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FACULTAD DE MEDICINA
ASIGNATURA: BIOQUIMICA
ALUMNO(A):
ASESOR:
TRUJILLO PER
I UNIDAD
REUNION DE LABORATORIO N1
PRACTICA N01
DEMOSTRACION DE LA NATURALEZA PROTEICA DE LAS ENZIMAS
I. INTRODUCCION:
La vida depende de una serie ordenada de reacciones qumicas que son catalizadas por
enzimas formadas para este fin. Las enzimas, salvo los ribozimas, son protenas
relativamente frgiles con tendencia a sufrir desnaturalizacin e inactivacin, es decir
alteraciones en su conformacin, por efecto de diversos agentes fsicos y qumicos
como: temperatura, cidos y lcalis fuertes, sales pesadas, pH, etc.
TUBOS
COMPONENTES I II III IV V VI
(en ml)
Amilasa al 1% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
NaOH 1N - 2.4 - - - -
HCl 3N - - 2.4 - - -
cido Tricloro
- - - 2.4 - -
actico 20%
Sulfato de Cobre al
- - - - 2.4 -
20%
Buffer fosfato
2.4 - - - - 2.4
0.1M / pH 6.6
SISTEMA B:
TUBOS
COMPONENTES I II III IV V VI
(en ml)
Almidn al 1.0% 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
en solucin acuosa
Buffer fosfato 0.1 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
M / pH 6.6
NaCl 0.15 M 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4 1.4
Agua Destilada 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
Agregar 0.6 ml. de la enzima tratada, de cada uno de los tubos del sistema (A) a su
correspondiente tubo del ltimo sistema (B), dejar en incubacin a 37 por 20 min.
Todos los tubos del sistema B contienen el sustrato(almidn), buffer fosfato/ PH 6.6 , NaCl y
agua destilada; este sistema constituye un medio ptimo para la accin de la enzima. Al
Observar agregar la solucin del primer sistema que contiene amilasa a cada tubo correspondiente del al
e segundo y luego dejarlo en incubacin a 37 por 20 min, se consigue que haya una reaccin
interpreta enzima(amilasa) sustrato(almidn) siendo la temperatura un factor que aumenta la actividad
r de la enzima y el NaCl cofactor de esta.
SISTEMA C:
TUBOS
HCl 0.05N 5 5 5 5 5 5
De los tubos de reaccin del 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
sistema (B), agregar:
I. CUESTIONARIO:
Los acidos y bases cuando estn en solucin tienden a ionizarse liberando asi iones
hidrogeniones u oxidrilos, esto hace variar el PH lo que causa variacin en el grado de
ionizacin de distintos grupos funcionales (carboxilo, amino, hidroxilo, etc.)
implicados en interacciones dbiles que estabilizan la conformacin proteica. Estas
variaciones provocan la rotura de dichas interacciones (sobre todo enlaces inicos y
tambin puentes de hidrgeno) y por lo tanto la desnaturalizan.
Ejemplos:
*El HCl mantiene adecuado el Ph acido del estmago adecuado para la actividad
enzimtica de la pepsina.
Bajo ciertas condiciones de temperatura cada poli pptido asume una conformacin
especfica
Corresponde a una estructura termodinmicamente estable y un sistema organizado con
mnima energa libre. Los aumentos de temperatura provocan una mayor agitacin
molecular que hace que las interacciones dbiles que mantienen estable la
conformacin de la protena terminen por ceder con la consiguiente desnaturalizacin.
PRACTICA N02
DETERMINACIN DEL PUNTO ISOLCTRICO DE LAS PROTENAS
I. INTRODUCCION
El punto isoelctrico es la concentracin de iones hidrgeno en el cual la protena es
elctricamente neutra, porque el nmero de cargas positivas es igual al nmero total de
cargas negativas es igual al nmero total de cargas negativas contenidas en la protena. Por
tanto cada protena posee un determinado punto isoelctrico (PI).
La presente prctica tiene por finalidad demostrar que el punto isoelctrico de las enzimas
es caracterstica fsico qumica comn de estas molculas, que precipitan porque la
solubilidad en estas condiciones disminuye al mnimo.
III. PROCEDIMIENTO
Preparar el siguiente sistema
TUBOS
Reactivos(en I II III IV V VI VII VIII IX
ml)
Acido 3.2
Actico 1 N
Agua 6.8 5 5 5 5 5 5 5 5
destilada
a Mezclar el tubo N 1
b Extraer 5 ml de solucin del tubo N1 y agregar al tubo N2. Mezclar
c Extraer 5 ml del tubo N2 y trasferir al tubo N 3. Completando del mismo modo
hasta completar la serie.
d En el tubo N9 una vez efectuada la mezcla se extrae 5 ml de solucin y se elimina
e Al contenido anterior del sistema agregar rpidamente 1 ml de casena en acetato de
sodio 0.1 N en cada tubo.
TUBOS
Reactivos(e I II III IV V VI VII VIII IX
n ml)
Contenido 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0
anterior
Casena 0.1N 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0
(sal)
EL efecto inmediato al agregar casena a los tubos con la dilucin de cido actico a
Observar diferentes concentraciones nos muestra que el tubo III se volvi ms opalescente; luego de
e los 30 min de reposo la mayor formacin de precipitado, por lo tanto mayor insolubilidad
interpreta tambin la verificamos en el tubo III; esto ocurre debido a la diferencia de concentracin
r inica y PH de cada tubo con dilucin. La formacin de precipitado responde a la
inexistencia de repulsin electrosttica lo que nos indica que la protena se encuentra en su
punto isoelctrico.
*La casena pierde solubilidad y forma mayor cantidad de precipitado a un PH de 4.5 lo que
Conclusi
indica el punto isoelctrico de esta protena.
n
IV.CUESTIONARIO
3 Qu es el pK?
pK = -log K
La importancia radica en que si se conoce el PI de una protena, esta puede ser identificada
y aislada de una solucin, por ejemplo mediante la tcnica electroforesis de soporte.Esta
tcnica, consiste en crear un gradiente de pH lineal en un capilar con pared tratada que
contiene un anftero. Cada compuesto migra y se enfoca al pH que tenga igual valor que su
punto isoelctrico (al pI su carga neta es nula). Seguidamente, bajo el efecto de una presin
hidrosttica y manteniendo el campo elctrico, se desplazan las especies separadas hacia el
detector. Las altas eficiencias obtenidas con este procedimiento permiten separar pptidos
con pI que apenas difieren entre s 0.02 unidades de pH.
PRCTICA N 3
III PROCEDIMIENTO
Armar el siguiente sistema:
ETAPA A:
-
COMPONENTES TUBOS
I II
*El mtodo de control de la actividad enzimtica por productos residuales permite verificar,
Conclusi valorar y determinar la catlisis de una enzima teniendo como indicador el cambio de color
n de la solucin.
ETAPA C: CONTROL DE ACTIVIDAD ENZIMATICO POR LOS PRODUCTOS
FORMADOS
Armar el siguiente sistema:
COMPONENTES TUBOS
I II
Hervir 8 minutos
Enfriar
1 ml 1 ml
Solucin fosfomolbdica
Agua destilada 2 ml 2 ml
Mezclar, observar y anotar los resultados de cada tubo de acuerdo a la intensidad del color
resultante
*En el tubo I se agreg el producto I mas solucin cprico alcalina, esto se puso hervir y
a enfriar y nos dio un producto V de color celeste, luego se le aadi solucin
fosfomolibdica +H2O y nos dio un producto VI de color claro
*En el tubo II de le agrego el producto II ms solucin cprica alcalina, esto se puso hervir
y a enfriar y nos dio un producto VII de color naranja, luego se le aadi solucin
fosfomolibdica +H2O y nos dio un producto VIII de color azul.
En el tubo II si hubo reaccin debido que se le aadi el producto I, el cual posee glucosa
y maltosa(degradacin del almidn por la enzima amilasa); estos reducirn el ion cprico a
cuproso tornando a la solucin a una coloracin naranja.
*El control de la actividad enzimtica por los productos finales permite determinar el
Conclusin final de una hidrlisis teniendo como indicador el color que adopta la solucin.
IV CUESTIONARIO
ETAPA A:
3. Elabore una grfica de la accin de una enzima sobre su sustrato, con la energa
de activacin y el estado de transicin.
ALMIDON
AZUCARES REDUCTORES
4. Haga una lista de todos los componentes de un sistema enzimtico y defnalos
SUSTRATO:
Es cualquier compuesto qumico sobre la cual acta una enzima, se une al sitio
activo de la enzima, y se forma un complejo enzima-sustrato,dicho de otra forma, las
enzimas se encargan de catalizar las reacciones qumicas que involucran a su sustrato.
PRODUCTO:
Es la molcula o molculas finales de una ruta metablica, se forman tras la accin
cataltica de la enzima sobre el sustrato.
APOENZIMA:
Parte proteica de una enzima sin ninguno de los cofactores o grupos prostticos
orgnicos o inorgnicos que puede modificar la actividad cataltica
ENZIMAS:
Son protenas complejas que producen cambios qumicos especficos en algunas
sustancias, sin que exista un cambio en ellas mismas. Como por ejemplo: las enzimas
pueden convertir los almidones y azucares en sustancias que el cuerpo pueda utilizar.
COFACTORES:
COENZIMA:
Son cofactores orgnicos no proteicos, termoestables, que unidos a una apoenzima
constituyen la holoenzima o forma catalticamente activa de la enzima.
GRUPO PROSTETICO:
Molcula que se une de manera estable a una enzima mediante fuerzas covalentes, los
ms comunes son los metales.
COFACTORES:
Molcula que se une de manera transitoria y disociable a la enzima, los ms comunes
son los iones metlicos.
5.- Cul es la importancia clnica de la medicin de la actividad enzimtica? De
ejemplo
En el laboratorio es mucho ms prctico medir la actividad de una enzima que medir su
cantidad en el suero. Revela mucho mejor la presencia y el accionar de esta. Por este
motivo la medicin de la actividad enzimtica constituye un poderoso mtodo para
diagnosticar algunas patologas, pero tambin sirve para evaluar el proceso en una
enfermedad y brindar un posible tratamiento.
Las mediciones de enzimas son importantes para el diagnstico y monitoreo de
enfermedades del hgado, pncreas, msculo esqueltico y hueso entre otras,
Por ejemplo:
En el caso de intolerancia a la lactosa, se realiza Test sanguneo de sobrecarga de
lactosa
Primero al paciente se le hace una extraccin de sangre para conocer su glucemia basal
(nivel de glucosa en sangre inicial). Despus,se le suministran 100 gramos de lactosa
en una solucin con agua. Seguidamente pasados 60 y 120 minutos se toman de nuevo
muestras de sangre. Si no se produce la liberacin de la glucosa -por la ausencia de la
accin de la lactasa que debera estar en el intestino- no se produce una absorcin de
la glucosa al torrente sanguneo a travs de la pared intestinal y por tanto no se
incrementa el nivel de glucosa en la sangre y por tanto se puede decir que existe una
intolerancia a la lactosa. Se puede afirmar que existe intolerancia a la lactosa si la
glucemia (nivel de glucosa en sangre) despus de la toma de la lactosa no sube ms de
14,4mg/dl (0,8mmol/l) respecto al valor basal (inicial).
Otro ejemplo que podemos citar es la deficiencia de la enzima glucosa 6 fosfato
deshidrogenasa, en este caso se puede realizar el estudio de dicha enzima en
suspensin eritrocitaria, utilizamos el mtodo de breger que se fundamenta en la
reduccin del azul de metileno por la mencionada enzima, el resultado es la prdida
del color azul en el colorante al final de la reaccin lo que ocurre si hay integridad en
dicha enzima.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
2012
Murray R. ;Bender D; Botham K. HARPER. BIOQUIMICA ILUSTRADA
Invest Biomd [revista en la Internet]. 2012 Jun [citado 2016 Mar 10] ;
script=sci_arttext&pid=S0864-03002012000200009&lng=es.
Domnguez Jos Luis, Fernndez Antonio, Ruiz Sara, Puente Juan Jess,
exploratory study of its feasibility and impact. Rev. esp. enferm. dig. [revista
01082014000600003&lng=es