiens, Mario Carolina Leyva, Lpez
Mimbela y Rocio Acua.
Tambin a Margarita Flores V, por su importante
colaboracin en la limpieza del material de
laboratorio.
Quiero adems agradecer,a todas aquellas personas
que contribuyeron ala realizacin de este trabajo y que
no pude mencionar.

Agradezco al CONACyT por el apoyo econmico

recibido durante mi formacin acadmica con
no. de becario: 02334.

Agradezco tambien al FONDO: Dr. Juan

Garca Ramos por el apoyo econmico brindado
p a r a l a realizacin d e e s t e t r a b a j o .
 Parte de los resultados de esta tesis fueron
presentados en las V Jornadas Mdicas de la Facultad de
Medicina Humana y Ciencias de la Salud de la Universidad
Autnoma de Zacatecas.

Alvarez C, Alvarado JL y Yahuaca P.:

Modificacin del curso de la cirrosis experimental con la
administracin de extractos de Romero. (1993). Memorias de
las V Jornadas Mdicas. Facultad de Medicina Humana y
Ciencias de la Salud. UAZ. Zacatecas, Res. XI, 37.
 RESUMEN

La cirrosis heptica es la octava causa de muerte

a nivel nacional, y es una de las enfermedades que origina
una importante incidencia de incapacidad en el trabajo, en
individuos mexicanos en edad productiva, por lo que es
necesario contar con tratamientos farmacolgicos que brinden
una alternativa teraputica al paciente cirrtico. Desde
hace tiempo y de manera empricas se han utilizado extractos
o decocciones de Romero (Rosmarinus officinalis, planta de la
familia Labiatae), con la finalidad de producir beneficio al
paciente cirrtico.
Con el propsito de esclarecer el efecto del R.
officinalis sobre la cirrosis heptica, nos propusimos
investigar la participacin de los extractos acuosos totales
de esta planta en un modelo experimental con tetracloruro de
carbono. Se utilzaron ratas Wistar de un peso aproximado de
50 gramos, las que se dividieron en 5 grupos experimentales,
como sigue: l.- Control de vehiculo, 2.- Cirrosis heptica,
3.- Animales cirrticos que recibieron Romero, 4.- Ratas que
recibieron Romero y tetracloruro de carbono desde el inicio;
5.- Control de Romero. El tetracloruro de carbono se
administr por va I.P. en dosis de 0.4g/kg de peso
corporal, 3 veces/semana, durante 14 semanas. El extracto de
Romero se dosific diariamente (durante 14 semanas) en el
agua de beber de los animales, en una proporcin de 8mg/ml
(hojas:agua), para un total de 250 mg diarios. Se midieron
diversos indicadores de dao heptico. Los resultados
obtenidos al administrar como terapia los extractos totales
de Romero, mostraron un incremento en la concentracin del
ADN, lo que sugiere una regeneracin celular, el lactato,
aumentado durante la cirrosis se recuper hasta niveles
similares a los encontrados en ratas control; la medicin de
la actividad enzimtica de transaminasas glutmico pirvica y
oxalaceticas adems de la gamma-glutamil transpeptidasa mostr
un efecto recuperativo parcial en dicha actividad, el proceso
de biotransformacin heptica daado en la cirrosis se
recuper al recibir el tratamiento con Romero. En el estudio
morfolgico de cortes hepticos el Romero induj cambios
estructurales que indican una reversin parcial de las
alteraciones manifiestas en la cirrosis.
El uso de la terapia con los extractos acuosos
totales de Romero vendra siendo una alternativa ms, en el
tratamiento de los pacientes cirrticos desahuciados; ya que,
en general nuestros resultados demuestran el beneficio de
utilizar los extractos de Romero, en el tratamiento de la
cirrosis heptica, ya que el dao del hgado, es prevenido y
revertido parcialmente y con su funcionalidad recuperada en
una proporcin importante, con lo que se puede propiciar una
mejor calidad de vida a los individuos cirrticos.

"Primum non nocere"

 INDICE

I.- INTRODUCCION.

l.-FISIOLOGIA DE LA CIRROSIS HEPATICA.

Generalidades .................................. 1
2.-TRATAMIENTO DE LA CIRROSIS.
Aspectos generales ............................. 7
Descripcin botnica de Romero ................. 9
Propiedades del Romero descritas empiricamente. 12
Propiedades del Romero descritas cientificamente. 13
II.- JUSTIFICACION. 15
III.- HIPOTESIS. 16
IV.- OBJETIVO. 16
V.- DISEO EXPERIMENTAL.
Induccin de cirrosis .......................... 17
Tratamiento: obtencin de extracto, adminis-
tracin ........................................ 19
Anlisis estadstico ........................... 21
VI.- METODOLOGIA.
l.- FUNDAMENTO DE LAS TECNICAS EMPLEADAS.
Prueba de replicacin celular ................. 22
Pruebas metablicas ............................ 23
Medicin de actividad enzimtica ............... 29
Actividad biotransformante heptica ............ 33
Aspectos morfolgicos del hgado ............... 35
Cuantificacin de colgena heptica ............ 37
VII.- RESULTADOS.

Indicador de replicacin celular ............... 42

Glucgeno heptico ............................. 44
Glucgeno muscular ............................. 46
Lactato sanguneo .............................. 46
Bilirrubinas ................................... 49
Protenas totales .............................. 51
Gamma Glutamil-transpeptidasa.................. 51
Transaminasa glutmico piruvica................ 54
Transaminasa glutmico oxalactica............. 57
Hidrolasa de aspirina.......................... 57
Estudio morfolgico............................ 59
Colgena heptica.............................. 68
Anlisis estadstico de resultados............. 70
VIII.- DISCUSION. 71
IX.- CONCLUSIONES. 82
X.- REFERENCIAS. 84
 INTRODUCCION

FISIOPATOLOGIA DE LA CIRROSIS HEPATICA

La cirrosis heptica es la via final comn de

todos los padecimientos crnicos que afectan al hgado en
forma difusa, desde el punto de vista anatmico, esta
enfermedad se caracteriza por dao celular generalizado,
aumento del tejido conjuntivo, formacin de ndulos de
hepatocitos rodeados por bandas de colgena y distorsin de
la arquitectura lobular (l-4).
El aumento del tejido conjuntivo heptico
(fibrosis heptica) en la cirrosis y las modificaciones
estructurales son responsables, en parte, de algunas de las
alteraciones funcionales y hemodinmicas observadas (2).
Esta enfermedad es producida por diversos
agentes etiolgicos, tales como virus, parsitos, solventes
txicos, alcohol, etc., y adems la obstruccin biliar de
conductos intra y extrahepticos. Aunque cada agente produce
dao por un mecanismo totalmente distinto, es probable que la
respuesta fibrognica siga una va final comn, y que la
cicatriz formada en el hgado sea semejante a cualquier otra
que se produzca en otros sitios del organismo.
 Con respecto a la magnitud del dao, podemos
hacer dos consideraciones: l.- Cuando es masivo y agudo,
existe destruccin de un gran numero de hepatocitos. Esta
prdida sbita del parnquima funcional estimula la
regeneracin heptica (3). Dicho proceso es coordinado e
incluye regeneracin celular y degradacin de colgena, dando
lugar a la remodelacin del tejido. Si el dao es unico y el
paciente sobrevive, el hgado regenera rpidamente y en pocas
semanas se reestablece su integridad anatmica y funcional
(4,5)* En estos casos, no es comn encontrar tejido
cicatricial en el hgado, indicando que ha predominado el
proceso de regeneracin. 2.- Cuando el dao es de menor
intensidad y el nmero de clulas destruidas es pequeo, es
probable que no se estimule la regeneracin del rgano y slo
se produzca una pequea cicatriz; en caso de que esta lesin
sea nica, existe remodelacin y reabsorcin del tejido
cicatricial. Cuando el dao se vuelve a producir de manera
crnica, ya sea porque el agente inductor est presente o
porque se estimulen mecanismos inmunolgicos que perpetan la
enfermedad, el proceso cicatricial contina, producindose
primero una fibrosis y posteriormente la cirrosis heptica
(cuadro 1). En estas condiciones, y a pesar de haberse
iniciado un fenmeno de regeneracin heptica, sta ltima es
mnima o inexistente, Y el fenmeno cicatricial es el
predominante (6,7).
 1

EVENTO PRIMARIO

DAO CRONICO
(leve-persistente)

(regenera) espontneamente

CIRROSIS

CUADRO l.- Magnitud de la lesin heptica.

Para el estudio de la fisiopatologia de la

cirrosis, se han utilizado diversos tipos de modelos
experimentales en animales; de ellos, el ms adecuado es
aquel, en el cual utiliza al tetracloruro de carbono (CCl4)
como agente etiolgico (8). Con este txico, la cirrosis se
establece a partir de la 8a. semana de la administracin,
siendo irreversible espontneamente, a partir de este
tiempo. Este modelo ha sido utilizado por diversos autores
y validado por otros (9-12).
De los estudios sobre dao heptico realizados
en modelos animales, se ha sugerido que el proceso de
sntesis de colgena se incrementa y perdura mientras el
agente etiolgico est presente (8,9). Tanto la fibrosis,
como las alteraciones metablicas relacionadas con la
fibrognesis, retornan hacia lo normal a partir de la segunda

3
semana despus de descontinuar la administracin del CC14 en
ratas que fueron intoxicadas durante 7 semanas con dicho
agente (8,9,13). De acuerdo con estos datos, la cirrosis
debera ser reversible cuando el agente etiolgico e s
eliminado. Sin embargo, en humanos se ha observado que la
fibrosis puede continuar paulatinamente hasta cirrosis,
independientemente de que el agente etilogico est o no
presente.
En los animales con cirrosis inducida por CC14,
se presentan diversas manifestaciones en forma semejante a'la
cirrosis humana. Mostrando aumento en la actividad de la
adenilato ciclasa incrementando los niveles de adenosin
monofosfato ciclico (AMPc) (14), elevacin del lactato y la
prolina sricos (15), alteracin de la actividad de las
ATPasas de membrana plasmtica de hepatocitos (16,17), a la
vez que un incremento en la concentracin de colgena en
hgado (l-4). Tambin se ha reportado un aumento en la
actividad simptica (5), que se asocia con los cambios
metablicos encontrados como disminucin del depsito de
glucgeno heptico.
Adems, en el hgado de los sujetos
cirrticos, ocurren cambios funcionales, metablicos y
hormonales (5) que se detectan por la alteracin de los
valores normales de algunos indicadores (6,7). Como son el
aumento de la actividad srica de las enzimas transaminasa
glutmico pirvica TGP (ALAT) y gamma-glutamil transpeptidasa

(GGTP) , los niveles de bilirrubinas, lactato y prolina

sricos (7118). Asi mismo, se ha reportado un aumento en la

4
concentracin de catecolaminas plasmticas y urinarias,
adems de un incremento del AMPc en el plasma (19-21), esto
ltimo, al parecer como resultado de la estimulacin
adrenrgica. Dicho evento, trae por consecuencia un
incremento de la actividad metablica del hepatocito, mediado
por el AMPc (22-26). Analizando la relacin existente, entre
algunos de los eventos descritos anteriormente durante la
cirrosis, podemos comentar que probablemente estos fenmenos
conducen a un incremento en el dao heptico, as como a la
fibrognesis (cuadro 2).
En una revisin previa, sobre el modelo
experimental con CC14, Prez-Tamayo report que existe mucha
similitud entre ste y la cirrosis humana (9), por lo que, el
mismo, se ha considerado ideal para estudiar los mecanismos
fisiopatolgicos del proceso y adems evaluar diversas
terapias farmacolgicas.
Para explicar la participacin del
txico CC14 en el dao heptico, en 1967 Recknagel (8)
plante diferentes teorias. En una de ellas sugiri que el
efecto del compuesto, sobre el hgado conduce a una
liberacin masiva de catecolaminas que se traduce en una
reduccin de flujo sanguneo heptico y un incremento en la
movilizacin de cidos grasos desde depsitos perifricos, lo
que ocasiona el hgado graso. Posteriormente se han reportado
una serie de estudios acerca de la participacin adrenrgica
en la cirrosis heptica; en 1979, Ciplea, Henrikssen y otros
(19-21), mostraron que la actividad nerviosa simptica

5
+ LACTATO 9 PROLINA
LIBRE

ESTIMULACION DE J
FIBROGENESIS

f CATECOLAMINAS $ AMPC

CUADRO 2. Eventos estimulantes de la fibrognesis.

estaba aumentada en pacientes cirrticos, detectndose
niveles elevados de adrenalina y noradrenalina en el plasma.
Esta hiperactividad adrenrgica podria ser responsable de
innumerables efectos observados en dichos pacientes, entre
ellos, vasoconstriccin renal y sistmica, retencin de sodio
y agua (27), etc. Algunos de estos efectos son resultantes de
la estimulacin de la adenilato ciclasa, mismos que pueden
ser inhibidos especificamente con bloqueadores beta
adrenrgicos (28-30). Los datos reportados en humanos
concuerdan con la modificacin simptica observada en el
modelo experimental.

TRATAMIENTO DE
- LA
- CIRROSIS HEPATICA

Desde hace algunas dcadas se ha reportado que

es posible influir favorablemente en el curso del proceso
cirrtico mediante el uso de agentes farmacolgicos. Esto se
basa fundamentalmente en observaciones descritas en la
literatura derivadas de estudios en animales y en humanos
(7,18,31-33). Algunos investigadores han sugerido que este
padecimiento podria ser modificado al reducir la sntesis y
el depsito de colgena o al aumentar su degradacin (l-3,6).
Adems se ha sugerido que los frmacos que mejoran la
funcionalidad del hepatocito cirrtico, administrados junto
con los agentes antifibrognicos, deben conducir a una mejor
remisin del padecimiento. La sntesis de la colgena puede
ser inhibida por diversos agentes denominados

7
antifibrognicos, entre los cuales se incluyen: anlogos de
prolina, agentes quelantes de hierro, agentes latirognicos,
penicilamina, corticosteroides, colchicina, y silimarina
(34,35).
Entre los distintos compuestos con actividad
antifibrognica, la colchicina es la que en la actualidad se
considera con mayores ventajas para el tratamiento de la
cirrosis experimental y en algunos casos en la humana
(30,35).
As como estos frmacos se han utilizado en los
padecimientos hepticos y la mayoria de ellos han sido
obtenidos de productos naturales, existen tambin muchas
otras plantas que han sido tradicionalmente utilizadas por
sus propiedades hepatoprotectivas (36). Los datos encontrados
acerca del uso de productos naturales, generalmente son de
tipo emprico pero en algunos casos, es posible comprobar
cientificamente su actividad teraputica. Para ello, se
requiere de un modelo experimental adecuado, cuyos
resultados puedan extrapolarse para su utilizacin en
humanos.
Es un hecho que las plantas producen una amplia
variedad de substancias qumicas que tienen efecto sobre los
tejidos animales. Aunque a veces, toda una planta, incluidas
las races tiene uso medicinal, lo ms comn es que los
principios activos se concentren en ciertos rganos.
Generalmente son las hojas las partes que resultan ms ricas
en compuestos de aplicacin teraputica, ya que constituyen
los rganos de mayor actividad qumica donde se lleva a cabo

8
la sntesis d e compuestos orgnicos as como la
fotosntesis.
El uso de plantas para tratar enfermedades es
probablemente una prctica tan antigua como la humanidad
misma. Desde tiempo inmemorial el hombre ha recurrido a las
plantas en busca de curacin para sus males y alivio a sus
dolores. Esa bsqueda lo ha hecho profundizar en el
conocimiento de las especies vegetales que poseen propiedades
medicinales y ampliar su experiencia en el uso de los
productos que de ellos se extraen. Casi la mitad de los
medicamentos que se prescriben actualmente proceden del reino
vegetal.
Dentro de este rubro es interesante destacar,
el empleo de los extractos acuosos de Romero (Rosmarinus
officinalis), ya que desde la prehistoria el hombre utiliz
sus infusiones y sahumerios como curativos de varias
afecciones. Mucho ms prcticos, Galeno y Dioscrides lo
recetaban en las enfermedades del hgado y del estmago; tras
ellos, los rabes lo usaron abundantemente, y descubrieron
la manera de extraer su aceite esencial por destilacin.

DESCRIPCION BOTANICA DEL Rosmarinus officinalis

La planta Rosmarinus officinalis (Romero,

hierba de las coronas, romeo, rosamarina, rosemary,
bedollito, rosmariny), o Romero como se conoce ms
comnmente, es originaria de la regin mediterrnea de

9
Europa, de donde fue importada y actualmente se cultiva en
diversos lugares de la Repblica Mexicana. Se produce en
regiones soleadas con clima templado (37).

1. CARACTERES TAXONOMICOS

Todas las plantas poseen centenares de

caracteres de naturaleza morfolgica, serolgica, qumica y
gentica, que son potencialmente utilizables para elaborar
una clasificacin del reino vegetal. El Romero por su parte
se clasifica dentro del REINO: Vegetal, en el ORDEN:
Tubiflorae, y pertenece a la FAMILIA: Labiatae, del GENERO:
Rosmarinus, y ESPECIE: officinalis (38).
El Romero es un arbusto perenne con hojas de
unos 3.5 cm de longitud y 2-4 mm de anchura, rgidas,
opuestas, ssiles, con los bordes doblados, de color verde
oscuro por el haz y plateado por el envs, Y de aspecto
lanoso. En la unin de las hojas con las ramas nacen unos
pequeos ramilletes de florecillas morado lila-azul plido,

muy aromticas, lo mismo que toda la planta. Las flores son

bisexuales de corola bilabiada, estando ordenadas en
verticilastros. El Romero posee slo 2 estambres y tallos

cuadrangulares. Las hojas y dems partes areas poseen pelos

tactores y glandulosos que segregan la esencia (Figura 1).

10
 ROMERO
Rosmarinus officinalis
(Lobiadas)

NOMBRES POPULARES
HIERBA DE LAS CORONAS
ROMEO
ROSMARINO
ROSEMARY
ROSA MARINA
BEDOLLITO
ROMERO

FIGURA 1. Rosmarinus officinalis.

2. PROPIEDADES DESCRITAS EMPIRICAMENTE

El Romero es muy utilizado en Europa. En los

paises de Espaa, Francia y Yugoslavia, se cultiva con el fin
de obtener el aceite esencial; el cual es utilizado en la
industria de los alimentos y en la aromatizacin de
productos de limpieza (39). Tambin se encontr que tiene
propiedades medicinales, tanto de uso externo como de uso
interno.
En literatura cientfica (popular) se ha
reportado que las decocciones de esta planta, (sin ser una
panacea como se ha pretendido tantas veces), poseen muchas
virtudes, y tienen aplicacin en el tratamiento de multitud
de enfermedades. Se ha descrito que el Romero es un
estimulante. En apenas unos dias, se mejoran agotados,
depresivos y neurastnicos. Posee notables propiedades
antirreumticas, acta contra la gota, combate los clculos
de la vejiga, la nefritis y la retencin de orina. Se
recomienda en la tos, la tosferina, el asma, palpitaciones,
nerviosismo, angustia, insomnio y jaquecas de origen
nervioso. Es un buen digestivo, antiespasmdico, colagogo
(estimula la secrecin de bilis) y ayuda al hgado en sus
funciones, es vermfugo y emenagogo. Reduce la ictericia y
las fiebres en general (40). En forma tpica se utiliza para
curaciones externas, es aconsejable empleado en baos,
fomentos, e irrigaciones en ciertos estados inflamatorios e
infecciosos (41). Las fumigaciones o sahumerios de esta
planta desinfectan y purifican el ambiente de las

12
habitaciones. Las personas que sufren de neuralgias, catarros
o dolores de cabeza, se alivian, aspirando directamente por
la nariz el humo de Romero (42).
Como puede detectarse, empricamente se han
descrito una multitud de efectos, que cientficamente an no
han sido demostrados. Esta informacin debe ser tomada con
cautela, hasta que los extractos de esta planta hallan sido
estudiados sobre modelos experimentales validados
cientficamente y que aporten respuestas sobre sus efectos.
Al respecto, en los ltimos aos se han descrito algunos
atributos sobre el Romero.

3 . PROPIEDADES DESCRITAS CIENTIFICAMENTE

En 1989, Hoefler y cols. demostraron la

actividad anti-lipoperoxidante y antihepatotxica de los
extractos de Rosmarinus officinalis sobre hepatocitos
aislados de hgado de rata (43).
Se report, en 1991 que el aceite esencial de
las hojas de Romero, inhibe la contraccin inducida por
estimulacin con acetilcolina en el msculo liso traqueal de
conejo, y la inducida por estimulacin histamnica en msculo
liso traqueal de cobayo. Por otro lado similares
contracciones fueron inhibidas en soluciones libres de
calcio. Adems las contracciones de msculo liso traqueal de
cobayo y de conejo, inducidas por soluciones de potasio
hipertnicas, tambin son inhibidas por el aceite esencial
del Romero (44).

13
 En 1992, otros autores informaron el efecto de
la ingestin de los extractos de R. officinalis en rata,
describiendo que la suplementacin de un extracto al 1%,
resulta en una disminucin del 47% de la incidencia de tumor
mamario inducido por dimetil bencn-antraceno (DMBA)
comparado con el control (45).
Tambin se ha reportado el aislamiento de
varios de los constituyentes de los extractos
hidroalcohlicos y acuosos, entre los cuales se encuentran
compuestos que pueden ejercer efecto antioxidante (46-53).
Dicha accin ha sido demostrada ms recientemente por otros
investigadores (54-56).
Entre otros datos reportados, a los extractos
de Romero, se le atribuye un efecto bactericida; el cual
inhibe el crecimiento de 21 microorganismos Gramm (+), 9 de
los cuales son enteropatgenos (57).

14
 JUSTIFICACION

La cirrosis heptica es una enfermedad con una

alta incidencia de mortalidad en la poblacin productiva del
mundo. Una vez establecido el padecimiento difcilmente
pueden funcionar los escasos tratamientos existentes, ya que,
en la mayoria de los casos se ha enfocado al manejo
sintomtico de la enfermedad.
Actualmente se estan utilizando los extractos
de algunas plantas en la teraputica de varias enfermedades
del hgado entre estas decocciones se encuentra el Romero,
ya que desde la prehistoria el hombre lo utiliz como
curativo de varias afecciones.
Puesto que es una preocupacin encontrar
tratamientos adecuados para mejorar o idealmente revertir
la cirrosis heptica, en este trabajo estudiamos el efecto
farmacolgico del extracto acuoso total de Romero (Rosmarinus
officinalis) en un modelo de cirrosis heptica experimental,
con la finalidad de conocer si alguno de sus componentes
participa en la mejoria o proteccin del dao en cirrosis.
Lo anterior con el objeto de obtener una alternativa
farmacolgica para el tratamiento de esta enfermedad.
Para realizar nuestro estudio, planteamos la
siguiente hiptesis de trabajo:

15
 HIPOTESIS

Los extractos acuosos totales de Romero

(Rosmarinus officinalis), modifican favorablemente el curso
de la cirrosis heptica.

Para poder dar respuesta a nuestra hiptesis,

nos propusimos los objetivos que a continuacin se enuncian:

OBJETIVOS

Estudiar el efecto de los extractos totales de

Romero, sobre algunos indicadores de funcin heptica en un
modelo de cirrosis experimental.

l.l.- Conocer el efecto del Romero en el modelo de

cirrosis, administrando preventivamente el
tratamiento.

1.2.- Estudiar el efecto del Romero sobre la cirrosis

experimental, a partir de que ya est establecido
el dao.

16
 DISEO EXPERIMENTAL

Este trabajo se desarroll bajo un diseo

experimental en el que se evidenci la participacin de los
extractos totales de Romero (Rosmarinus officinalis) sobre el
proceso de la cirrosis heptica experimental.
El Romero, para ser utilizado en la eraputica de
la cirrosis experimental, se prepar como extracto total
acuoso, de la siguiente manera: se realiz una decoccin de
50 gramos de hojas de Romero por cada litro de agua
destilada. Una vez obtenido el extracto, se filtra para
eliminar las hojas y se dosifica en el agua de beber, de los
animales., continuamente, en una proporcin (hojas:agua) de 8
mg/ml por dia. (figura 2).
La proporcin utilizada del Romero en el agua de
beber de los animales, fu determinada a partir de estudios
preliminares dosis-respuesta.
La cirrosis heptica experimental, se induce en un
minimo de ocho semanas de administracin del tetracloruro de
carbono (CC14) disuelto en aceite mineral, segn lo descrito
por Ehrinpreis y col. (58).
En este modelo experimental se utilizaron ratas
Wistar con un peso inicial entre 50 y 100 g, las cuales se
dividieron en 5 grupos de tratamiento, durante un perodo
total de 14 semanas. Los animales se mantuvieron en

17
OBTENCION DE EXTRACTO TOTAL DE ROMERO

HOJAS : AGUA A

8mg: rnl 250 mg/da

?;

ROMERO
condiciones apropiadas de bioterio, con ciclos luz-obscuridad
de 12-12 horas, temperatura ambiente adecuada, as como agua
Y alimentacin ad libitum consistente en Nutricubos Purina
(Purina Mxico, S.A.). Los animales en experimentacin se
agruparon como sigue:

GRUPO 1. Control de vehculo (C). Se les administr aceite

mineral en un volumen de 0.15 ml, por va I.P., tres veces
por semana.
GRUPO 2. Cirrosis heptica experimental (CC14). Se
administr CC14 en dosis de 0.4 g/Kg de peso corporal, 3
veces por semana, va I.P.
GRUPO 3. Modelo de reversin de cirrosis con Romero (CC14).
A estos animales se les administr CC14 en el mismo esquema
que el grupo 2, pero a partir de la novena semana, se empez
a administrar el extracto acuoso total de Romero en el agua
de beber, en una proporcin de 8 mg/ml, y sin dejar de
administrar el CC14.
GRUPO 4. Modelo de prevencin de la cirrosis con Romero (R-
CC14). En este grupo se inici la terapia con Romero en el
agua de beber (en la misma proporcin que para el grupo 3), a
la vez que se administraba el CC14 (igual esquema que en el
grupo 2).
GRUPO 5. Control de Romero (R). Formado por ratas sanas que
recibieron el extracto acuoso total de Romero en la misma
proporcin que los grupos 3 y 4.

19
 Para todos los grupos de animales que se les
administr CC14, se adecu la dosis al crecimiento de la
rata, segun el siguiente esquema:
Ira. semana.- 0.15 ml de solucin CC14:Aceite mineral 1:7

(v/v) .
2da. semana.- O.15 ml de solucin CC14:Aceite mineral 1:6

3ra. semana.- 0.15 ml de solucin CC14:Aceite mineral 1:5

(v / v) 1
4ta. semana.- 0.15 ml de solucin CC14:Aceite mineral 1:4
(v/v)l
5ta. semana y las siguientes, se continu la administracin
con la solucin 1:4 (v/v) con un volumen igual, de 0.15 ml.

Despus de 14 semanas de administracin, se

procedi a anestesiar a los animales (en atmsfera de ter),
para realizar una exsanguinacin inicial (la sangre se
utiliz para la medicin de algunos parmetros como se indica
adelante) y posteriormente una perfusin heptica. Se
obtuvieron muestras de higado y musculo para medir diversos
indicadores, que nos sirvieron para evaluar la progresin del
dao, y en algunos casos, la mejoria por la terapia empleada.
De la sangre total se separ el suero para medir la actividad
enzimtica de transaminasa glutmico oxalactica (TGO)
transaminasa glutmico pirvica (TGP) y gamma- glutamil
transpeptidasa (GGTP) as como la concentracin de
bilirrubinas, proteinas totales y albmina La sangre total
se desproteiniz para cuantificar lactato.

20
 Con una parte del hgado se determin glucgeno
heptico Y la concentracin de ADN (cido
desoxirribonuclico). Adems una pequea fraccin del mismo,
se utiliz para las tcnicas histolgicas y la cuantificacin
de colgena. Con el resto del hgado se obtuvo la fraccin
microsomal heptica, en donde se midi la actividad
enzimtica de la hidrolasa de aspirina. Esto ltimo con la
finalidad de medir, mediante algn indicador, la capacidad de
biotransformacin del rgano.
Tambin se determin la concentracin de glucgeno
muscular, para establecer su relacin en cuanto a la
concentracin de glucgeno heptico.
Los datos obtenidos de cada uno de los indicadores
de dao heptico medidos en los diferentes grupos
experimentales, se sometieron a un anlisis de varianza
(ANOVA) para un diseo experimental completamente al azar.
As mismo, posterior al ANOVA, se realiz la
prueba de comparaciones mltiples de medias, propuesta por
Tukey, tambin denominada prueba de Diferencia Minina
Significativa Honesta (DMSH), con el fin de detectar entre
cuales grupos se ubican las diferencias (59).

21
 FUNDAMENTOS, MATERIAL Y METODOS

La patognesis y el diagnstico clnico de las

hepatopatias se ha facilitado durante las ltimas dcadas,
gracias a la medicin de pruebas funcionales hepticas
especficas, y sobre todo, a la utilizacin de la biopsia
heptica.
Dentro del gran nmero de pruebas funcionales
hepticas descritas, escogimos aquellas que pudieran
indicarnos una diferencia importante en la mejora de la
cirrosis, durante el transcurso de la terapia con Romero.
Esto es, utilizamos pruebas indirectas de regeneracin
heptica (cuantificacin de ADN [cido desoxirribonuclico]);
pruebas directas de funcin, tales como metablicas,
enzimticas y de biotransformacin. Y adems incluimos un
estudio histolgico del hgado

1. PRUEBA DE REPLICACION CELULAR: MEDICION DE ADN

Durante la cirrosis, la lesin heptica reduce el

nmero de clulas funcionales (por necrosis, fibrosis, etc),

por lo que es indispensable que el hgado recupere su

capacidad funcional al regenerar nuevas clulas. Una de las
maneras indirectas de conocer si existe regeneracin en un
rgano, es medir la capacidad de replicacin del ADN. Si la

22
concentracin de este parmetro incrementa su valor,
sugeriria una replicacin celular.

a) Fundamento del mtodo empleado.

El mtodo descrito por Gendemenico (60) se basa en
la determinacin espectrofotomtrica del cromforo producido
por la reaccin de hidrlisis cida del ADN con la
difenilamina, en presencia de cido sulftrico, cido actico
y acetaldehido. La lectura de la muestra problema se efectta
a 600 nm, y la concentracin se reporta en ug de ADN/ gr de
hgado.

b) Tcnica de medicin.
Se anestesi la rata en atmsfera de ter, y se
realiz diseccin de la cavidad abdominal para obtener un
gramo de hgado el cual se homogeniz (Wheaton Instruments
Overhead Stirrer) en cido perclrico (HC104) 0.5 N (este
procedimiento se realiz a 4OC). El homogenado se centrifug
a 900xg y el precipitado obtenido se resuspendi en HC104
0.5 N, para ser hidrolizado a ebullicin durante 30 minutos,
y as extraer el ADN.
Despus de la hidrlisis, se recentrifug a la
misma velocidad, Y en el sobrenadante (extracto) se
cuantific el ADN hacindolo reaccionar con una solucin de
difenilamina al 0.2% en cido actico, con cido sulfrico.
Se incub a 50C durante 3 horas. Al trmino de la

23
incubacin se ley la absorbancia contra blanco de reactivos
a 600nm en espectrofotmetro (Spectrophotometer Perkin Elmer
Junior Model 35). Las concentraciones se obtuvieron
interpolando las lecturas de absorbancia en la curva de
calibracin respectiva o utilizando el valor del patrn.

2. PRUEBAS METABOLICAS.

A. CUANTIFICACION DE GLUCOGENO HEPATICO Y MUSCULAR.

El hgado es un importante sitio para el

almacenamiento de glucgeno, cuyo catabolismo es regulado por
varias hormonas. Puesto que el glucgeno es un polmero
ramificado de la glucosa, su degradacin propicia
hiperglucemia, adems de originar una deficiencia de este
depsito en el hgado
En la cirrosis heptica, como se ha comentado
previamente, existen una variedad de estimulos que pueden
modificar la cantidad de glucgeno en hgado misma que
parece no ser alterada en el msculo Lo anterior como
consecuencia de los cambios metablicos y hormonales
presentes. Por esta razn, la medicin de los niveles de
glucgeno son un buen indicador de los estimulos que recibe
el hgado durante esta patologia.

24
a) Fundamento del mtodo
Esta determinacin se basa en hidrolizar el
glucgeno en unidades de glucosa que se cuantifica hacindola
reaccionar con antrona en cido sulfrico (61), formando un
complejo de color, cuya lectura a 620 nm es proporcional a la
concentracin. Los resultados se expresan en g/lOO g de
hgado.

b) Tcnica de medicin.
Se extrajo un gramo de tejido (hgado y/o msculo
esqueltico), y se hidroliz con hidrxido de potasio al 30
% durante 30 minutos. El hidrolizado se diluy en agua
destilada (1:500) y posteriormente se hizo reaccionar con
antrona (0.2 % en cido sulfrico) a temperatura de
ebullicin. Despus de enfriar, se leyeron las absorbancias a
620 nm, contra blanco de reactivos, Las concentraciones se
calcularon utilizando el valor de un patrn de glucosa.

B. MEDICION DE LACTATO SANGUINEO.

La medicin de este cido orgnico es de gran

importancia metablica. Se sabe que, en el hgado, al
estimular la adenilato ciclasa, y por ende incrementar los
niveles de AMPc, despus de diversas rutas metablicas,
finalmente aumenta el lactato sanguneo. En la cirrosis
heptica, preferentemente la de origen alcohlico,

25
incrementan los valores de este metabolito, siendo un
indicador importante para el estudio de las teraputicas a
emplear.

a) Fundamento del mtodo.

El contenido de lactato en sangre total se
estabiliza por precipitacin inmediata de las proteinas y a
baja temperatura. El lactato se transforma en piruvato por la
enzima lactato deshidrogenasa, en presencia de un exceso de
NAD. La concentracin se obtiene en forma indirecta midiendo
la cantidad de NADH formado, p por espectrofotometra
ultravioleta (W). Los valores se reportan en mg/dL.

b) Tcnica de medicin.
La determinacin se realiz, al desproteinizar una
muestra de sangre total con cido perclrico helado al 8 %.
En el mtodo espectrofotomtrico descrito por Marbach en
1967 (62), se midi la produccin de NADH, a partir de NAD,
cuando se combina un volumen del desproteinizado con la
mezcla de reaccin, la cual contiene: buffer glicina (0.6 M),
hidrazina (0.5 M), NAD (10 mg), agua destilada y lactato
deshidrogenasa (1000 U/mL) a pH 9.2. Despus de incubar 30
minutos a 37 OC, se ley el incremento en absorbancia a 340
nm debido a NADH formado, el cual fu proporcional a la
cantidad de lactato presente en la muestra, que se expres en
mg/dL.

26
C. CUANTIFICACION DE BILIRRUBINA TOTAL.

La mayor parte de la bilirrubina en el organismo

se forma en los tejidos por degradacin de la hemoglobina. La
bilirrubina est unida a la albumina en la circulacin, pero
la mayor parte puede disociarse en el hgado, y la
bilirrubina libre entra a las clulas hepticas donde se une
a protenas citopltico Luego se conjuga con cido
.glucurnico en una reaccin catalizada por la enz ima
glucuroniltransferasa. Este glucurnido, ms hidrosoluble que
la bilirrubina libre, es transportado contra un gradiente de
concentracin por un posible proceso activo dentro de los
canalculos biliares. Una pequea cantidad del glucurnido
escapa a la sangre, donde se une menos fuertemente a la
albmina que la bilirrubina libre, y se excreta en la orina.
Por tanto, la bilirrubina plasmtica total normalmente
incluye bilirrubina libre ms una pequea cantidad de
bilirrubina conjugada.
Cuando la bilirrubina libre o conjugada se acumula
en la sangre, la piel, las esclerticas y las mucosas se
tornan amarillas. Este cambio de coloracin se conoce como
ictericia, que puede presentarse en diversos trastornos
hepticos

a) Fundamento del mtodo.

La bilirrubina total en suero o plasma se
determin segn Meites (63), cuyo mtodo es una variacin del

27
procedimiento de Malloy-Evelin, por copulacin con cido
sulfanlico diazotado tras la adicin, en solucin cida, de
metanol, el cual acelera dicho acople. La azobilirrubina
purpura es medida por espectrofotometra a 560 nm,
reportndose los valores en umol/L.

b) Tcnica de medicin.
El suero se diluy en agua destilada y metanol,
adicionando enseguida el diazorreactivo al 3 % (cido
sulfanilico 26.2 mmol/L y nitrito de sodio 0.235 mmol/L), y
se dej proseguir la reaccin por 10 minutos. Se leyeron las
absorbancias a 560 nm contra blanco de reactivos. La
concentracin se calcul con los datos obtenidos de un suero
patrn.

D. METODO PARA LA DETERMINACION DE PROTEINAS TOTALES Y

ALBUMINA.
Adems de producir la enorme variedad de enzimas y
dems proteinas que necesitan sus propias clulas, el higado
sintetiza muchas proteinas "para exportacin". Produce casi
todos 1OS factores de coagulacin y tambin prcticamente
todas las protenas plasmticas. La sntesis de albmina se
efectta en el retculo endoplsmico granular. Cuando existe
alteracin de la funcin heptica, generalmente se modifica
la sntesis de albumina.

28
 El estudio de las proteinas sricas totales da una
informacin clnica bastante pobre, pues muchas enfermedades
se manifiestan por una modificacin de las proporciones
relativas de los dos grupos principales, la denominada
relacin albumina/ globulina o relacin A/G.
..

a) Fundamento del mtodo.

Las protenas y sus pptidos a diferencia de otros
compuestos nitrogenados, forman, en solucin alcalina con
iones cobre, un complejo qumico de color violeta. Esta
reaccin denominada de Biuret obtiene resultados
reproducibles que coinciden con el mtodo de Kjeldahl.
La albmina del suero, cuando est en amortiguador

Y pH adecuados, tiene la propiedad de unirse a travs de

puentes de hidrgeno y fuerzas de Van-Der-Walss a ciertos
colorantes e indicadores como el verde de bromocresol,
formando complejos coloridos cuya intensidad es proporcional
a la concentracin de este medio biolgico. Los resultados se
expresan en g/dl.

b) Tcnica de medicin.
Para cuantificar proteinas totales (64),
pipetearnos en un tubo de ensayo: reactivo de Biuret
(tartrato de sodio y potasio 18 mmol/L, iodato de potasio 10
mmol/L, sulfato de cobre 12 mmol/L, hidrxido de sodio 200
mmol/L), y el suero problema, mezclando e incubando a 37 OC,
durante 15 minutos. Se midieron las extinciones contra blanco

29
de reactivos a 545 nm. Las concentraciones se calcularon,
utilizando el valor del patrn.
La medicin de albmina (65) se realiz haciendo
reaccionar el suero problema con el reactivo de color (cido
lctico 806 mmol/L, verde de bromocresol 1.44 mmol/L,
hidrxido de sodio 5 mol/L, y Tween 20 en un volumen de 20
mV4 , se mezcl suavemente y se dej en reposo a temperatura
ambiente durante 15 minutos. Las extinciones de las muestras
contra blanco de reactivos se leyeron en espectrofotmetro a
630 nm (Spectrophotometer Perkin Elmer Junior Model 35).

3. MEDICION DE ACTIVIDAD ENZIMATICA.

A. ACTIVIDAD DE GAMMA-GLUTAMILTPANSPEPTIDASA (GGTP).

Los aminocidos pueden ser transportados, a, travs

de algunas membranas, por transposicin de grupo en el ciclo
del gamma glutamilo. En esta accin, la GGTP, que est ligada
a la membrana plasmtica, juega un papel clave. Cataliza la
reaccin de transferencia de un residuo glutamilo del
glutatin, al aminocido (aa) que entra, como lo indica la
reaccin siguiente:

GGTP
aa + glutatin e =======- gamma glutamil-aa + cisteinglicina

a) Fundamento del mtodo.

La medicin de la enzima se realiza en medio
alcalino y en presencia de magnesio y glicil-glicina,

30
liberndose p-nitroanilida a partir del sustrato utilizado,
la cual es medida espectrofotomtricamente a 410 mm,
comparando las lecturas obtenidas de las muestras problema
contra una curva de calibracin para tener la actividad en
umol/L/h, segn el mtodo descrito por Szasz (66).

b) Tcnica de medicin.
El suero se adicion a un tubo de ensayo, que
contena las siguientes soluciones: Tris-HC1 (200 mM), MgCl
(200 m) adems de glicil glicina (40 mM) y una solucin de
gamma- glutamil p-nitroanilida (lOmM), todo a un pH de 8.2.
Se incub a 37 OC durante 30 minutos, al trmino de los
cuales se adicion c i d o actico 1.5 M para detener la
reaccin. Las muestras se leyeron en un espectroftometro a
410 nm contra blanco de reactivos, la actividad se calcul
interpolando las lecturas de absorbancia en la curva de
calibracin respectiva.

B. TRANSAMINASAS.

Las enzimas con actividad transaminasa se

encuentran localizadas en las mitocondrias y en el citosol de
las clulas eucariticas. Estas enzimas catalizan la
transferencia de un grupo amino de un alfa aminocido a un
alfa cetocido. En enzimologia clnica, son importantes dos
de estas enzimas, la transaminasa glutmico pirvica (TGP) o
amino transferasa' de alanina (ALAT), y la transaminasa

31
glutmico oxalactica (TGO) o amino transferasa de aspartato
(ASAT).
La TGP, en orden decreciente de concentracin, se
encuentra en los siguientes rganos: hgado, rin, corazn,
mfisculo estriado y pncreas. Los niveles sricos de TGP se
manifiestan considerablemente elevados en las lesiones agudas
del hepatocito. En algunos casos el aumento es mayor que el
de la TGO, lo que di lugar a la idea de que las mediciones
de TGP eran ms especficas para corroborar el diagnstico
de alteraciones agudas del hgado que las mediciones de TGO.
Sin embargo la experiencia no confirma esta opinin.
Los origenes tisulares de la TGO son: corazn,
hgado, msculo estriado, rin y pncreas Los cifras
sricas de la TGO aumentan considerablemente en lesiones
agudas tanto del corazn como del hepatocito. En las lesiones
hepticas agudas, se observan cifras mayores a 1200
unidades/mL, existiendo slo un aumento moderado en las
ltimas etapas de la cirrosis.

a) Fundamento del mtodo.

La TGP, cataliza la transferencia del grupo amino
del glutamato al piruvato segn la siguiente reaccin:

TGP
glutamato + piruvato -=======-H alfa-cetoglutarato + alanina

La TGO, cataliza la transferencia del grupo amino

del glutamato al oxalacetato segn la siguiente reaccin:

32
 TGO
glutamato+oxalacetato -=====- alfa-cetoglutarato+aspartato

La medicin de la actividad enzimtica se realiz

segdn Reitman y Frankel (67), dejando actuar el suero
problema en solucin amortiguada de cetoglutarato y alanina
(midiendo la cantidad producida de piruvato) para la TGP y
sobre solucin amortiguada de cetoglutarato y aspartato
(midiendo la cantidad producida de oxalacetato) para la TGO.
En ambos casos, el producto de reaccin se determin
fotomtricamente en forma de 2,4-dinitrofenilhidrazona, en
solucin alcalina. Las absorbancias ledas a 546 nm se
interpolaron en una curva de calibracin obtenindose los
valores de actividad en mU/mL.

b) Tcnica de medicin.
Para TGP.- Pipetear en tubos de ensayo: solucin
amortiguada de sustrato (amortiguador de fosfatos 100 mmol/L,
DL-alanina 200 mmoljl, alfa cetoglutarato 2 mmol/L). Para
TGO.- Solucin amortiguada de sustrato (amortiguador de
fosfatos 100 mmol/L, L-aspartato 100 mmol/L, alfa
cetoglutarato 2 mmol/L).
En ambos tubos se agreg suero problema, se mezcl
e incub a 37 C durante 30 minutos, al trmino de los
cuales, se adicion el reactivo de coloracin (2,4-
dinitrofenilhidrazina 1.5 mmol/L), se mezcl y dej en reposo

por 20 minutos m6s. Despus se alcaliniz con hidrxido de

sodio 0.4 N. La absorbancia se ley a 546 nm, y la

33
actividad se calcul, interpolando las lecturas en una curva
de calibracin.

4 . ACTIVIDAD BIOTRANSFORMANTE HEPATICA: Medicin de actividad

de biotransformacin de la Hidrolasa de Aspirina en
fraccin microsomal.

La actividad biotransformante es una

caracterstica funcional del hgado, que se lleva a cabo
tanto para substancias endgenas como para frmacos, txicos,
etc. En el caso de los frmacos, este proceso se realiza para
modificar su estructura qumica, propiciando cambios en su
accin farmacolgica (activacin o inactivacin del mismo).
Esta actividad de biotransformacin se efecta principalmente
en el sistema retculo endoplsmico de los hepatocitos, que
contiene los complejos enzimticos capaces de generar la
funcin comentada. Dicho sitio es conocido comnmente como
fraccin microsomal. Un dao en la integridad funcional del
hfgado puede modificar substancialmente este proceso.
Con la finalidad de tener un indicador de
alteracin del proceso de biotransformacin, se eligi la
medicin de la hidrlisis de aspirina. La biotransformacin
del cido acetilsaliclico (AAS) aspirina, se inicia con
una reaccin de hidrlisis, produciendo cido saliclico y
acetato. Esta reaccin es catalizada por enzimas presentes en
varios rganos y tejidos de los mamferos y que se conocen
como carboxiesterasas/amidasas (CE/A). Dentro de este grupo

34
se clasifica la hidrolasa de aspirina, que se localiza
principalmente en la fraccin microsomal heptica.

A. OBTENCION DE LA FRACCION MICROSOMAL HEPATICA.

Despus de anestesiar la rata, se abri la cavidad

abdominal y se disec el hgado perfundindolo con solucin
fisiolgica helada (NaCl 0.85 %), mediante una bomba de
perfusin (Syringe Pump model 341 A, Sage Instruments),
conectada a un catter que se insert en la vena porta. La
velocidad de perfusin fu de 4.1 mL/min, y en el momento de
iniciarla se cort la vena cava inferior y la supraheptica.
Posteriormente se extrajo el hgado se cort en trozos
pequeos y se homogeniz (Overhead Stirrer Wheaton
Instruments) en solucin buffer de fosfato de potasio (0.05

M) l El homogenado se centrifug a 800 x g para separar y

desechar la fraccin nuclear. El sobrenadante se recentrifug
a 8000 x g, obtenindose la fraccin mitocondrial, que
tambin se descart. Al sobrenadante que se obtuvo de esta
fraccin, se le agreg cloruro de calcio (CaC12) 0.8 M hasta
obtener una concentracin 0.008 M de CaC12. En seguida se
centrifug a 3600 x g para obtener la fraccin microsomal en
la pastilla. La fraccin microsomal as obtenida, se
resuspendi en solucin buffer de fosfatos (0.05 M pH=7.4)
despus de ser lavada. Las centrifugaciones se realizaron en
una centrifuga semiultra (Damon/IEC DIVISION IEC HT
Centrifuge International Equipment Company). Todas las
manipulaciones se efectuaron a 4 C

35
 La fraccin resuspendida se utiliz como material
enzimtico en la medicin de la actividad de la hidrolasa de
aspirina.

B. MEDICIN DE LA ACTIVIDAD DE HIDROLASA DE ASPIRINA.

a) Fundamento del mtodo.

El mtodo para medir la actividad de
biotransformacin de la hidrolasa de aspirina (68), se basa
en la adicin de cido acetilsalicilico a la fraccin
microsmica obtenida del tejido heptico, y leyendo
espectrofotomtricamente a 300 nm, para la deteccin de cido
saliclico (AS) formado. La actividad se calcula en funcin
de la concentracin de AS por mg de proteina microsomal
presente en la mezcla de reaccin, por unidad de tiempo de
incubacin (umol de AS/mg protena/hora).

b) Tcnica de medicin.
Se adicion en tubos de ensayo: solucin buffer de
fosfatos (0.05 M, pH=7.4), cido acetilsaliclico (0.2 M),
fraccin microsmica y se incub a 37 C durante 10 minutos,
al trmino de los cuales se adicion cido tricloroactico
helado al 20 % y se centrifug a 900 x g (Centrifuga
Sol-Bat Mod. J-12).
El sobrenadante obtenido se ley a 300 nm en un
espectrofotmetro UV (Beckman DU-65 Spectrophotometer) contra
blanco de reactivos. La actividad obtenida se report en umol
de AS/mg proteina/h.

36
5. ASPECTOS MORFOLOGICOS DEL HIGADO.

Desde el punto de vista histolgico, la unidad

estructural del hgado es el lobulillo, de forma
aproximadamente pentagonal 0 hexagonal en un corte
transversal. En el centro del mismo se encuentra la vena
central, va de salida de la sangre , que desemboca en las
venas suprahepticas; a su vez, stas se abren a la vena cava
inferior en la cara posteroinferior del hgado cerca de la
linea media. Desde la vena central, se extienden radialmente
cordones o placas de clulas hepticas, hasta la periferia
del lobulillo. Dichas placas estn separadas por sinusoides
sanguineos dispuestos radialmente. A nivel de la periferia
del lobulillo se encuentran cinco o seis espacios portas 0
"tradas" cuyo nombre se le da, porque en cada uno se
encuentra una rama de la vena porta, una rama de la arteria
heptica y un conductillo biliar, que son las tres
estructuras principales de este espacio. En ese mismo sitio,
tambin se encuentran nervios y vasos linfticos.
Junto con los antecedentes clnicos Y de
laboratorio descritos hasta ahora, las biopsias de hgado son
fundamentales para conocer cambios estructurales durante la
cirrosis, y en respuesta a la teraputica.

a) Descripcin de la tcnica empleada.

Despus de la remocin del hgado, pequeas
porciones de sus lbulos fuern inmediatamente fijados con

37
formaldefdo y embebidos en parafina, para posteriormente ser
cortados y teidos con hematoxilina-eosina, as como tincin
tricrmica de Masson (69).
La tincin del corte permite estudiar y conocer
las caracteristicas estructurales de los tejidos y las
relaciones entre las clulas que los constituyen. La utilidad
del mtodo se debe a que los distintos componentes de la
clula, muestran afinidades diferentes para casi todos los
colorantes.

6 . CUANTIFICACION DE COLAGENA HEPATICA.

Con la finalidad de proveer datos

semicuantitativos acerca de la cantidad de fibrosis presente,
y para correlacionar con los aspectos cualitativos descritos
histolgicamente, se realiz la medicin de colgena en
cortes de hgado
El grado de fibrosis de un tejido puede expresarse
como la cantidad de colgena presente en el mismo, que fu
medido por un micromtodo descrito por Lpez de Len y
Rojkind (70), que se basa en la capacidad selectiva de los
colorantes rojo sirio y verde rpido para unirse a la
colgena y a las protenas no colagnicas respectivamente. La
cuantificacin se realiza por espectrofotometra despus de
eluir los colorantes unidos a cortes de tejido. La
concentracin se expresa en ug de colgena/mg de proteina.

38
b)Tcnica de medicin.

Despus de disecar el hgado, pequeas porciones

de sus Lbulos fueron inmediatamente fijados con
formaldehdo al 10 % y embebidos en parafina. Posterior a
esto se obtuvieron cortes, de 15 mm de espesor, los cuales
fueron desparafinados y teidos con solucin de Rojo sirio
(35 mg/ml + Verde rpido (0.4 mg/mL) en cido pcrico,
durante 30 minutos con agitacin constante, a temperatura
ambiente. Enseguida, los cortes se lavaron con agua
destilada. Una vez libres del exceso de colorante, se
colocaron en solucin de NaOH:Metanol (1:l v/v), y se ley la
absorbancia a 540 nm para rojo sirio y 620 nm para el verde
rpido en un espectrofotmetro (Spectrophotometer Perkin
Elmer Junior Model 35). La concentracin se expresa en ug de
colgena/mg de proteina.

39
 RESULTADOS

Para evaluar el efecto de los extractos acuosos

totales del Romero (Rosmarinus officinalis), como teraputica
en la cirrosis, diseamos un esquema de administracin en el
cual probamos el efecto, tanto en una condicin en la que ya
se habia establecido el proceso patolgico, as como, desde
el inicio de dicho dao crnico. En la seccin del diseo
experimental se indic que con el fin de tener la evidencia
del efecto del Romero, descartando otros factores, se
utilizaron adems: un grupo de animales sanos que slo
recibieron el vehculo, otro ms de animales a los que se
propici la cirrosis y un ltimo al que slo se le administr
el Romero, en este caso para evaluar la participacin del
extracto sobre la funcin heptica.
Los resultados obtenidos despus de medir y
cuantificar todos los parmetros utilizados como indicadores
de la funcionalidad heptica se describen a continuacin.
Como se coment anteriormente, el diseo
experimental estaba formado por 5 grupos de administracin,
como se ilustra en el cuadro 3. Las abreviaturas utilizadas
en' el mismo, sern empleadas en lo subsiguiente para todos
los resultados. El modelo de reversin corresponde a los
animales que recibieron el agente etiolgico (CC14) y que a
partir de la semana 9 empezaron a recibir el extracto de

40
 DISEO EXPERIMENTAL
Ctrl ]J
CC 14 1
CCl4+R 1 I 1 I
R- CCl4

0 0 14

TIEMPO (SEMANAS)

CUADRO 3. Esquema de administracin y tratamiento. Ctrl = C

= control, CC14 = grupo de ratas cirrticas, CC14 + R
= cirrticas con tratamiento a partir de la semana 9
modelo de reversin), R-CC14 =animales que
recibieron desde el inicio CC14 y los extractos de
Romero (modelo de prevencin), y R = grupo de ratas
que ~610 recibio Romero.
Romero, a la vez que se les continuaba con la administracin
del cc14. El trmino reversin lo utilizamos, con la
finalidad de establecer la diferencia encontrada (en los
indicadores de dao, medidos) entre el estado cirrtico,
cuando la lesin ya est establecida, Y los cambios
observados al implementar la teraputica con Romero.
El modelo de prevencin se estableci esperando
que los extractos del Romero presentaran un efecto
"profilctico" preventivo del dao, originado por el agente
etiolgico (medido en funcin de los indicadores utilizados).
A las ratas de este modelo se les administr desde el inicio
CC14 conjuntamente con el extracto acuoso de R. officinalis.

1. INDICADOR DE REPLICACION CELULAR

En la cuantificacin de ADN (figura 3),

nuestros resultados mostraron que existe un incremento de
alrededor de 60 % en los niveles de este parmetro obtenido
en los hgado de las ratas cirrticas comparado contra lo
observado en animales control (641.8 2 76.8 ug/g de hgado),
diferencia que fu estadsticamente significativa (p < 0.05).
En la misma figura, tambin se puede observar

que en los grupos de ratas que recibieron tratamiento con

Romero (modelos tanto de prevencin como de reversin)
existi un incremento, todava mayor, en la concentracin de
ADN, de alrededor de 95 % comparado con los niveles obtenidos
en animales control (p < 0.05). Es importante mencionar que
en los animales cirrticos que recibieron Romero, el ADN

42
 1

ADN EN CIRROSIS

1600
T
<
l-
//
1OOO-
+

hlgado
hgado

6 00 00

I I I I
I I
I /
0
C CC14 CCl4+R
CCCI+R R-CC14 R

FIGURA 3. Cuantificacin de ADN en hgado de rata

barra,muestra el promedio +- E.S., rata
experimentos.* p < 0.05 comparado VS todos los grupos
experimentales. C = control CC14 = cirrtico CC14+R
= modelo de reversin, R-CC14 = modelo de prevencin
R=Romero.
aument en un 20 % con respecto a los cirrticos sin
tratamiento. En lo concerniente al grupo de animales que
slo recibieron Romero, tambin se obtuvo un incremento de
este parmetro (57 % comparado contra el control). Estos
resultados nos sugieren que de algn modo, la presencia del
extracto total induce la replicacin del cido
desoxirribonuclico, lo que nos hace suponer que se inicie la
replicacin celular. Este evento traera por consecuencia una
recuperacin de .funcin heptica, reestableciendo por lo
menos en parte, la importante actividad funcional del hgado.

2 . PRUEBAS METABOLICAS

En la cirrosis experimental existe una disminucin

en la concentracin de Glucgeno heptico, lo cual es
evidente al observar las diferencias entre los distintos
grupos experimentales. Nuestros resultados, mostrados en la
figura 4 presentan una reduccin en el depsito de glucgeno
del hgado de los animales cirrticos comparado contra el
grupo control, de un valor de 3.6 $: 0.33 a 1.7 0.18 g/lOO g
de hgado (p < 0.05). Adems, en las ratas cirrticas que
recibieron tratamiento con Romero se observ que la
concentracin de glucgeno que se encontraba disminuida Por
el dao del CC14, no recuper sus niveles normales, de hecho,
no existe diferencia significativa comparado contra los
valores obtenidos de animales cirrticos. En las ratas que
slo recibieron Romero, tambin se observ una disminucin en
los niveles de este parmetro. Por lo que nuestros resultados

44
 .

GLUCOGENO HEPATICO EN CIRROSIS

FIGURA 4. Glucqeno heptico, determinado en hgado de rata

La figura muestra el valor promedio E.S. obtenidos
de 24 1 experimentos. C = control, CC14 = cirrticos,
modelo de reversin, R-CC14 = modelo de
prevencin, R =| Romero. *p<0.05 comparado VS control.
sugieren que el extracto de Romero, no acta sobre los
procesos bioqumicos que participan en la recuperacin de
esta funcin metablica.

En el cuadro 4 mostramos los resultados obtenidos

para la medicin de Glucgeno muscular. Comparado contra los
valores de las ratas del grupo control, el resto de
mediciones realizadas en los animales de los distintos grupos
de administracin, no mostraron diferencias estadisticamente
significativas, por lo que, los resultados obtenidos sugieren
que 'el extracto de Romero no modifica la concentracin de
este parmetro.
La cuantificacin de glucgeno muscular se realiz
para detectar si exista algn cambio en dicha concentracin
durante el estado patolgico, adems de establecer una
relacin con la cantidad de glucgeno heptico. Este
pardmetro en los diferentes grupos experimentales, permaneci
sin variacin al comparar con el grupo control. Por esta
razn, pudimos establecer una relacin entre glucgeno
heptico y glucgeno muscular (GH/GM), misma que mostr una
evidente disminucin en los niveles de glucgeno heptico.
Esto es, se obtuvo una relacin GH/GM de 6.1 para el grupo
control y de 1.2 para los animales cirrticos.

Cuando se midi el Lactato sanguneo, los valores

medidos (figura 5) para el grupo cirrtico mostraron un
aumento de aproximadamente 35 % comparado contra los valores
control (26.6 1.3 mg/dL). En las ratas cirrticas que

46
 --__

CUADRO # 4
GLUCOGENO MUSCULAR EN CIRROSIS

GRUPO X E.S

c 1.10 .10
CC14 1.14 0.18
CC14+R 1.15 0.25
R-CC14 1.00 0.11
R 1.10 0.10

CUADRO 4. Cuantificacin de glucgeno en mtsculo esqueltico de

rata Wistar. En la tabla se muestran las concentraciones
promedio E.S., de glucgeno muscular en g/ 100 g de
m s c u l o obtenidas de 22 1 experimentos.c = control,
CC14 = cirrticos, CC14-R = modelo de reversin, R-CC14
= modelo de prevencin. R = Romero.
 LACTATO EN CIRROSIS

mgAY/

20

C CC14 CCl4+R R-CC14 R

FIGURA 5. Lactato en sangre total de rata.La grfica muestra

los valores promedio E.S.De lactato, obtenidos
de 20 cc14+R 1 experimentos. C = control, CC14 = cirrticos,
modelo dereversin, R-CC14 prevencin, R= Romero.
recibieron tratamiento con Romero se observ una recuperacin
de este valor, tenindose valores similares al control. En lo
que respecta a las ratas del modelo de prevencin, el nivel
de cido lctico (28.1 $ 2.7 mg/dL) permaneci cercano a la
concentracin normal, impidiendo su aumento. Nuestros
resultados mostraron ademas, que los extractos de Romero en
animales que slo recibieron estas decocciones, no modifican
la concentracin del lactato. A pesar de que estos valores
no son diferentes estadsticamente, los resultados promedio
muestran las variaciones mencionadas arriba. Estos datos nos
sugieren que el Romero probablemente participa en la
restauracin de los procesos metablicos de la va del
lactato, alterada en cirrosis. As mismo, sugieren una
proteccin contra dicha alteracin en los individuos que lo
recibieron desde el principio.

Cuando se midieron los niveles de bilirrubinas en

las ratas sometidas a experimentacin, se obtuvieron los
resultados mostrados en el cuadro 5. En estos datos, se puede
apreciar, que todos los animales que recibieron el
tratamiento con Romero (modelos de reversin y prevencin)
presentaron un aumento significativo (p<O.O5) en el valor de
este parmetro srico, comparado contra el control. El Romero
por si solo no modifica los niveles de bilirrubinas. Nuestros
resultados sugieren que ste no es un buen indicador para
evaluar la participacin del Romero en cirrosis.

49
 CUADRO # 5
BILIRRUBINA EN CIRROSIS

GRUPO

C 3.61 0.52

CC14 10.3 1.98

CC14+R 9.94 5.60

R-CC14 10.9 3.10

R 3.68 0.50

CUADRO 5. Determinacin de bilirrubinas en suero de ratas Wistar.

En el cuadro se muestran las concentraciones promedio
E.S., de bilirrubinas en mg/dL, realizadas en
21 1 experimentos. C = control, CC14 = cirrticos,
CClI+R = modelo de reversin, R-CC14 = modelo de
prevncin, R = Romero.
 Para medir la capacidad heptica de sintesis,
cuantificamos protenas totales y la relacin A/G. En los
resultados obtenidos para estas mediciones (cuadro 6), no se
observaron modificaciones en las concentraciones obtenidas de
los diferentes grupos experimentales, esto es, no existi
diferencia estadsticamente significativa. Por tal motivo no
se pudo obtener un patrn de comportamiento en el estado
patolgico. Comparado contra el control, los animales
cirrticos slo presentaron un incremento en la concentracin
del 7 % las ratas que slo recibieron Romero del 6 % y el
grupo de prevencin slo un 5 %. Por estos resultados podemos
sugerir que el extracto acuoso de Romero utilizado, no
contribuye a modificar importantemente este parmetro.

3 . PRUEBAS ENZIMATICAS

Los resultados obtenidos en la medicin de la

actividad srica enzimtica de la gamma glutamil-
transpeptidasa se observan en la figura 6. Esta actividad
enzimtica se encontr elevada en forma significativa durante
el estado cirrtico, de manera comparativa con la observada
en las ratas control (alrededor de 100 % de incremento). Los
valores, tanto del modelo de reversin como del grupo que
slo recibi Romero, no muestran un incremento notable en la
actividad enzimtica, por lo que comparado con el grupo
cirrtico la diferencia es estadsticamente significativa
(p<0.05) As mismo, en el suero de los animales que
recibieron el extracto de Romero desde el inicio en conjunto

51
 CUADRO # 6
PROTEINAS TOTALES EN CIRROSIS

GRUPO PT ALB GLOB A/G

gr/dl gr/dl gr/dl

C 6.8 0.15 3.7 0.06 5.1 0.10 0.7 0.03

CC14 9.5 0.33 3.5 0.12 6.0 0.25 0.59 0.02
CC14 +R 10.1 0.34 3.6 0.11 6.5 0.29 0.56 0.02
R-CC14 9.3 0.24 3.5 0.14 5.7 0.16 0.62 0.02
R 9.4 0.09 4.0 0.05 5.4 0.09 0.75 0.01.

CUADRO 6. Protenas totales y relacin A/C, en suero de rata. En

las columnas pueden apreciarse los valores promedio
E.S., obtenidos en la determinacin de protenas
totales (PT), albmina (ALB) y globulina (GLOB) en q/dL,
de 21 1 experimentos. C =control, CC14 = cirrticos
CC14+R = modelo de reversin, R-CC14 = modelo de
prevencin, R = Romero.
 ACTIVIDAD DE GAMMA QTP EN CIRROSIS

/ l-
/ /,

,---.--
_- T -

umol/L /h

60 c

.L

FIGURA 6. Actividad de GGTP en suero de ratas Wistar. Las barras

nos muestran los valores promedio f E.S. de la actividad
enzimtica, obtenidos de 21 1 experimentos. * p < 0.05
comparado VS GRUPO de CC14. C = control, CC14 =
cirrticos, CC14+R = modelo de reversin, R-CC14 = modelo
de prevencin, R = Romero.
con CC14, se observo una pequea disminucin de la actividad
alterada con respecto a la obtenida en la cirrosis. Estos
ltimos datos no sugieren una prevencin idnea para indicar
que el Romero evita la modificacin sobre la actividad de
esta enzima durante el tiempo de administracin del txico.

La actividad enzimtica de la transaminasa

glutmico pirtvica (TGP), se muestra en la figura 7. En estos
resultados se observa que, en el estado patolgico, el nivel
normal en suero (18.2 2.8 mU/mL), se vi incrementado en
ms de un 100 % (p<0.05). En los animales cirrticos que
recibieron los extractos de Romero (modelo de reversin),
esperabamos una disminucin de la actividad hasta valores
cercanos a los obtenidos en las ratas control, sin embargo,
slo se present una disminucin del 45 % de dicha actividad
alterada (diferencia no significativa). Estos resultados nos
sugieren que el efecto teraputico de los extractos de R.
officinalis no modifica substancialmente la elevacin de la
actividad enzimtica en suero, pero puede ser til para
disminuir parcialmente la misma, sugiriendo una participacin
en la integridad de la membrana del hepatocito.

Las mediciones realizadas para la determinacin de

la actividad enzimtica de la transaminasa glutmico
oxalactica (TGO) se muestran en la figura 8. La actividad
enzimtica normal se eleva en el estado cirrtico (de 65.6
5.3 a 86.5 6.1 mU/mL). En el grupo de animales con
cirrosis que recibieron tratamiento con Romero (modelo de
reversin) existi una disminucin en el valor de la

54
 ACTIVIDAD DE TOP EN CIRROSIS

50 l

4 0 l-
/
*
I -
J

J- / 1

1, -m./,
c
30
mU/ml

20

10

i
/
0 L---I

C CC14 CCI4*R R-CC14 R

7. Actividad de TGP en suero de ratas. En la grfica

mostramos la actividad enzimtica promedio E.S. de
20 1 experimentos.* p < 0.05 VS grupo control. C =
control, CC14 = cirrticos, CClI+R = modelo de
reversin, R-CC14 = modelo de prevencin, R = Romero.
 ACTIVIDAD DE TGO EN CIRROSIS

100
-T--
80 , -F- -l

-;._.
60
mU/ml

40

20

0
C
-

--

CC14
-
1
CCl4*R
/

R-CC14
-

-__
R
i/

FIGURA 8.Medicin de la actividad enzimtica de la TGO en suero

de ratas Wistar. En la figura se muestran los valores
promedio E.S., obtenidos de 20 1 experimentos.
* P < 0.05 comparado contra el grupo de cc14. c =
control, CC14 = cirrticos, CC14+R = modelo de
reversin, R-CC14 = modelo de prevencin R = Romero.
actividad enzimtica (a 58.9 f 5.7 mU/mL), mostrando una
diferencia significativa (p<0.05) comparados con el grupo
cirrtico Comportamiento similar, aunque en menor proporcin
se observ en los animales del modelo de prevencin. Adems
la administracin de Romero, en ratas que solamente
recibieron este extracto, aumenta en un 6 % la actividad de
la enzima (68 4.1 mU/mL) con respecto al control, lo que
nos sugiere que nuestra terapia participa parcialmente en la
recuperacin y prevencin de la alteracin observada en la
cirrosis.

4. PRUEBAS DE BIOTRANSFORMACION

El proceso de biotransformacin del hgado, medido

en funcin de actividad de hidrolasa de aspirina (HAAS) en
nuestros animales de experimentacin, mostr las diferencias
observadas en las barras de la figura 9. Los resultados
obtenidos de la actividad de HAAS, medida en fraccin
microsomal heptica del grupo de animales cirrticos
disminuy de 2.2 + 0.24 (valor control) hasta 1.2 0.13
umol AS/mg prot/h. En los animales de los modelos de
prevencin y de reversin, se observ una proteccin y
recuperacin de la actividad biotransformante de AAS,
obtenindose valores similares a los control, y en el ultimo
caso un poco mayor (siendo significativamente diferente con
una p < 0.05 comparado contra el grupo cirrtico).
En nuestros resultados tambin se puede observar
que en el grupo de animales que recibi solamente el extracto

57
 ACTIVIDAD DE HIDROLASA
DE AAS EN CIRROSIS

1
-
/
34
/
,-__-I -
2.6 - L/-- -
:T /.----r .-I-
__-
,

2-
umd/mg
pratlhr
1.6 -
*/
l-

0.6 -

OV
C
I
I;,
I
CC14
I
CCl4+R R-CC14
-

FIGURA 9. Actividad biotransformante de Hidrolasa de Aspirina.

Medida enfraccin microsomal de hfgado de rata. En
la grfica se muestran los valor espromedio E.S.,
obtenidos de 22 1 experimentos. *p < 0.05 comparado
contra todos los grupos experimentales. C = control,
CC14 = cirrticos, CC14+R = modelo de reversin, R-CC14
= modelo de prevencin R = Romero.
total acuoso de R. officinalis, la biotransformacin de la
aspirina se encontr incrementada en un 5 % (2.6 0.40 umol
AS/mg prot/h), comparada contra las ratas control. Aunque
este aumento en la actividad biotransformante de la enzima no
e s significativo, nos podra sugerir que la presencia de
dicho extracto induce de alguna manera y en forma parcial la
actividad enzimtica de la hidrolasa de aspirina.

5. PRUEBAS MORFOLOGICAS

En los cortes de hgado de las ratas del grupo

control (figura 10), se observ parnquima heptico con
arquitectura conservada, sinusoides normales y espacios porta
sin alteracin.
Cuando se observaron los cortes hepticos de
animales cirrticos (figuras ll y 12), se detect tejido
heptico con abundantes ndulos parenquimatosos cuyos ncleos
se encontraron reactivos (hipercromatismo y binucleacin).
Dichos ndulos se observaron rodeados por estroma de tejido
conjuntivo (fibrosis), el cual los separa, mostrando en este
mismo estroma, intensa reaccin inflamatoria crnica a base
de linfocitos, histiocitos y clulas plasmticas. Los
espacios porta se apreciaron comprimidos por dichos ndulos,
mientras las venas centrolobulillares no mostraron ninguna
alteracin.

59
FIGURA 10. Fotomicrografa de corte de hgado de rata Wistar del
grupo control, teida con Hematoxilina-Eosina. Aumento
100 x. Observese parte del lobulillo heptico con vena
centrolobulillar (extremo superior derecho), espacio
porta (extremo medio izquierdo). Parnquima heptico y
espacio porta sin cambios histolgicos.
FIGURA ll. Fotomicrografia de corte heptico de rata cirrtica.
Tincin Hematoxilina-Eosina. Aumento 100 x. Se observa
espacio porta y parnquima heptico con ndulos grandes
bien delimitados por tejido conectivo fibroso que
comunica entre si ha dichos ndulos.
FIGURA 12. fotomicrografa de corte heptico de rata cirrtica
Tincin Tricrmica de Masson. Aumento 100 x. Observese
un ndulo hepticoparnquimatoso delimitado por bandas
gruesas de colgena.
 En los cortes de hgado de las ratas
correspondientes al modelo de prevencin (figura 13) se
observ parnquima heptico sin alteraciones microscpicas
importantes, esto es, mostr un parnquima muy semejante al
observado en los cortes de animales control. En la
fotomicrografia mostrada, se observan hepatocitos
semiconservados, con ncleos redondos y de 1 a 2 nuclelos
visibles y citoplasma acidfilo intenso. Los ncleos muestran
cierto grado de pleomorfismo con anisonuclesis, as mismo se
observan clulas de Kupffer reactivas y sinusoides dilatados.
Lo anterior concuerda con una imagen de tejido en franca
regeneracin heptica, dato que nos sugiere que la estructura
heptica ha sido protegida de manera parcial contra el dao
que genera el CC14.
La tincin tricrmica de Masson en cortes de
hgado de animales pertenecientes al grupo de prevencin,
mostr regeneracin parnquimatosa e hiperplasia del tejido
conectivo fibroso.
En el grupo de animales del modelo de reversin
(figura 14), cuando se analizaron los cortes de hgado, se
observ parnquima heptico con ndulos microscpicos
delimitados por espacio leve del estroma conjuntivo
(colgena). E n la figura mostrada se observa al centro un
espacio porta rodeado por ndulos parenquimatosos en
regeneracin, notndose tejido conectivo fibroso que delimita
dichos ndulos, este espacio muestra mnima reaccin
inflamatoria crnica y las venas centrolobulillares son

63
FIGURA 13. Fotomicrografia de corte de hgado de rata del modelo
de prevencin, teida con Hematoxilina - Eosina.
Aumento 400 x.
FIGURA 14. Fotomicroqrafia de corte heptico de rata del modelo
de reversin, teida con Hematoxilina-Eosina. Aumento
100 x. Observese espacio porta rodeado por ndulos
parnquimatosos en reqeneracin, ntese tejido
conectivo fibroso que delimita dichos ndulos.
normales. En la tincin tricrmica de Masson, de estos mismos
cortes se observaron abundantes ndulos regenerativos con
hiperplasia del estroma fibroso. La descripcin estructural
microscpica de estos cortes nos sugieren que el Romero
propicia el estado regenerativo del hgado.
Cuando se observaron los cortes de tejido heptico
de las ratas sanas que recibieron Romero (figura 3.5)
encontramos parnquima heptico con ncleos hiperreactivos
cuya cromatina es finamente granulosa y presencia de hasta
dos nuclelos. En la fotomicrografa puede apreciarse el
hipercromatismo nuclear y la anisocitosis, eventos que
concuerdan con los ocurridos previo a la duplicacin celular,
es posible en algunos sitios observar clulas duplicadas. El
citoplasma es finamente acidfilo granuloso, los espacios
porta presentan vena muy congestionada, pero las venas
centrolobulillares son normales. Las estructuras observadas
coinciden con las presentes en los cortes de hgados
normales.

6 . CUANTIFICACION DE
- COLAGENA HEPATICA

Con la finalidad de tener un mejor indicador del

depsito de fibrosis heptica, observado cualitativamente en
los cortes histolgicos, realizamos la medicin de colgena
por un mtodo semicuantitativo, para tratar de correlacionar
dichos aspectos morfolgicos con una cantidad determinada.
Nuestros resultados presentes en la figura 16,
muestran que existe un incremento del 267 %; en la

66
FIGURA 15. Fotomicrografa de corte de hgado de rata que recibi
slo los extractos de Romero. Tincin Hematoxilina-Eosina.
Aumento 100 x. Se observa vena centrolobulillar con luz
ocupada parnquima con hipercromatismo nuclear,as como anisocitosis.
concentracin de este parmetro, en los hgados de ratas
cirrticas comparadas con los valores del grupo
control (p < 0.01).
En la misma figura, se puede observar la
concentracin obtenida en el grupo de animales
correspondientes al modelo de reversin, los cuales, muestran
que ocurri una recuperacin del 50 % del dao presente en
animales cirrticos. Sugiriendo esto, un efecto de reversin
del dao,desde el punto de vista de reduccin parcial de la
fibrosis.
Cuando se realiz la medicin de colgena, en el
hgado de ratas del grupo de prevencin, se observ que a
partir del control, increment en 114 % lo cual sugiere una
proteccin parcial del dao, impidiendo un depsito fibroso
de la magnitud encontrada en los animales cirrticos sin
tratamiento.
En lo concerniente a los animales que slo
recibieron los extractos de Romero, no se observ diferencia
significativa en la concentracin de colgena, comparado con
el grupo de ratas control. Nuestros resultados sugieren que
los extractos totales de Romero, participan de alguna manera
en la disminucin parcial de la concentracin de colgena
heptica.

68
 COLAGENA EN CIRROSIS

.. 3
<T
--1

160

120
ug/mg
protena
80

J
_- -- i -l-
40 1 71
0
, nIu--

FIGURA 16. Concentracin de colgena encortes de hgado de

rata. En las barras se muestran los valores promedio
E.S., obtenidos de 43 = 1 control, CC14
= cirrticos, CC14+R C = modelo de reversin, R-CC14 =
modelo de prevencin, R = Romero. * contra CC14. p < 0.05
comparados experimentos.
7.ANALISIS ESTADISTICO DE- RESULTADOS

Los resultados de significancia estadstica

obtenidos para cada de los indicadores medidos por grupo
experimental, despus de llevar a cabo el anlisis de
varianza se muestran en el cuadro 7.
Posterior a los resultados que arrojo ANOVA se
procedi a la prueba de comparaciones Mltiples de Medias
propuestas por Tukey (DMSH).

CUADRO 7. Resfimen de significancias estadsticas.

=============================================================
INDICADOR (variable) SIGNIFICANCIA
=============================================================
Protenas Totales n.s
Albmina n.s
Globulinas n.s
Relacin A\G n.s
B i l i r r u b i n a **
,Lactato n.s
Glucgeno Heptico **
Gluceno Muscular n.s
Relac 9 6n GH\GM n.s
G a m m a G T P * *
T G O * *
T G P * *
p " " * *
C o l g e n a * *
=============================================================
* p<o.o5E' ** p<O.Ol, n.s no significativo.

70
 DISCUCION

La flora es uno de los recursos naturales

renovables ms importantes en nuestro pas, ya que dadas sus
caractersticas climticas y geogrficas, permite el
crecimiento y desarrollo de una gran variedad de especies
vegetales. Muchas de estas plantas son utilizadas en la
medicina popular, y hasta la fecha, no han sido completamente
estudiadas, para validar cientficamente sus efectos .
Dentro de la flora mexicana se encuentra el Romero
(Rosmarinus officinalis), del cual se ha referido
empricamente que sus extractos o decocciones producen
mejora en ciertas afecciones hepticas,tales como:
cirrosis, hepatitis y clculos biliares, entre otras (37,42).
Actualmente existen reportes cientficos acerca de sus
propiedades hepatoprotectivas y antioxidantes (43,46,47), por
lo que consideramos importante dedicar el presente trabajo al
estudio del efecto del Romero en la cirrosis heptica.
Como se coment previamente, en el hgado
cirrtico se presentan cambios funcionales y metablicos,
aumento de tejido conjuntivo, responsable en gran parte, de
las alteraciones hemodinmicas observadas (l-4). Puesto que
es una preocupacin encontrar tratamientos adecuados para
mejorar e idealmente revertir tales cambios, en este trabajo
estudiamos el efecto farmacolgico del extracto de R.
-
officinalis, con el fin de obtener una alternativa

71
teraputica ms para el tratamiento de esta enfermedad, como
se ha reportado en los ltimos aos con otros compuestos
(71) l

Se ha descrito que el modelo de cirrosis

experimental, que utilizamos en este trabajo, es conveniente
para estudiar los mecanismos fisiopatolgicos del proceso y
adems til para evaluar diversas terapias farmacolgicas
(72)
En la presente investigacin, fueron examinadas
diversas pruebas hepticas (representando distintos niveles
funcionales), como indicadores de dao al hgado que
utilizamos como 'parmetros para evaluar el cambio, en
respuesta al tratamiento con Romero, en la funcin
deteriorada.
Efectivamente, cuando hay recuperacin de la
enfermedad, existe una regeneracin del parnquima heptico
funcional(3), esto es, que inicia la mitosis, con mayor
velocidad, para recuperar las clulas perdidas. Como es bien
sabido, para que las clulas sufran esta divisin, el primer
evento que ocurre es la duplicacin del ADN (73), que en
este estudio lo tomamos como un indicador de regeneracin
heptica.
Los resultados obtenidos en nuestros experimentos,
mostraron un incremento en los niveles del ADN de animales
con cirrosis, mismo que fu superado por aquellos que ya
cirrticos recibieron el tratamiento con Romero, hasta casi
duplicarlos. Estos resultados nos sugieren que el extracto

72
del Romero puede inducir la replicacin de ADN, ya que esta
misma respuesta se present tambin en las ratas que solo
recibieron el extracto. Este efecto podra tener como
consecuencia la replicacin de parnquima heptico
propiciando una recuperacin gradual de la funcionalidad. A
diferencia de lo reportado por Kanta y Kokudo (74,75),
nuestros resultados mostraron un incremento en la
concentracin total de ADN en hgado cirrtico (interpretando
este fenmeno como un aumento en la sintesis), mientras que
los citados autores, describen una disminucin de la sntesis
de ADN medida en funcin de la incorporacin de 3*H-timidina,
en ratas con cirrosis. Por tratarse de distinto parmetro de
medicin, no es posible contrastar ambos resultados, pudiendo
interpretarse de manera diferente.
El aspecto anteriormente descrito, lo corroboramos
con los estudios histolgicos de los animales tratados con
Romero, en donde se observaron solo algunas clulas
binucleadas, tejido en franca regeneracin, eventos que
concuerdan con los ocurridos previo a la duplicacin celular.
Estos cambios observados no se encontraron en hgados
cirrticos sin tratamiento.
Niiya y col., (76) reportaron en 1991, que el
hgado tiene capacidad funcional y habilidad regenerativa,
aunque las clulas parenquimatosas hepticas usualmente son
estables en el ciclo celular. Dichas clulas presentan una
recuperacin progresiva de sus funciones y volumen celular,
despus de una hepatectoma parcial cualquier dao

73
heptico. Aunque estos datos provienen de estudios in vitro,
es importante comentar que nuestros hallazgos realizados en
experimentos in vivo, concuerdan con un proceso regenerativo.
Esto significara que, al existir clulas nuevas con
funcionalidad intacta, existe una probabilidad ms de
sobrevivencia del hgado con el consecuente inicio de las
funciones bioqumicas y fisiolgicas de dicho rgano.
En los animales con cirrosis inducida por CC14 se
presentan diversas manifestaciones en forma semejante a la
cirrosis humana. La hiperactividad adrenrgica presente,
podra ser responsable de innumerables efectos, algunos
resultantes de la estimulacin de la adenilato ciclasa, lo
cual incrementa los niveles de AMPc (14). Como se ha
descrito,* el aumento de este segundo mensajero, desencadena
una serie de cambios funcionales y metablicos al interior
del hepatocito, como la degradacin del glucgeno heptico
entre otros (77). Cambios metablicos similares se observaron
en los animales cirrticos de nuestros experimentos. Cuando
los animales fueron tratados con Romero, no se present
efecto benfico, esto es, no se recuper el valor control del
depsito de glucgeno. Probablemente este efecto est
influenciado, en parte, por la proporcin de Romero
utilizada. En relacin al efecto metablico desencadenado por
catecolaminas, podemos comentar que recientemente se ha
reportado que el hgado puede sintetizar su propia adrenalina

(78). Con esto, tendriamos otro factor ms que incrementara

la estimulacin adrenrgica y por lo tanto los cambios
metablicos derivados del incremento del AMPc.

74
 El aumento de lactato en sujetos cirrticos
(7,15), se ha tomado como un indicador de dao heptico, y en
afos recientes se ha relacionado como un estimulo para la
fibrognesis (18,79). En nuestros resultados se present un
incremento en la concentracin sanguinea de lactato en ratas
cirrticas, observndose adems, que con el tratamiento de
Romero disminuyo este valor. Podriamos sugerir que al
disminuir la concentracin de lactato, eliminariamos la
participacin de un estimulo para la fibrognesis. Por otro
lado, considerando que la hiperlactacidemia resulta de un
imbalance en la produccin de lactato contra su utilizacin,
como lo describen Menino y col. (80) podriamos comentar,
que el incremento sanguneo de lactato puede ser debido
mayormente a la inhibicin de su utilizacin por las .clulas
hepticas, probablemente por el dao existente.
Con respecto a la participacin del lactato como
uno de los estmulos para la fibrognesis, en relacin con
los cambios estructurales, podemos comentar que, al disminuir
los niveles del mismo (como fu observado en los animales que
recibieron el tratamiento con Romero), se redujo en forma
paralela la cantidad de colgena. Hecho que tambin fue
corroborado por la observacin morfolgica cualitativa de los
cortes hepticos, en los cuales se detecta una recuperacin
parcial de la arquitectura celular daada por el CC14,
En la cirrosis, se ha descrito un aumento en los
niveles de bilirrubinas, as como de otros indicadores (19-

21) lo cual hemos podido confirmar en este trabajo. Por otra

75
parte, pudimos evidenciar que los extractos de R.
officinalis, no modifican la alteracin en este parmetro,
por lo que podemos sugerir que este indicador de
funcionalidad heptica, no se recuper, cuando se emple esta
terapia. A diferencia de nuestros resultados, con otros
tratamientos en individuos cirrticos, s se presenta un
efecto de recuperacin hacia niveles normales (81).
Otro cambio funcional que ocurre en los humanos
con cirrosis heptica, es la modificacin de los indicadores
de sfntesis como son las concentraciones de protenas
totales, de albumina y de globulinas, y en consecuencia
existe alteracin de la relacin entre albmina y globulinas
(82). En nuestros experimentos, para este indicador, no
encontramos cambios significativos, ni en el modelo de
cirrosis ni en animales administrados con Romero. Otros
autores, han reportado que la cuantificacin de proteinas
totales en suero de los individuos con enfermedades
hepticas, da una informacin clnica bastante pobre de la
realidad funcional del hgado ya que las modificaciones en
estos parmetros no siempre sigue un patrn de comportamiento
que pueda ser de utilidad para establecer comparaciones entre
los grupos de individuos sanos, enfermos y los que han
recibido algn tratamiento (83).
Como se sabe, la actividad enzimtica del
hepatocito es indispensable para un sinnmero de funciones
metablicas (84). La presencia en suero de algunas enzimas
hepticas, ya sea de membrana o de citosol, nos indicaria un

76
dao al hepatocito. Tal es el caso de la presencia de la
GGTP, cuya actividad srica incrementada (7,18,85,86) en el
estado patolgico, fue corroborada en el suero de nuestros
animales cirrticos. Tal incremento, redujo hasta valores
cercanos a los niveles control, en las ratas que recibieron
como tratamiento los extractos de Romero, por lo que podemos
sugerir que la terapia implementada, probablemente pueda
ejercer una mejoria en el microambiente celular de la enzima
(posiblemente sobre la membrana plasmtica). Este fenmeno
podria estar relacionado a lo descrito por algunos autores
(43,46), quienes lo mencionan como efecto hepatoprotector.
Como nuestros resultados coinciden con los reportados por
otros investigadores (7,18,85-87), podemos sugerir entonces
que los extractos de Romero propician probablemente un efecto
restaurativo sobre la integridad de la membrana plasmtica
del hepatocito, ya que la actividad de la GGTP se encontr
disminuida en el suero de animales que fueron tratados con
Romero.
Las transaminasas, enzimas localizadas en las
mitocondrias y en el citosol de las clulas eucariotas se
encuentran elevadas en el estado cirrtico (aumento
relacionado con ruptura celular, permitiendo la salida de la
enzima hacia la sangre) [84]. Se ha establecido que
principalmente la TGP (7,18,88) incrementa en enfermedades
hepticas, evento que estuvo presente en nuestro trabajo al
realizar las mediciones de actividad en los animales
cirrticos. El aumento de la TGP fue del 100 %, a diferencia

77
de lo registrado para la TGO que solo present un incremento
del 32 % comparado con el control. En nuestros resultados
se pudo observar que la actividad srica de TGP en animales
que recibieron tratamiento con Romero, se recuper
parcialmente. Adems, para el caso de la TGO, en el modelo de
reversin, se present un efecto de restauracin de dicha
actividad hasta un 10 % por abajo de los valores control.
Este indicio nos sugiere que probablemente la terapia con
Romero, interviene en forma parcial en la recuperacin de
alteraciones observadas en la cirrosis, sugiriendo ademas una
participacin en la integridad membrana1 del hepatocito
(43,46).
Como se ha descrito, el hgado es un rgano de
vital importancia, que realiza diversas funciones,
necesarias para la supervivencia normal del individuo. Dentro
de dichas funciones, se encuentra la biotransformacin de
sustancias, tanto endgenas como exgenas, lo que permite al
organismo", en algunos casos, liberarse rpidamente de
compuestos nocivos. Cuando existe una enfermedad heptica,
tambin esta funcin se deteriora o no existe, como ocurre en
la cirrosis (89,90), lo cual favorece la intoxicacin de los
hepatocitos y por ende del organismo, al prolongarse el
tiempo de vida media de algunas sustancias frmacos (91) .
La actividad de biotransformacin del hgado en
nuestro trabajo, fue medida en funcin de la actividad de
hidrolasa de aspirina (HAAS), observndose una disminucin
del 50 % en dicha funcin al comparar los valores de los

-78
animales cirroticos contra los del grupo control. En la
fraccin microsomal de animales tratados con Romero, se
observ un efecto tanto preventivo como de recuperacin en un
100 % lo que nos sugiere que la teraputica induce de alguna
manera la actividad de la HAAS. En relacin a esto, como
pudo observarse en el grupo que solo recibi los extractos de
la planta, se increment levemente por arriba del control, la
actividad biotransformante de la enzima mencionada. Este
efecto podra deberse, ademas, a un fenmeno protector sobre
la integridad de las membranas del hepatocito, lo que tambin
puede ser importante para la preservacin de esta actividad
funcional del hgado (43,46).
Como ya se coment anteriormente, el aumento de
tejido conjuntivo heptico en la cirrosis Y las
modificaciones en la arquitectura celular son responsables,
en parte, de algunas de las alteraciones funcionales que se
observan en la cirrosis (2). Este proceso se caracteriza por
dafo celular generalizado (l-4,92), mismo que se pudo
observar en los cortes histolgicos hepticos de nuestras
ratas cirrticas, en los cuales se apreci el aumento de
tejido conjuntivo, formacin de ndulos de hepatocitos
rodeados por bandas de colgena y distorsin de la estructura
lobular.
Los cambios histopatolgicos, as como los de las
actividades enzimticas Y dems pruebas bioquimicas
utilizadas como indicadoras de la funcionalidad del hgado,
confirmaron un efecto hepatoprotector parcial del Romero

79
contra el dao originado por el CC14.
Efectivamente en el anlisis histopatolgico de
los cortes de hgado obtenidos de las ratas que recibieron
tratamiento con Romero, se observ recuperacin parcial de
la arquitectura celular, daada por el CC14. As tambin, se
pudo corroborar, la binucleacin y duplicacin celular
heptica, lo cual coincide con el aumento en las
concentraciones del ADN encontrados en el presente trabajo.
Al relacionar los resultados morfolgicos, con
los obtenidos en la determinacin de lactato sanguneo y de
colgena heptica, en los animales tratados con Romero,
podemos indicar que las disminuciones en los niveles de estos
dos parmetros coinciden con la restauracin de la
arquitectura celular daada en las ratas cirrticas,
En general nuestros resultados demuestran el
beneficio de usar los extractos de Romero, en el tratamiento
de la cirrosis heptica, ya que el dao del hgado es
revertido parcialmente y con su funcionalidad recuperada en
una proporcin importante, con lo que se puede propiciar una
mejor calidad de vida a los individuos cirrticos y en un
futuro, si se implementa la terapia en humanos, contribuir a
mejorar su proceso patolgico.
Adems estos resultados constituyen un argumento
cientfico slido que apoya el uso emprico que se ha dado a
las plantas. As mismo, contribuirn a realzar la importancia
del aislamiento y estudio de principios activos de diversas
plantas, puesto que la perspectiva de este trabajo a futuro

80
es aislar el compuesto activo del Romero -(R. officinalis),
que participe en la reversin del d a o heptico en los
pacientes cirrticos.
Una forma de contribuir a aumentar los estudios
en la bsqueda de principios activos, es proporcionando
informacin acerca de las plantas que se conocen como
medicinales, su identificacin , sinonimia, lugares de
distribucin y grupos de fitoconstituyentes que pudieran
ejercer el efecto que se le atribuye a la planta, y de ser
posible, posteriormente proporcionar informacin precisa
acerca de los principios activos con una eficacia cientfica
y clnicamente probada.
Un propsito adicional que se persigue es el de
sealar cun insuficiente es el conocimiento acerca de las
plantas de nuestro pas y el potencial farmacolgico que
ellas representan.
Para lo anterior se requiere de largos estudios y
concienzudas investigaciones, con el fin de dar una
aplicacin til y apropiada a toda clase de plantas
medicinales, de las cuales se extraigan los productos
esenciales de ms valioso aprovechamiento, ya que en ellos se
encierra la posibilidad de curar numerosas enfermedades ante
las cuales, en la actualidad no se ha podido incidir.

81
 CONCLUSIONES

1.- Los extractos de Romero inducen la replicacin celular

heptica, medida en funcin de la concentracin total de
ADN en hgado.

2.- En los animales cirrticos se observa una disminucin de

los niveles normales de glucgeno heptico, pero no
se observ efecto ni de reversin ni preventivo cuando
se administraron los extractos de Romero.

3.- La terapia con Romero disminuye el lactato sanguneo que

se mantiene elevado durante la cirrosis.

4.- El incremento de bilirrubinas, dado por la cirrosis, no

se modifica con la ingesta de los extractos de Romero.

5.- La terapia con Romero no contribuye a modificar

importantemente los niveles sricos de los indicadores
de sntesis protica (protenas totales, albmina y
globulinas).

6.- El Romero revirti la actividad enzimtica de la

GGTP alterada por la cirrosis.

82
7 .- Los extractos totales de Romero, reducen parcialmente la
actividad enzimtica de las transaminasas (TGP Y
TGO) , elevadas en la cirrosis.

a . - En la cirrosis heptica inducida con CC14 disminuye la

actividad biotransformante de la HAAS; el tratamiento
con; Romero previene y revierte dicha alteracin.

9 . - El tratamiento con Romero induce cambios estructurales,

detectados en los cortes de hgado de animales
cirrticos que indican una reversin parcial de las
alteraciones manifiestas en cirrosis.

lO.- La concentracin de colgena heptica, elevada durante

la cirrosis, disminuy por el efecto del Romero.

ll.- En general nuestros resultados demuestran el beneficio

de usar los extractos de Romero, en el tratamiento de la
cirrosis heptica, ya que el dao del hgado, es
prevenido y revertido parcialmente y con su
funcionalidad recuperada en una proporcin importante,
con lo que se puede propiciar una mejor calidad de vida
a los individuos cirrticos.

12.- El uso de Romero vendra siendo una alternativa ms, en

la terapia de los pacientes cirrticos desahuciados.

83
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