Molecular Biology and Genetic Engineering (2017)

Mapeo por restriccin de ADN plasmdico

Lpez Karen1 Hernndez Yhara1 Hernndez Maria1 Villadiego

Heifren1 Alvarez Manuel1

Correspondencia: Manuelalvares1208@hotmail.com

1 Universidad de Sucre, Facultad de Educacin y Ciencias, Programa de Biologa,

Lnea de profundizacin en Biotecnologa, Ingeniera Gentica, Sincelejo Colombia.
Resumen.

Las molculas de ADN que componen los organismos vivos son demasiado largas para ser
analizadas directamente, un mapa de restriccin identifica una serie de fragmentos
relativamente pequeos de un modo reproducible; este trabajo presenta los distintos sitios de
corte de las enzimas HpaI, PstI y SspI de un ADN desconocido. Los mtodos de
interpolacin, regresin de ecuaciones y por estimacin con el marcador molecular permiten
cuantificar el tamao aproximado de las bandas obtenidas en la electroforesis e ilustrar los
sitios de corte de las enzimas de restriccin.
Palabras claves: Electroforesis, ADN, mapa de restriccin, bandas, enzimas de restriccin

Introduccin
La importancia de reconocer la utilidad de
cada equipo utilizado en el laboratorio de
ingeniera gentica es necesario para llevar a
cabo el adecuado manejo en los
procedimientos a realizar as tambin las
normas de bioseguridad que se requieren
ante la manipulacin de microorganismos y
reactivos. El mapeo por restriccin permite
cortar pequeos fragmentos de una molcula
de ADN con ayuda de las enzimas de
restriccin, estos cortes se separan a travs
de electroforesis de acuerdo a las siguientes
caractersticas:
El tamao de la molcula o masa.
La forma o conformacin del ADN (ej.
ADN sper-enrollado vs. ADN lineal).
El tamao de los poros del gel.
La magnitud de la carga neta de la
molcula. (Rivera, 2009)
Electroforesis es una tcnica de separacin
que consiste en la migracin de partculas
cargadas sometidas a la influencia de un
campo elctrico, de tal forma que las
molculas con carga positiva migran al
ctodo (electrodo con carga negativa) y las
molculas con carga negativa migran al
nodo (electrodo con carga positiva).
Constituye un mtodo normalizado que se
utiliza para separar, identificar y purificar
fragmentos de ADN y ARN (Somma &
Querci, 2007).
En el caso de los geles de agarosa, se aade
un colorante, la sustancia se intercala entre
las bases del DNA y esta puede ser
visualizada con luz blanca. Las muestras de
DNA aplicado y los marcadores de peso

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molecular se pueden identificar por el

nmero de pares de bases que posee. El
DNA problema que se analiz mediante
electroforesis en gel de agarosa durante la
prctica fue suministrado por el tcnico de
laboratorio. El objetivo propuesto para esta
Fig 2. Dilucin de agarosa en plancha de
prctica fue determinar con ayuda de
calentamiento.
enzimas de restriccin los pesos moleculares
de bandas de ADN para la previa Luego de que la muestra se tornara
construccin del mapa del plsmido. transparente se registr temperatura final 65
C.

Materiales y mtodos
Preparacin de gel de agarosa y buffer
TBE 1x
clculos para preparacin de la solucin de
agarosa al 0.8% y Carolina BLU fueron
realizados de la siguiente forma: Fig 3. Tincin del buffer de corrido con
Carolina BLU
Simultneamente se realizaron los clculos
para la preparacin del buffer TBE 1X
usando la siguiente ecuacin:
C1V1=C2V2:
C2V2 1 ml
V1= V1=
C1 2
Para 500ml de este se necesitaban 960l de
colorante, obteniendo que para 580ml se deb
an usar 1114l de colorante.
Tabla 1. Clculos para cantidades de Medicin del rea de pozos en gel de
agarosa y Carolina BLU. agarosa
Se pesaron 0.56 gr de agarosa y se
Con una regla se midieron las dimensiones
mezclaron con 70 ml de buffer TBE 1X en de uno de los dientes del peine empleado
un Erlenmeyer de 100 ml, posteriormente se para la realizacin de los pozos en el gel de
calent a 150 C con 375 rpm utilizando agarosa, obteniendo lo siguiente:
plancha de agitacin magntica LAB PRO
MS-7H550- S.

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Fig 4. Medidas de pozos del gel
LAG
0.036ml x 1000 = 36l
Se calibr el molde para adicionar el gel de
agarosa y se esper que solidificara,
al cubrir con papel aluminio se evit que se
contaminara el gel.
Fig 5. Nivelacin del molde y adicin de ag
arosa.
Por ltimo, se realiz la tincin final del gel
con Carolina BLU para observar resultados
obtenidos, previamente el lavado se hizo con
agua destilada unas tres veces hasta retirar el
exceso de colorante.
Fig. 6 Tincin del gel con Carolina BLU
Con ayuda de la centrifugadora IKA MS-3
basic se homogeneizaron los viales que
contenan las enzimas a utilizar. La siembra
de los pozos se realiz en direccin derecho-
izquierdo utilizando Micropipeta Hamilton
200 L tomando el ltimo pozo como
primero. El barrido se llev a cabo durante
60 minutos a 80V (fig 8).
Fig 7. Cmara de electroforesis
A la cmara electrofortica (Cmara de
electroforesis Bio-Rad) se agreg buffer
TBE 1X cubriendo toda la superficie del gel
y retirando cuidadosamente el peine.
Resultados
Los pozos sembrados en direccin opuesta
dieron como resultado bandas de 4700, 940
pb (M10); 3800, 960 pb (M9); 2450,960 pb
(M8); 2450,960 pb (M7); valores de
referencia (M6).
Fig 8. Corrido de electroforesis en gel de
agarosa 80V durante 60 min.
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Mapa de restriccin de ADN plasmdico ADN al azar, teniendo en cuenta los

obtenido. fragmentos de ADN del marcador.

Distancia Tamao
N (x) (y) X*Y X2
1 2,1 4700 9870 4,41
2 4 960 3840 16
3 2,3 3800 8740 5,29
4 3,8 960 3648 14,44
5 2,7 2450 6615 7,29
6 3,7 960 3552 13,69
7 3,3 960 3168 10,89
Total 21,9 14790 39433 72,01
Tabla 3. Minimos cuadrados que
posteriormente se reemplazaron en las
frmula.
Fig 9. Mapas de restriccin con
digestiones obtenidas, simple PstI, doble
PstI/Hpa, PstI/SspI y triple PstI /HpaI/
SspI.

La siguiente tabla muestra el orden en que se

sembraron los pozos, su contenido de
enzimas de restriccin y los pesos
moleculares de las bandas obtenidas, los
tamaos calculados de las bandas con
ecuacin de regresin y la distancia
recorrida en cm.
Ecuacin de la regresin:

Y = ax + b donde,
Y= tamao en pares de bases
m= pendiente
x= distancia recorrida en cm

Tabla 2. Viales y contenido, pb de bandas y

distancia recorrida en cm.

Mtodo de interpolacin. Graficar los

logaritmos de los pesos moleculares de las
bandas del marcador ADN y las distancias
recorridas por cada una de ellas. Se
determin los pesos moleculares para cada
segmento de

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El resultado obtenido para la ecuacin de la grfica fue Y = -1957,1x + 8235,7 ;

R2 = 0,894.

Grfica 1. Ecuacin obtenida por regresin lineal de la distancia recorrida de cada banda vs
longitud del tamao de los fragmentos

Discusin enlace fosfodister en la hebra

complementaria (Lewin, B. 2001). Los
La agarosa es un polisacrido
fragmentos de DNA se cargan sobre el gel
(originalmente obtenido de algas, como el
horizontal de agarosa, el cul fue
agar-agar, pero de composicin ms
sumergido dentro de una cmara
homognea), disoluciones (tpicamente de
contenedora de una solucin
0,5 a 2%) poseen la propiedad de
amortiguadora. Para poder separar
permanecer lquidas por encima de aprox.
fsicamente los fragmentos de DNA fue
50C y formar un gel, semislido, al
necesario aplicar una corriente elctrica
enfriarse. Este gel est constituido por una
entre dos electrodos ubicados en ambos
matriz o trama tridimensional de fibras
extremos de la cmara. Estos fragmentos de
polimricas, embebida en gran cantidad de
DNA poseen una carga negativa por Los
medio lquido, que retarda el paso de las
grupos fosfato de su esqueleto de
molculas de cido nucleico a su travs,
azcares-fosfato, por ende al someterlos a
en mayor medida cuanto ms grandes sean
un contacto en un campo elctrico estos
stas. Se puede evidenciar que este
migran hacia el polo positivo. La matriz de
proceso separa fragmentos de DNA en base
agarosa acta como un tamiz molecular
a sus diferentes masas moleculares.
separando las molculas ms pequeas de
DNA (que migran ms rpidamente) de las
El sitio de reconocimiento se llama sitio de ms grandes (que migran ms lentamente).
restriccin, y la enzima rompe un enlace
fosfodister en la hebra de arriba y otro

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Por lo cual se puede inferir, que la
velocidad a la cuallas molculas de DNA
migra a travs de una matriz de agarosa es
inversamente proporcional a su masa
molecular. Despus de un rato que ha
corrido el gel, los fragmentos ms cortos
de ADN estarn ms cerca del extremo
positivo del gel y los ms largos se
mantendrn cerca de los pozos. Los
fragmentos de ADN muy pequeos
podran correr hasta salirse del gel si lo
dejramos corriendo por demasiado
tiempo.
El ADN propio no es reconocido por sus
enzimas de restriccin, puesto que
previamente lo ha modificado por
metilacin a travs de la accin de una
metiltransferasa (enzima que transfiere
grupos metilo desde Sadenosilmetionina a
bases especficas). Son extradas de
organismos procariticos (bacterias),
donde actan como un mecanismo de
defensa, para degradar material gentico
extrao que entre en la clula. Las
bacterias tienen la capacidad de metilar su
ADN, lo cual sirve para distinguir entre el
ADN extrao y el ADN propio.
Las enzimas de restriccin no pueden
cortar ADN metilado, de este modo solo
afectan el ADN extranjero y no el ADN
bacteriano (Huynh, T. 1985). Una "lnea"
de ADN bien definida en un gel se
llama banda. Cada banda contiene un gran
nmero de fragmentos de ADN del mismo
tamao que han viajado juntos a la misma
posicin. Un fragmento nico de ADN (o
incluso un pequeo grupo de fragmentos
de ADN) no sera visible por s mismo en
un gel.
Conclusiones
Se pudo evidenciar los fallos que
pueden existir al momento de realizar
un corrido de una muestra, las bandas
de los pozos no se pueden observar
con gran nitidez en el gel de agarosa
debido a que el tiempo estimado para
el procedimiento no fue el adecuado y
ello se vi reflejado en los resultados
obtenidos as como los mapas de
restriccin en los cuales los cortes
realizados por las enzimas no fueron
suficientes para estimar los sitios de
corte con mayor precisin.
La tcnica para retirar el peine influye
en gran parte en los resultados
esperados puesto que cualquier dao
al gel se evidenciar en el corrido de
las muestras.
La banda M7 no es visible en nuestro
gel de agarosa la cual se realiza una
estimacin. Esta posible podra haber
sido rectificada mediante el uso de una
mayor cantidad de ADN o permitir
una mejor tcnica al momento de
sembrar en los pozos. En general este
laboratorio era una herramienta til en
la determinacin de cmo las enzimas
de restriccin interactan dentro de un
plsmido.
Los cidos nucledos separados en
geles de agarosa pueden visualizarse
mediante tincin con colorantes
fluorescentes, lo cual permite evaluar
su integridad y estimar su
concentracin mediante un anlisis
comparativo con patrones de
concentracin conocida, n nuestro
caso se us Carolina BLU, estos
colorantes fluorescentes actan
mediante insercin entre las pares de
bases que conforman el cido
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2. Tamao total del ADN digerido ms

(+) los tamaos de los fragmentos de
nucleco, facilitando una mejor
cada digestin.
visualizacin de las bandas de ADN de
inters.

Mediante clculos estadsticos se

pueden determinar la cantidad de
pares de bases aproximadas de las
bandas obtenidas, lo cual es una
herramienta que permite un mejor
anlisis de los resultados al momento
de realizar el mapeo de restriccin de
ADN plasmdico.

Cuestionario
Primera parte

Problema 1: Digestin con HpaI,
HpaI/PstI,.HpaI/SspI, y HpaI/PstI/Sspl.
Estime los tamaos de los fragmentos de
ADN (en pares de bases) por comparacin
con los pesos moleculares del marcador
lambda/Pstl. Los tamaos no tienen que
ser demasiado precisos. Determinar el
tamao de los fragmentos pequeos ser
ms preciso que el de los fragmentos ms
grandes Segn la estimacin comparativa
tenemos que:
3. Hay dos sitios Hpal presentes. Basado
en el nmero de fragmentos generados
por la digestin con Hpal, diga si este
ADN es linear o circular.
El ADN digerido, presentado en este
problema de mapeo por restriccin de
ADN plasmidico es circular.
Dibuje el ADN con los sitios de corte de
Hpal.

4.Cuantos sitios de corte Pstl existen?

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Teniendo en cuenta que hay dos
fragmentos Hpal y tres fragmentos Hpal y
Pstl, se esperara que luego que se lleve a
cabo la digestin Solamente haya un sitio
de corte Pstl.
5. Dnde se localiza el sitio de Pstl?
Dibujo de la posicin (sitio en el
plsmido en relacin con los sitios de
Hpal).
Analizando las imgenes, se puede
mencionar que el sitio Pstl se encuentra
dentro del fragmento Hpal 3922pb.
6. Cuntos sitios Sspl existen?
Teniendo en cuenta que hay dos
fragmentos Hpal y tres fragmentos Hpal y
Sspl al llevarse a cabo la digestin se
puede decir que, Solamente hay un sitio
de corte Sspl.
7. Dnde se localiza el sitio de Sspl?
Dibujo (posicin de este sitio en el
plsmido en relacin con los sitios de
Hpal).
Analizando las imgenes, se puede
mencionar que el sitio Sspl est dentro del
fragmento Hpal 3922pb.
8. El fragmento de unos 400-600-pb de
Hpal, permanecer sin cambios luego
de la digestin con Pstl o Sspl?
Al observar detenidamente la figura del
gel, se puede deducir que el fragmento de
500-600-pb de Hpal, s permanecer sin
cambios; Debido a que no hay sitios PstI o
SspI presentes o estacionados dentro de
este fragmento.
9. Cules fragmentos no cambian de
Hpal/Pstl en relacin a la digestin con
Hpal/Pstl/Sspl?, Cules fragmentos
desaparecen con Hpal/Sspl?, y Por
qu?
En relacin a la digestin llevada a cabo
con Hpal/Pstl/Sspl, los fragmentos de
Hpal/Pstl que no cambian son (630 y
1580pb). El fragmento que desaparece con
Hpal/Sspl, es el 2030, el cual, desapareci
porque contiene un sitio SspI.
10. Cules fragmentos no cambian de
la digestin Hpal/Sspl al compararla
con la de Hpal/Pstl/Sspl?, Cules
fragmentos desaparecen?, y Por qu?
Al comparar la digestin de
Hpal/Pstl/Sspl, los fragmentos de la
digestin Hpal/Sspl que no cambian, son:
(630 y 295pb).
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El fragmento que desaparece al realizar el 2. Determine el tamao total del ADN

respectivo anlisis es (2515 fragmento), el digerido sumando los tamaos de los
cual, desapareci porque simplemente fragmentos de cada digestin.
contiene un sitio Pstl.
11. Hay un fragmento que aparece
solo con la digestin Hpal/Pstl/Sspl?
Qu significa esto?
S existe un fragmento que aparece solo
con la digestin de Hpal/Pstl/Sspl; Esto
significa que existe o hay solo un
fragmento con un sitio Sspl en un extremo
y un sitio Pstl presente en el otro extremo.
12. Dibuje el mapa del plsmido
completo, con todos los sitios de
restriccin presentes, y en sus
posiciones relativas.

Segunda parte 3. Este es un ADN plasmdico, el cual es

1. Estime los tamaos de los fragmentos
de ADN (en pares de bases) por
comparacin con los pesos moleculares
del marcador Lambda/Pst.
circular. Cuantos sitios de corte hay
para Sspl? Dibuje la posicin relativa
del sitio de corte de la Si en el plsmido.
Este tipo de ADN plasmdico circular,
presenta dos sitios de reconocimiento
(corte) para la enzima SspI.

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4. Cuntos sitios de corte Hpal hay?
Para la enzima Hpal Solo hay un sitio de
reconocimiento (corte).
5. Dnde est el sitio Hpal? Dibuje la
posicin de los sitios Hpal. En relacin
al sitio Sspl.
Cuntos sitios de corte Pstl hay?
Para la enzima Pstl Solo hay un sitio de
reconocimiento (corte).
6. Dentro de cual fragmento est
localizado el sitio de corte Pstl? Dibuje
la posicin del sitio Pstl en el plsmido,
con relacin a los sitios Sspl.
7. Cambiaron Los fragmentos Sspl de
aproximadamente 400 pb y 1000 pb
posterior a la digestin con Pstl o Hpal?
Observar el gel.
Al llevar a cabo la visualizacin del gel,
no se presentaron cambios. Lo cual, puede
ser un indicativo de que, solamente estn
presentes sitios de reconocimiento (corte)
de estas enzimas en el fragmento cuyo
tamao es de 2665 pb.
8. Cul de los fragmentos permanecen
sin cambios luego que de la digestin
con Sspl/Hpal se pasa a la digestin con
Sspl/Pstl/Hpal? Cul fragmento
desaparece y porque?
Luego de la digestin con Sspl/Hpal al
pasar a la digestin Sspl/Pstl/Hpal. Se
mantienen sin cambiar los fragmentos con
un tamao aproximado de 1090 pb, 850
pb y 530 pb.
El fragmento que sufre un cambio y por
ende desaparece es el que posee un
tamao de 1700 pb cambia, esto debido a
que, en su interior est presente un sitio de
reconocimiento (corte) para la enzima
Pstl.
9. Cules fragmentos no cambian
cuando se comparan las bandas de la
digestin de Sspl/ Pstl con las de
Sspl/Pstl/Hpal? Cul fragmento
desaparece y porque?
Los fragmentos que no presentaron
cambios al comparar las bandas de la
digestin Sspl/ Pstl con las de
Sspl/Pstl/Hpal fueron; los de un tamao
aproximado de 1240 pb, 1090 pb y 530 pb
se mantuvieron, pero el fragmento con
tamao de 1340 pb desapareci, esto
debido a que posee solo un sitio de (corte)
de la enzima Hpal.
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10. Cul nico fragmento que aparece Campell MK. Biochemistry. Second
en la digestin con Sspl/Pstl/Hpal? Por edition. Saunders College
qu aparece solo aqu? Publishing.1995.

El nico fragmento que aparece en esta

digestin (Sspl/Pstl/Hpal), es el fragmento
con un tamao de 425 pb.
Solo aparece en ese tipo de digestin el
fragmento con tamao de 425 pb ,debido a
que Este fragmento es obtenido como
producto de la digestin del ADN por las
enzimas Hpal y Pstl, las cuales presentan
sitios de reconocimiento o corte
dispuestos a cada extremo del ADN
plasmdico.

Referencias
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105-125 En: S.G. Pandalai (ed.),

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