Universidad de Antioqua Facultad de Ciencias Farmacuticas y Alimentarias

Laboratorio de Biotecnologa LJ 20 22

Jaramillo G. Laura M, Ospina , Mauricio, Quintero O. Manuel A 1

1. Estudiantes de Ingeniera de Alimentos

OBJETIVOS

Establecer una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de

Bacillus subtilis.

Analizar la cintica de crecimiento del microorganismo Bacillus Subtilis y el

consumo sustrato de este, empleando el mtodo DNS.
Act. Enzimatica?

MARCO TERICO.

El incremento poblacional que resulta de la multiplicacin celular, es un componente

esencial de la funcin microbiana, y con l se asocian, tanto el crecimiento, como la
generacin metablica; de hecho, las bacterias son mquinas de duplicacin
constante en las que se incluyen reacciones cuya finalidad es la formacin de las
macromolculas necesarias para el ensamblaje de las nuevas estructuras celulares
de sus descendientes. Como en la mayora de las procariotas, el desarrollo de una
clula individual es continuo hasta la divisin en dos clulas nuevas (fisin binaria);
el conocimiento de las caractersticas de crecimiento de un microorganismo es muy
importante, pues con ello se pueden reproducir los procesos industriales y aumentar
los rendimientos propios de los procesos generadores de metabolitos. [1]

El crecimiento microbiano se traduce en un incremento en la masa celular, en donde

la Velocidad de crecimiento, es el cambio en el nmero de clulas o absorbancia
(Abs), experimentado en unidad de tiempo. Durante el crecimiento de los
microorganismos, se generan una serie de productos, llamados metabolitos, que
pueden clasificarse como primarios y secundarios. Los primarios son aquellos que
se forman durante la fase de crecimiento exponencial y adems se forman como
parte del metabolismo energtico de las clulas, mientras que los metabolitos
secundarios se forman casi al final de la fase exponencial de crecimiento y son
compuestos que no hacen parte del metabolismo energtico de la clula. Como
ejemplos de metabolitos se encuentran etanol, proteasas, entre otros. [2]

El microorganismo analizado fue Bacillus Subtilis el cual es un bacilo gram positivo

aerobio formador de esporas y muy ubiquitario (agua, suelo, aire, residuos
vegetales), por esta razn es relativamente fcil que contamine alimentos frescos,
principalmente aquellos que pueden tomar contacto con el suelo, o que se
encuentre en los alimentos de origen vegetal.
De acuerdo a lo anterior, se pretende por medio de este trabajo, presentar los
resultados obtenidos experimentalmente sobre la evaluacin del comportamiento del
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crecimiento microbiano del Bacillus subtilis en fermentacin discontinua y la

evaluacin de la actividad de proteasas; es de anotar que se brindaron las
condiciones adecuadas para la produccin del metabolito secundario de inters, es
decir, las proteasas, que son enzimas que degradan protenas por hidrlisis y se
desarrollan al finalizar la fase exponencial de crecimiento.
Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los
mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes. Este proceso
contina hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante)
y el crecimiento se detenga. El crecimiento tambin puede detenerse por
acumulacin de alguna sustancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.
Para el crecimiento microbiano hay dos aspectos claramente diferenciables: uno
estequiomtrico, por el cual la concentracin final de microorganismos obtenidos
depender de la concentracin y composicin del medio de cultivo, y el otro cintico,
el que dir la velocidad con que se lleva a cabo el proceso.[3]
Ok.

EQUIPOS Y MATERIALES.

Microorganismo Bacillus subtilis

Caldo Nutritivo
Solucin de cido tricloroactico
Casena
Agua Destilada
Carbonato de Calcio
Reactivo de Folin
Reactivo 3,5-dinitrosalicilato

PROCEDIMIENTO.

Para el desarrollo de la prctica, se llevaron a cabo varios procedimientos con

objetivos diferentes. Inicialmente se quera ver la cintica de crecimiento del
microorganismo Bacillus subtilis, luego se quera ver la produccin de metabolitos
secundarios y por ltimo el consumo de sustrato durante el tiempo (DNS).

Crecimiento del microorganismo Bacillus subtilis

1. Alistar 80 mL de medio de cultivo nutritivo y envasar en un erlenmeyer de 100
mL y tapar.
2. Envasar el caldo nutritivo restante en frascos pequeos para utilizar como
blanco.
3. Someter a 15 psi/121C/ 20 min
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4. Tomar 2000 uL del microorganismo Bacillus subtilis

5. Agitar suavemente
6. Transferir al erlenmeyer.
7. Tomar 2000 uL del erlenmeyer y llevar a tubos eppendorf.
8. Leer Absorbancia a 600 nm durante 4 das y congelar los tubos eppendorf.

Cintica de Produccin de Metabolitos Secundarios (Proteasas)

1. De la ltima muestra congelada tomar 300 uL y llevar a un tubo eppendorf.
2. Adicional 500 L de Casena y 300 L de H2O destilada.
3. Llevar bao mara a 37C durante 20 min.
4. Adicionar 500 l de TCA.
5. Centrifugar a 5000 rpm durante 5 minutos
6. Tomar 300 uL del sobrenadante y llevar a un tubo eppendorf.
7. Adicionar 750 uL de Na2CO3 y 150 uL de Reactivo de Folin
8. Llevar a bao mara a 37C durante 30 minutos
9. Leer absorbancia a 660 nm.
Muy bien
Consumo de Sustrato durante el tiempo(DNS)
1. Tomar 500 uL de cada muestra congelada, obtenida en el procedimiento del
crecimiento de microorganismo.
2. Centrifugar 5000 rpm durante 4 minutos
3. Retirar el sobrenadante y transferir a tubos de ensayo
4. Adicionar 500 uL del reactivo DNS
5. Llevar a bao mara a 37C durante 5 minutos
6. Llevar a bao de hielo durante 5 minutos
7. Leer absorbancias a 540 nm.
7. bien Formatted: Indent: Left: 0.25", No bullets or numbering

NOTA: Durante esta prueba se realizaron controles positivos para el crecimiento del
microorganismo Bacillus subtilis (Cultivo nutritivo sin microorganismos), para la
cintica de produccin de metabolitos secundarios con casena y proteasa comercial
como control positivo y casena con agua destilada como control negativo, y para el
consumo de sustrato durante el tiempo (DNS) con reactivo de DNS y glucosa como
control positivo y reactivo de DNS y agua como control negativo.
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CLCULOS Y RESULTADOS

Curva de Crecimiento Microbiano Bacillus subtilis

Tabla N1. Datos para Curva de Crecimiento Microbiano.

Tiempo
Absorbancia a 600 nm
(Horas)
0 0,634
8 1,407
24 1,344
48 1,242
56 0,111

Grfica N 1. Curva de Crecimiento del microorganismo Bacillus subtilis.

Cintica de produccin de metabolitos secundarios (proteasas)

Tabla N2. Datos para determinar la cintica de produccin de metabolitos

secundarios (Proteasa).
Control Positivo Control
Muestra
(+) Negativo (-)
Absorbancia a
1,415 0,985 0,597
660 nm
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o Clculos para la determinacin de concentracin de Tirosina.

1.80
y = 0.0031x + 0.0618
1.50 R = 0.9883

1.20
ABS ( 660nm)

0.90

0.60

0.30

0.00
0 100 200 300 400 500
Concentracin Tirosina (g/mL)

Grfica N2. Curva de calibracin para determinar la concentracin de Tirosina.

y = 0,0031x + 0,0618

0,0618
=
0,0031

Para determinar la concentracin de tirosina en muestra.

1,415 0,0618
= = 436, 52 /
0,0031

Para determinar la concentracin de tirosina en el control positivo (+)

0,985 0,0618
= = 297,81 /
0,0031

Para determinar la concentracin de tirosina en el control negativo (-)

0,597 0,0618
= = 172,65 /
0,0031
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o Clculos para determinar la actividad enzimtica

. ()
. =
(min) ()

Tabla N 3. Datos para la determinacin de Actividad enzimtica

Volumen de Concentracin Factor de Tiempo de Volumen de

la solucin de Tirosina Conversin la reaccin la enzima
(mL) (g/mL) (, , ) (min) (mL)
Muestra 436,52
Control
297,81
Positivo (+) 0,8 4 20 0,3
Control
172,65
Negativo (-)

Para determinar la actividad enzimtica en muestra.

(436,52 ) 0,8
. = 4 = 232,81
20 0,3
Para determinar la actividad enzimtica en el control positivo (+)

( 297,81 ) 0,8
. = 4 = 158,83
20 0,3

Para determinar la actividad enzimtica en el control negativo (-)

( 172,65 ) 0,8
. = 4 = 92,08
20 0,3

Tabla N 4. Resultados de la actividad enzimtica. Muy bien.

Muestra Control Positivo (+) Control Negativo (-)
Actividad
232,81 158,83 92,08
Enzimtica de las
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Proteasas ()

o Clculos para la determinacin de consumo de sustrato (Glucosa)

= 0,4731 + 0,0498*

*Ecuacin obtenida a partir de la curva de calibracin de concentracin Vs Absorbancia.

Tabla N5. Datos para la determinacin de consumo de sustrato.

Tiempo (Horas) Absorbancia a 540 nm
0 0,342
8 0,306
24 0,226
48 0,169
56 0

Para determinar la concentracin de glucosa respecto a la absorbancia.

Tiempo 0

= 0,4731(0,342) + 0,0498 = 0,211 /

Tiempo 8

= 0,4731(0,306) + 0,0498 = 0,194 /

Tiempo 24

= 0,4731(0,226) + 0,0498 = 0,156 /

Tiempo 48

= 0,4731(0,169) + 0,0498 = 0,129 /

Tiempo 56

= 0,4731(0) + 0,0498 = 0,0498 /

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Tabla N6. Datos para determinar el consumo de sustrato.

Concentracin de glucosa
Tiempo (horas)
(g/L)
0 0,211
8 0,194
24 0,156
48 0,129
56 0,0498

Concentracin de glucosa (g/L) Vs Tiempo

0.25
Concentracin de Glucosa (g/L)

0.211
0.2 0.194

0.15 0.156
0.129
0.1 Concentracin de glucosa
(g/L)

0.05 0.0498

0
0 10 20 30 40 50 60
Tiempo (Horas)

Grfica N3. Consumo de Sustrato (Glucosa) Vs Tiempo

Muy bien.
ANLISIS DE RESULTADOS

Segn los resultados obtenidos para la curva de crecimiento se logra evidenciar que
el microorganismo Bacillus subtilis presento una tendencia igual a la tendencia
estndar, sin embargo, este microorganismo no tuvo la fase de latencia o no se
logr evidenciar, all ocurre la adaptacin del microorganismo al medio, puede ser
que esto no ocurri porque el medio es bastante nutritivo o tiene las enzimas
necesarias para su reproduccin, por lo tanto, el microorganismo paso
inmediatamente a duplicarse exponencialmente, posterior a esto se dio la fase
estacionaria en donde el crecimiento de las clulas es proporcional a la muerte de
las mismas, por lo tanto, aqu se ve un crecimiento constante de ellas, esta fase
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tuvo un tiempo aproximado de 38 horas; a las 10 horas siguiente empez la fase de

letalidad en donde el Bacillus subtilis ya se haba consumido el sustrato y no tienen
ms nutrientes por lo tanto mueren.

De acuerdo a las actividades enzimticas se evidenci que la muestra tuvo una

mayor actividad enzimtica respecto al control tanto positivo como negativo, en
consecuencia hubo una mayor produccin de proteasas durante la etapa final de
crecimiento exponencial del Bacillus subtilis, lo que indica que si se hidrolizaron las
protenas dando tal resultado la concentracin de aminocidos como la tirosina, y
esta tuvo un aumento elevado en la muestra. Los datos reflejan este resultado,
aunque es difcil de creer, recuerdan la prueba cualitativa de los tubos de ensayo y
la protena precipitada? Quiz hubo un error de rotulacin.

Tal como se observa en la grfica N3, lo que se interpreta es que el Bacillus subtilis
si consumi la fuente de alimentacin (Sustrato - Glucosa) hasta el punto de una
reduccin casi total de la concentracin de la misma, lo que significa que a partir de
ese momento el microorganismo empez su fase de muerte por no tener demanda
de la fuente de carbono (Glucosa) y esto es lo que se espera en un anlisis de
consumo de sustrato. Muy bien

CONCLUSIONES.

Se estableci la curva de crecimiento para el microorganismo Bacillus subtilis

donde evidenciamos las diferentes etapas de crecimiento del
microorganismo.
Se logr analizar que la fuente de carbono-Glucosa si era la adecuada para
el crecimiento de este microorganismo y este mismo produce proteasas
suficientes para desnaturalizarlas.
Act. Enzimatica?

BIBLIOGRAFA.

1. Montoya Villafae, Hugo H. Microbiologa bsica para el rea de la salud y afines.

Facultad de Medicina, Universidad de Antioquia, Medelln, 2000, pginas
2. Clase II, Crecimiento microbiano, docencia udea, Microbiologa, Universidad de
Antioquia, Disponible en Internet
http://docencia.udea.edu.co/bacteriologia/MicrobiologiaAmbiental/microbiologia_2.pdf.
3. Alquicira P. Lizbeth. Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. Trabajo
para obtener el grado de especialista en biotecnologa. Determinacin de la especificidad de
proteasas fngicas en la hidrlisis de protena.
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En general un muy buen informe.

Calificacin informes corrientes % nota

objetivos propuestos 5 4
Marco terico corto 10 10
procedimientos realizados (incluye equipos y materiales) 20 20
resultados( datos tabulados y clculos con modelo de clculo) 20 20
anlisis de resultados obtenidos 20 18
conclusiones, ( respecto a objetivos) 20 17
bibliografa 5 5
Total 100 4,7
Preguntas y/o consultas de la prctica
Resultado Final 4,7