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Resumen Abstract
La resistencia bacteriana es un problema de salud pblica cau- Bacterial resistance is a public health problem causing high
sante de ndices elevados de morbi-mortalidad hospitalaria. rates of morbidity and mortality in hospital settings. To the
En la medida en que se usan los diferentes antibiticos se extent that different antibiotics are used, bacteria resistant to
seleccionan bacterias resistentes a mltiples frmacos. El de- multiple drugs are selected.The development of new molecu-
sarrollo de nuevas herramientas moleculares de la genmica lar genomic and proteomic tools such as real-time PCR, DNA
y protemica, como el PCR en tiempo real, pirosecuenciacin pyrosequencing, mass spectrometry, DNA microarrays, and
de ADN, espectrometra de masas, microarreglos de ADN bioinformatics allow for more in-depth knowledge about the
y bioinformtica, permite conocer en forma ms estrecha la physiology and structure of bacteria and mechanisms involved
fisiologa y estructura de las bacterias y los mecanismos de in antibiotic resistance.These studies identify new targets for
resistencia a los antibiticos. Estos estudios hacen posible drugs and design specific antibiotics to provide more accurate
identificar nuevos blancos farmacolgicos y disear antibi- treatments to combat infections caused by bacteria. Using the-
ticos especficos para suministrar tratamientos ms certeros se techniques, it will also be possible to rapidly identify genes
que combatan las infecciones producidas por bacterias. Con that confer resistance to antibiotics, and to identify complex
estas tcnicas tambin es posible la identificacin rpida de genetic structures, such as integrons that are involved in the
los genes que confieren la resistencia a los antibiticos y el spread of genes that confer multidrug-resistance.
reconocimiento de las estructuras genticas complejas como
los integrones, que intervienen en la diseminacin de los genes
que producen la multirresistencia.
Palabras clave: resistencia bacteriana; gentica; genmica; Key words: bacterial, resistance; genetics; genomics; proteo-
protemica; -lactamasas; integrones de clase 1 mics; lactamase; integrons
(1) Departamento de Resistencia Bacteriana, Centro de Investigacin sobre Enfermedades Infecciosas, Instituto Nacional de Salud Pblica. Cuernavaca,
Morelos, Mxico.
(2) Centro de Ciencias Genmicas, Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Cuernavaca, Morelos, Mxico.
de un hospital de la ciudad de Guadalajara.16,17 Resulta las bacterias. En la actualidad se han secuenciado 770
de inters que el gen que codifica a esta primera enzima genomas microbianos y 1 287 se encuentran en proceso
(IMP-15) se reconociera en un aislamiento de P. aerugi- (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgi).
nosa aislada de un paciente en un hospital de Kentucky El anlisis de los genomas bacterianos indica que un
(EUA), que previamente haba sido hospitalizado en gran nmero de genes se ha adquirido por transferencia
Mxico.16,18 horizontal. Los genes de un genoma bacteriano son muy
similares respecto de su composicin de bases y patrn
Estructura molecular de la multirresistencia en el uso de codones. Algunas de las secuencias que son
nuevas en un genoma bacteriano, y que se introdujeron
Los genes de resistencia a los diferentes antimicrobianos a travs de transferencia horizontal, presentan variacin
se relacionan con elementos genticos mviles, como en su contenido total de G+C y pueden en ciertos casos
plsmidos, transposones e integrones.19 Estos ltimos diferenciarse de las secuencias propias debido a que
son elementos de expresin gentica que incorporan ge- mantienen las caractersticas del genoma donador. Por
nes sin promotor, de tal modo que se convierten en genes consiguiente, la oportunidad de identificar secuencias
funcionales. En consecuencia, el integrn acta como un conservadas vinculadas con elementos genticos mvi-
casete de expresin para los genes que se inserten y por les no descritos se ha incrementado, como es el caso de
lo general ms de un gen se integra con frecuencia (figu- los integrones y su relacin con los transposones. Estos
ra 1). Los integrones de clase 1 son los ms estudiados y estudios han generado nuevos conocimientos sobre
se los identifica sobre todo en aislamientos clnicos.20-23 la transferencia horizontal de genes y sugieren una
La movilizacin de los casetes se lleva a cabo por la amplia distribucin en el ambiente natural.19,20 A partir
accin de la integrasa, la cual ha generado numerosas del anlisis de la secuencia de genomas bacterianos se
reconfiguraciones y combinaciones de casetes y que han pueden identificar genes y protenas esenciales para la
seleccionado los diferentes antibiticos, de tal manera sobrevivencia de la bacteria (vase un ejemplo ms ade-
que es posible una multirresistencia que se disemina lante) y, a partir de esta informacin, disear nuevos
mediante transposones o plsmidos.24,25 antibiticos que inhiban el crecimiento bacteriano.26
La genmica surge con el desarrollo de tcnicas de Debido a la creciente necesidad de desarrollar nuevas
biologa molecular que permiten la secuenciacin de clases de antibiticos para combatir bacterias resistentes
genomas completos, lo que supone el anlisis del con- a los antibiticos, se ha propuesto la identificacin de
tenido de genes de un microorganismo como el caso de nuevos blancos bacterianos mediante la secuenciacin y
P
segmento 5 conservado casete insertado segmento 3 conservado
Figura 1. Estructura general de los integrones de clase 1. Estn constituidos por una regin variable (casete)
flanqueada por regiones conservadas, denominadas 5CS y 3SC. En la regin 5CS se localiza el gen de la in-
tegrasa, int1, la regin de recombinacin attI y los promotores (P), indicados por las flechas menores. P1 y P2
permiten la transcripcin de los genes que ingresan en la regin variable. En la regin 3CS se hallan los genes
de resistencia a antispticos y desinfectantes qacE1, un gen de resistencia a sulfonamidas suI1. El casete del gen
integrado se muestra en relacin con el elemento de recombinacin denominado 59-pb, que se recombina con el
elemento att1 para la incorporacin del casete (gen de resistencia)
ADN empleado para obtener una pronta genotipifica- a las dos familias principales de ML (VIM e IMP) en
cin de expresin de protenas (p. ej., -lactamasas). Con aislamientos clnicos de P. aeruginosa.
respecto a la protemica, se ha utilizado la espectrome-
tra de masas para identificar polimorfismos y genotipi- Pirosecuenciacin de ADN
ficacin de diferentes protenas en una sola muestra. En
cuanto al rea de la bioinformtica, se ha desarrollado Esta metodologa se basa en la deteccin de la seal
una gran cantidad de bases de datos con informacin quimioluminiscente emitida por el pirofosfato (PPi) li-
biomdica y asimismo se han realizado programas berado por la incorporacin del nucletido en la sntesis
computacionales empleados para establecer las vas de del ADN. Una cmara de deteccin de fotones capta la
evolucin de los genes que codifican a las -lactamasas seal y se traduce como la adicin de un nucletido, lo
de distribucin mundial.31,33 A continuacin se describen que genera una secuencia individual. Esta tcnica se
algunas de estas metodologas empleadas en el estudio usa en la secuencia de genomas bacterianos, con una
de la resistencia bacteriana. capacidad de descifrar 100 millones (10 megabases)
de fragmentos de aproximadamente 250 bases en un
PCR en tiempo real tiempo de cuatro horas.36 Dicha tcnica tambin es una
herramienta rpida y confiable en la identificacin de
Esta metodologa permite la amplificacin y deteccin diferentes alelos, como es el caso del reconocimiento de
simultneas de fragmentos de ADN (gen de inters) genes de -lactamasas tipo CTX-M y OXA en A. bau-
gracias a la emisin de fluorescencia, que se relaciona mannii.37 En este trabajo se diferenciaron tres variantes
de manera directa con la cantidad de ADN amplificado de -lactamasas tipo OXA, incluidos 51 aislamientos
en cada ciclo, lo cual permite establecer y registrar en un ensayo de 20 minutos.38 Este grupo de genes ha
continuamente la cintica de la reaccin.33 Con esta cobrado importancia porque confiere resistencia a los
tcnica es posible determinar la coexistencia de di- carbapenmicos, los antibiticos de ltima eleccin tera-
ferentes alelos de -lactamasas tipo SHV (BLEE y no putica. Ms an, este mtodo se ha empleado para la
BLEE) en un mismo aislamiento clnico. La coexistencia identificacin de mutaciones en el gen gyrA en relacin
de ambos alelos favorece por una parte la resistencia a con la resistencia a la ciprofloxacina en aislamientos de
grandes concentraciones de penicilina debido a la ex- Neisseria gonorrhoeae,39 as como en el reconocimiento de
presin de la enzima TEM-1 (no BLEE) y cefalosporinas la resistencia a macrlidos mediante la deteccin de mu-
de tercera generacin por parte de la enzima SHV-5 taciones en el gen RNAr 23S en cinco diferentes especies
(BLEE). Esto se refleja en un tratamiento fallido con bacterianas.40 La combinacin de las tcnicas de PCR en
este tipo de antibiticos.34 Por otra parte, Hammond y tiempo real y la pirosecuenciacin es una herramienta
colaboradores35 cuantificaron el nmero de copias del molecular muy til en estudios epidemiolgicos para
gen que codifica a la -lactamasa SHV en un mismo la identificacin rpida de genes o mezcla de alelos de
aislamiento clnico. La identificacin de ms de un alelo enzimas que confieren la resistencia a los -lactmicos
en aislamientos clnicos individuales es una norma en aislamientos clnicos productores de BLEE o ML y la
(ms que la excepcin) y existe una relacin estrecha inclusin de genes que confieren resistencia a diferentes
entre los niveles de resistencia a las cefalosporinas y el grupos de antibiticos.
nmero de copias de BLEE, como se ha determinado
para el alelo SHV-12. Estos resultados son recientes e Espectrometra de masas (MALDI-TOF)
indican que el aumento de las concentraciones mni-
mas inhibitorias para combatir a las bacterias aumenta sta es una tecnologa analtica esencial de la protemica,
simplemente al duplicar el nmero de copias de una cuenta con una alta capacidad de anlisis, sensibilidad
BLEE. Como ya se coment, la familia SHV incluye y precisin en la determinacin de las masas molecula-
mutaciones puntuales que les permiten hidrolizar a res de pptidos y protenas y proporciona informacin
las cefalosporinas de tercera generacin; las dos mu- sobre la composicin molecular obtenida de la masa
taciones ms identificadas son gli238ser y glu240lis, molecular. El instrumento que emplea esta tcnica es el
que suelen ser dominantes sobre las mutaciones que no espectrmetro de masas, MALDI-TOF (Matrix-Assisted
confieren la actividad contra las cefalosporinas. El di- Laser Desorption/Ionisation, MALDI), que se basa en la
seo de oligonucletidos especficos para la deteccin generacin de iones por desercin e ionizacin mediante
de estas mutaciones se ha desarrollado y empleado en la induccin por lser. Estos iones se aceleran en un
la tcnica de PCR en tiempo real mediante SYBR-Green campo elctrico y penetran en un tubo de vuelo libre sin
como reactivo de deteccin.35 De modo adicional, esta campo elctrico alguno, lo cual lleva a un ion a alcanzar
metodologa se ha empleado con xito para reconocer al detector. Sus aplicaciones incluyen la elucidacin
estructural de molculas orgnicas e inorgnicas, iden- de consenso en presencia de nucletidos marcados con
tificacin, deteccin y cuantificacin de trazas, metabo- fluorescencia. La genotipificacin discrimin 102 de las
lismo de los frmacos, anlisis de pptidos, protenas y 106 variantes incluidas notificadas en fecha reciente. Este
nucletidos, entre otros. Una reciente aplicacin de esta ensayo ofrece una opcin atractiva para la identificacin
metodologa ha sido la identificacin de variaciones en y vigilancia epidemiolgica de las -lactamasas tipo
las protenas que indican diferencias en la secuencia TEM, as como la deteccin de la diseminacin de los
nucleotdica del gen, por ejemplo sustituciones de una genes de resistencia en el ambiente hospitalario.45
simple base, inserciones y deleciones que se reflejan en
diferencias en las protenas.41 En cuanto al estudio de Bioinformtica
la resistencia bacteriana, existen pocos reportes, si bien
esta tcnica se ha empleado en la deteccin de mutantes La bioinformtica es un campo de la ciencia en el cual
de -lactamasas y las mezclas de diferentes enzimas de confluyen varias disciplinas: biologa, computacin y
la misma familia TEM o SHV, en un mismo aislamiento tecnologa de la informacin. Esta definicin procede del
clnico con resultados ampliamente reproducibles. Este NCBI (Centro Nacional para la Informacin Biotecnol-
estudio identific mutaciones puntuales nuevas y otras gica de EUA) y tiene como objetivo crear bases de datos
ya descritas antes en las publicaciones en 21 diferentes pblicas de libre acceso, crear investigacin en biologa
aislamientos clnicos de K. pneumoniae. La MALDI-TOF computacional, desarrollar programas para anlisis
parece ser una herramienta ideal para el anlisis de de secuencias y difundir la informacin biomdica
polimorfismos de secuencias en genes relacionados con (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Hoy da se dispone
resistencia bacteriana.31 de varias bases de datos (ENTREZ, http://www.ncbi.
nlm.nih.gov/sites/gquery) con informacin biolgica;
Microarreglos de ADN los investigadores pueden acceder a los datos existentes
y suministrar o revisar datos, as como utilizar la infor-
El principio de esta tcnica se basa en una hibridacin de macin para realizar anlisis comparativos entre secuen-
cidos nucleicos. El microarreglo de ADN de alta densi- cias de nucletidos y aminocidos. En el campo de la
dad incluye la inmovilizacin de hasta 400 000 secuencias resistencia bacteriana, la bioinformtica se emplea para
de ADN conocidas incluidas en oligonucletidos que se la asignacin funcional de genes por medio de compa-
sintetizan in situ sobre una superficie de vidrio en un rea raciones con secuencias (ADN o protenas) previamente
no mayor de una pulgada cuadrada; en esta superficie existentes en el GenBank. La base de datos de genomas
se puede explorar la expresin hasta de 13 000 genes de completos provee una gran variedad de cromosomas,
forma simultnea mediante la hibridacin de cDNA mapas fsicos y genticos de los genomas. Esta base est
obtenido de cultivos bacterianos crecidos en condiciones organizada en los siguientes grupos de organismos:
diferentes o productos de PCR marcados en forma dife- Archaea, bacteria, eucaria, virus, viroides y plsmidos.
rencial. La lectura de la informacin obtenida se realiza Por otro parte, diferentes grupos de investigacin han
por medio de sistemas de software especficamente desarrollado programas bioinformticos para resolver
diseados para analizar este nmero de datos que se diferentes interrogantes, como es el caso del programa
obtienen de los microarreglos.42 Los estudios de geno- EvolConnEval, el cual tiene como finalidad establecer
tipificacin de la resistencia a los antibiticos mediante vas de evolucin en diferentes familias de molculas,
microarreglos de ADN son escasos, aunque esta tcnica por ejemplo las BLEE derivadas de la familia SHV, y
se ha utilizado en aislamientos clnicos de micobacterias conocer los mecanismos de movilizacin de estas va-
con resistencia a mltiples frmacos,43 N. gonorrhoeae44 riantes. Gracias a este programa se han establecido dos
y en la genotipificacin de -lactamasas tipo TEM.45 principales vas de evolucin de los alelos SHV, ambas
En este ltimo caso se desarroll un microarreglo con vas evolucionadas a partir del alelo silvestre SHV-1 del
oligonucletidos inmovilizados para la identificacin cromosoma de K. pneumoniae. Las mutaciones encarga-
de polimorfismos de genes con un solo nucletido de das del fenotipo de espectro extendido se seleccionaron
diferencia (SNP); dicho ensayo incluy 96% de los genes en forma independiente y su diseminacin ocurri me-
que codifican a las -lactamasas tipo TEM descritas en diante movilizacin gentica. Asimismo, el desarrollo de
la actualidad, incluidos los fenotipos BLEE y TRI (TEM este tipo de programas bioinformticos permite elucidar
resistente a inhibidores, como el cido clavulnico). El la evolucin y movilizacin de los genes que codifican
ensayo incluy el ADN de aislamientos clnicos de E. a las -lactamasas; en un futuro ser posible predecir la
coli, E. cloacae y K. pneumoniae productores de BLEE. Este generacin de nuevas variaciones de la familia SHV con
ADN se amplific mediante PCR con oligonucletidos la capacidad de hidrolizar nuevos sustratos.46
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