UNIVERSIDAD NACIONAL

AGRARIA LA MOLINA
FACULTAD DE CIENCIAS
ENZIMOLOGA
REPORTE DE PRCTICAS

TEMA: PURIFICACIN PARCIAL DE FOSFATASA CIDA DE HGADO DE PESCADO

USANDO EL MTODO DE LA PRECIPITACIN POR SULFATO DE AMONIO

PROFESORA:
ANA KITAZONO SUGAHARA

INTEGRANTES:
-CHRISTHIAN EGUIZBAL (CALCULOS Y RESULTADOS; DISCUSIONES 100%)
-RENZO RODRGUEZ (MATERIALES Y MTODOS 100%)
-ANGEL ROJAS (CONCLUSIONES 100%)
-ROBERTO ROJAS (INTRODUCCIN 100%)

LIMA PERU
2016
PURIFICACIN PARCIAL DE FOSFATASA CIDA DE HGADO DE PESCADO USANDO
EL MTODO DE LA PRECIPITACIN POR SULFATO DE AMONIO

I. INTRODUCCIN
Las enzimas se encuentran formando mezclas complejas, usualmente en el interior de clulas
que adems poseen cientos de otras enzimas. Pueden formar parte de agregados moleculares,
complejos con otras enzimas, protenas, cidos nucleicos, polisacridos o lpidos. Para
estudiar una en particular, se hace indispensable entonces su proceso de purificacin.

Es necesario un ensayo cuantitativo de actividad para mediante el cual pueda valorrsela

convenientemente. Para decidir si un paso de la purificacin tiene sentido, es necesario medir
la cantidad de enzima y la cantidad de impurezas antes y despus de ese paso, y comparar los
resultados de varios procedimientos posibles. Slo en trminos cuantitativos se puede saber si
se ha producido algn progreso. Puesto que una gran parte del tiempo empleado en el
aislamiento de una enzima est dedicado a determinar la actividad de las distintas fracciones,
es deseable que sta sea una operacin rpida; es preferible sacrificar precisin por rapidez en
las determinaciones.

La naturaleza del ensayo depender del tipo de reaccin que cataliza la enzima. A veces
resultar conveniente la medicin de la aparicin de un producto y otras la medicin de la
desaparicin de sustrato. Podemos medir la actividad de una enzima mediante condiciones
tales como temperatura, pH, concentracin; por lo tanto es necesario especificarlas y usar las
mismas para comparar actividades.

Es necesario definir una unidad enzimtica arbitraria para poder expresar, en forma
cuantitativa, la pureza y la actividad de las diversas fracciones obtenidas durante la
purificacin. La unidad enzimtica se define en forma particular para cada reaccin segn sea
conveniente. Es la cantidad de enzima que cataliza la formacin de una determinada cantidad
de producto (desaparicin de reactivo) en un tiempo dado.

La pureza de la enzima se ve reflejada en la actividad especfica que es el cociente de

actividad enzimtica (expresada en unidades enzimticas) y la cantidad total de protenas. La
actividad de una enzima vara considerablemente en diferentes organismos y an en los
diversos tejidos de un mismo organismo. Para estudios mecansticos generales, debe
seleccionarse aquella fuente que sea rica en la enzima. En estos casos, particularmente en
tejidos animales, la fuente debe ser fresca, dado que la mayora de las enzimas se deterioran
rpidamente. Frecuentemente una buena eleccin de la fuente de enzima permite simplificar
la extraccin y purificacin de la enzima.

El objetivo de esta prctica es realizar el proceso de extraccin y obtencin de las diversas

fracciones de purificacin para luego determinar las medidas de actividad enzimtica y
concentracin de protenas en todas las fracciones purificadas.
II. MATERIALES Y MTODOS
Precipitacin de protenas por sales de amonio:
Los procedimientos se realizaron siguiendo la metodologa descrita en el siguiente esquema.

2.4 mL del SN del Extracto de

los 4 tubos Eppendorf (S1)

Alcuota (AL1)
200 L
(S1)

2.2 mL S1 en Beacker

Sulfato de amonio 25%

1 mL SN1+SA por cada uno de

los 2 tubos Eppendorf (2mL)

PP1 1.5 mL SN2

(guardar)
Alcuota (AL2)
100 L
(S1)

1.4 mL S1 en Tubo
ensayo

Sulfato de amonio 75%

1.4 mL S1 + SA en
Tubo ensayo (reposar)

800 L S1 + SA por cada

uno de los 2 tubos Eppendorf
(1.6mL)

PP2 1.5 mL SN3

(guardar)
 Medida de Actividad enzimtica:
Se sigui el procedimiento realizado en la primera prctica Determinacin de la actividad
enzimtica. Se us 2 blancos, uno de paranitrofenilfosfato (PNFF) y otros por cada muestra
para descartar la coloracin de la muestra
Blanco Blanco
Muestras
PNFF Muestra
Buffer acetato 1.25 mL 1.25 mL 1.25 mL
PNFF 0.1 mL - 0.1 mL
Agua - 0.1mL -
destilada

Pre-incubar a 37 C por 5 minutos

Muestra - - 0.05 mL

Incubar a 37 C por 2 minutos

NaOH 1.0 M 0.5 mL 0.5 mL 0.5 mL
Muestra - 0.05 mL -
Agua 0.05 mL - -
destilada

Lectura de absorbancias a 402nm

Medida de la cantidad de protenas totales

Se sigui el procedimiento de la Determinacin de la concentracin de protenas usando
Biuret de la sexta prctica.

Blanco Muestras
Agua destilada 0.5 mL 0.4 mL
Muestra - 0.1 mL
Reactivo de 2.5 mL 2.5 mL
Biuret

Incubar a 37 C por 10 minutos

Leer a 540 nm en el espectrofotmetro

III. CLCULOS Y RESULTADOS

A. DETERMINACIN DE CONCENTRACIN DE PROTEINAS
Resultados de las absorbancias:
ABSORBANCIAS

BLANCO 0

SN1 0.043

SN2 0.026

PP1 0.556

PP2 0.643

SN3 0.609
 Utilizando la ecuacin de la recta de la prctica anterior determinamos la
concentracin de protenas en cada uno de los tubo muestra:

Para el clculo de la concentracin de protenas (mg/L), se necesitan las

absorbancias calculadas y la curva de calibracin, para este caso usaremos la
ecuacin hallada en el informe 6 (Determinacin de la concentracin de
protenas en el extracto crudo de hgado), y utilizaremos aquella ecuacin que
presente menor margen de error; es decir con R cercano a 100%.

Mesa 4:
Y = 0.0012X + 0.0021
R = 0.9997
2

Esta ecuacin se usar para determinar la concentracin de protenas de las

distintas mesas. En donde la variable X es la concentracin a calcular (mg%)
y la variable Y es la absorbancia calculada. Para hallarlo usaremos un
ejemplo de la mesa 1, y esta se aplicar a todas las dems mesas.

PP1:
A= 0.0012C+0.0021 ---------> 0.556 = 0.0012C + 0.0021 ------> C = 461.583 mg%
C = 461.583 mg ----------> 100 mL
13.847 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

13.847 mg ----------> 0.1 (del tubo de Eppendorf)

138.47 mg ---------> 1 mL (419.606 mg/mL de protenas en el
precipitado 1)

En la muestra diluida (X) hay 138.47 mg/ml de protena.

Entonces en la muestra (3X) hay 415.41 mg/ml de protena.

PP2:
A= 0.0012C+0.0021 ---------> 0.643 = 0.0012C + 0.0021 ------> C = 543.083 mg%
C = 543.083 mg ----------> 100 mL
16.292 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

16.292 mg ----------> 0.1 mL (del tubo de Eppendorf)

162.92 mg ---------> 1mL (493.697 mg/mL de protenas en el
precipitado 2)
En la muestra diluida(X) hay 162.92 mg/ml de protena.
Entonces en la muestra (3X) hay 488.76 mg/ml de protena.

SN3:
A= 0.0012C+0.0021 ---------> 0.609 = 0.0012C + 0.0021 ------> C = 505.750 mg%
C = 505.750 mg ----------> 100 mL
15.173 mg ----------> 3 mL (tubo de ensayo)

15.173 mg ----------> 0.1 (del tubo de Eppendorf)

151.73 mg ---------> 1 mL (151.73 mg/mL de protenas en el
sobrenadante 3)
 En la muestra diluida(X) hay 151.73 mg/ml de protena.
Entonces en la muestra (3X) hay 455.19 mg/ml de protena.

Concentracin de protenas

Concentracin de protenas (mg/mL)

SN1 30.675

SN2 17.925

PP1 415.41

PP2 488.76

SN3 455.19

B. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ESPECFICA

Resultado de las absorbancias finales (con blanco restado):
ABSORBANCIAS

SN1 0.214

SN2 0.101

PP1 0.047

PP2 0.217

SN3 0.155

Determinacin de actividad enzimtica:

Para la determinacin de la AE, se usar el coeficiente de extincin molar del
PNF que es 18400 y usando la ecuacin de Lamber y Beer, con ello
podremos calcular la concentracin de enzima para las distintas absorbancias
halladas.
Usaremos un ejemplo del procedimiento para PP2, y esta se aplicar a las
dems muestras.
Actividad Enzimtica PP2:
18400---------------------1M
0.217----------------------X X = 1.1793x10-5 M
X =11.793 M
Pero el volumen del tubo fue 1.9 mL. Convirtiendo a moles:

11.793 moles----------------1000 mL
X moles--------------------1.9 mL X = 0.0224 moles
 Ahora el proceso de la reaccin duro 2 minutos, por lo tanto, hallando la
unidad enzimtica (UE) en -moles/min:

0.0224 moles-------------- 2 min

X moles--------------------- 1 min X = 0.0112 moles/min

Hasta aqu hemos calculado la AE usando 0.05 mL de ECH, las unidades de

AE se expresan por litro de ECH (U/L). Por lo tanto:

0.0112 moles---------------------0.05 mL (ECH)

X moles---------------------------- 1mL X = 0.221 moles/min.mL

Actividad Enzimtica de las diferentes muestras

Actividad Enzimtica de la
fosfatasa cida (U/mL)
SN1 0.221

SN2 0.104

PP1 0.049

PP2 0.224

SN3 0.160

TABLA FINAL DE RESULTADOS

Actividad Volumen Protena Protena Actividad Actividad Rendimiento

(UE/ml) total (ml) (mg/ml) total total especfica (%)
(mg) (UE/ml) (UE/mg)
SN1 0.221 2.6 30.675 3.2518 0.575 7.205x10-3 100
(ECH)
SN2 0.104 1.6 17.925 0.036 0.166 5.802x10-3 80.527

PP1 0.049 0.5 415.41 2.908 0.025 1.18x10-4 1.638

PP2 0.224 0.1 488.76 66.471 0.022 4.583x10-4 6.361

SN3 0.160 1.3 455.19 76.017 0.208 3.515x10-4 4.878

IV. DISCUSIONES
Cuando purificamos una protena, el xito
de nuestro objetivo va a depender de 2
factores: tener en claro el mtodo a usar
para la purificacin y ser cuidadoso de
evitar errores. Uno de los mtodos ms
conocidos y usados, as como clsicos se
trata del uso de sales de amonio para
lograr la precipitacin o la solubilidad de
la protena (dependiendo de su tipo) en
una muestra. Esto se debe a que se
aumenta la fuerza inica del medio al
agregar la sal de sulfato de amonio,
ocasionando que las dems protenas
precipiten y nuestra enzima se mantenga
soluble a concentraciones bajas de la sal (salting in) o que la enzima en s es la que precipite
al adicionar cantidades altas (salting out). Solamente podemos determinar cunto es la
cantidad que debemos echarle de la sal gracias a pruebas preliminares basados en la
experimentacin a errores que se han hecho anteriormente; la presencia de la enzima se
determina al realizar los ensayos de actividad especfica que ya conocemos (clculo de la
actividad enzimtica y de la concentracin de protenas totales)1 . La adicin de sales elimina
el agua de la protena hidratada, dejando las regiones hidrofbicas en libertad de combinarse
intermolecularmente y de esta manera, precipiten primero.2

Llegamos a obtener un rendimiento del 80% aproximadamente en el sobrenadante 2 (SN2)

que vendra a ser del primer tratamiento con la sal. Este alto porcentaje nos indica que la
enzima est presente en el sobrenadante, y est bien purificada pues a comparacin de los
otros resultados de las otras fracciones, presenta actividad enzimtica alta con una
concentracin de protenas muy pequea. Los dems por el contrario, presenta actividad
enzimtica baja y a una alta concentracin de protenas en el medio.

Sin embargo, a partir del segundo fraccionamiento, los parmetros obtenidos del extracto
crudo en relacin con los precipitados y los sobrenadantes no fueron los correctos debido a
que los datos obtenidos no fueron completamente confiables. Esto lo podemos verificar en los
resultados obtenidos al comparar el rendimiento. Hay que admitir que se cometieron errores
durante la parte experimental de la prctica realizada. Uno de los errores que se cometieron
fue el adicionar sulfato de amonio de ms, pues en los clculos realizados se tom un
volumen errneo. Aunque claro, si analizamos los resultados, el rendimiento de la ltima
fraccin iba a salir bajo en las dos fases, por la prdida de enzima ocasionada por la alta
precipitacin en concentraciones altas de la sal. Incluso, el rendimiento del precipitado de la
segunda fraccin es mayor que el sobrenadante de la misma, manteniendo lo expuesto
anteriormente.

1 Informacin extrada de https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/8.pdf

2 Informacin extrada de http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/sho/Precipitacion.pdf
 Generalmente el comportamiento de estos parmetros de control al desarrollar la purificacin,
es el aumento de la actividad especfica (en cada paso de purificacin la concentracin de
protena disminuye, encontrndose esta en el denominador, lo cual hace que el valor total
aumente, claro est, asumiendo que la actividad no tenga una disminucin tan drstica como
la protena) y del factor de purificacin, mientras que el porcentaje de rendimiento
disminuye. Esto no siempre se cumple, pero es una tendencia general.

V. CONCLUSIONES
Se obtuvieron los datos de actividad enzimtica y protenas totales en cada fraccin (25% y
75%), en las cuales solo la primera fraccin del 25% en el sobrenadante result bueno con un
80% de purificacin, en las dems fracciones se perdi protenas. Es decir, la protena
fosfatasa cida presenta ms carcter hidrofilico que hidrofbico. Debemos evitar cometer
errores para tener valores reales de rendimiento.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Huerta, S. (s.f.) Precipitacin. Planta piloto de fermentaciones. Departamento de
Biotecnologa de la Universidad Autnoma Metropolitana. Iztalapa, Mxico. (Visto
en http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/sho/Precipitacion.pdf el da Jueves
10 de noviembre del 2016 a las 21:39)
2. Solubilidad De Las Protenas: Efecto De La Fuerza Inica (visto en
https://acasti.webs.ull.es/docencia/practicas/8.pdf el dia Martes 08 de noviembre
del 2016 a las 20:04)