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SECUENCIACIN

Ing. Isaac Armendriz


2017
Qu es secuenciacin?
Los genomas son secuenciados, por
ejemplo en 2003 despus de varios
esfuerzos, el genoma humanos fue
secuenciado. Pero que significa
secuenciar un genoma?
Es el proceso por el cual se
determina la secuencia de
nucletidos (A,G,T y C) en un
fragmento de ADN. En estos das con
los materiales adecuados es un
proceso sencillo.
Secuenciacin Sanger
Est tcnica fue desarrollada por el
bioqumico Britnico Fred Sanger en 1977.
Se usa aun en la actualidad para secuenciar
piezas de ADN de hasta 900 pb, utilizando
una tcnica que se conoce como
terminadores de cadena.
Est tcnica fue utilizada para secuenciar el
genoma humano en 2003, ahora hay
nuevas tcnicas para secuenciar genomas,
pero Sanger es un muy utilizada en
investigacin.
Como se realiza la secuenciacin Sanger?

Se basa en hacer varias copias del ADN objetivo, tiene el


mismo principio de una PCR.
Se necesita polimerasa, un solo primer, 4 nucletidos
dNTPs (deoxinucletidos) y el ADN a ser secuenciado.
MAS OTRO INGREDIENTE IMPORTANTE: Dideoxi-
nucletidos (ddNTPs), cada uno marcado con un
fluorforo de diferente color.
ddNTPs o Terminadores

Tienen la misma estructura


que un dNTP con la
diferencia de que no tienen
grupo hidrxilo en la
posicin 3, el cual funciona
como enganche para los
dems nucletidos.
Se divide en dos partes:
SECUENCIACIN CCLICA

SECUENCIACIN AUTOMTICA
CROMATOGRAMA
USOS Y LIMITACIONES
La secuenciacin Sanger ofrece secuencias de alta calidad, de
una longitud aproximada de 900 pares de bases. Es usada
paa secuenciar fragmentos individuales de ADN obtenidos
por PCR.
Es cara e ineficiente para secuenciar a larga escala, es decir
genomas.
Por tal motivo se han diseado nuevas tcnicas de
secuenciacin, conocidas como: Secuenciacin de siguiente
generacin.
SECUENCIACIN DE SIGUIENTE GENERACIN
(NEXT GENERATION SEQ)
Hay diferentes variaciones de este tipo de secuenciacin, pero se
distingue y mejor a la secuenciacin tipo Sanger en los siguientes
aspectos:
Paralela: Varias reacciones al mismo tiempo
Micro Escala: Reacciones del tamao de un chip de computadora
Rpida: Reacciones en paralelo
Bajo Costo
Menor rango de lectura: Puede leer secuencias inferiores a 100 bp
SECUENCIACIN DE SIGUIENTE GENERACIN (NGS)

Es como hacer varios ciclos de secuenciacin Sanger


en una sola reaccin o en paralelo.
De esa manera grandes cantidades de ADN pueden
ser secuenciadas en una sola reaccin.
Por ejemplo secuenciar el genoma humanos en 2001
cost 100 millones de dlares y tomo varios aos. Hoy
costara 1245 dlares y se puede hacer en menos de
una semana.
TCNICAS MAS USADAS DE NGS

Illumina Solexa
Roche 454
Ion Torrent: Proton Sequencing
SOLiD Sequencing
Pacific BioScience Technology

Estas tcnicas permiten secuenciar ADN y ARN mas rpido y


econmico que la tcnica de Sanger y han revolucionado la
investigacin molecular.
ILLUMINA SOLEXA
El ADN objetivo es fragmentado
en tamaos de 100 a 150 pb.
En una placa se disean
adaptadores parecidos a primers
donde los ADN objetivo van a
unirse.
Se realiza reacciones de PCR con
nucletidos fluorescentes.
ILLUMINA SOLEXA
Mientras los nucletidos se incorporan y producen una seal
fluorescente un detector va tomando fotografas.
En cada ciclo se remueve los nucletidos y se elimina la fluorescencia
para evitar que la primera seal contamine la siguiente fotografa.
ILLUMINA SOLEXA
SECUENCIACIN 454 DE ROCHE
Puede secuenciar mas muestras a mas
longitud que Illumina.
El ADN es fragmentado en tamaos de 1
kb. Se aaden adaptadores en camas, un
fragmento por cama y se amplifican como
PCR.
Cada cama ocupa un pocillo en una placa,
es decir que cada pocillo tiene varias
copias de PCR de un mismo fragmento.
Solo un nucletido fluorescente se agrega
por cada reaccin.
SECUENCIACIN 454 DE ROCHE
Despus de la incorporacin, se lava la reaccin y se aade el
siguiente nucletido y se repite as el ciclo con los 4 nucletidos, cada
uno al incorporarse emitir una seal fluorescente. Generando una
grfica de computadora con el orden de la secuencia.
SECUENCIACIN ION TORRENT
El principio de esta tcnica se basa en que
la adicin de un dNTP al ADN libera un
ion de hidrgeno H+.
El ADN se fragmenta en 200 pb, se
aaden los adaptadores en las camas y se
amplifica por PCR de emulsin.
Al igual que 454 cada nucletido es
lavado y cambiado, el equipo detecta el
cambio de pH causado por la liberacin
de cada ion de H y se determina que
nucletido fue agregado.
SECUENCIACIN ION TORRENT
SOLiD (Applied Biosystems)
SOLID: Small Oligonucleotide Ligation and Detection
Aprovecha la actividad de la enzima ligasa para detectar e
incorporar dNTPs. No usa polimerasa.
Fragmentos de ADN son ligados con adaptadores y
amplificados por PCR de emulsin.
Debido a que son ligadas las bases son detectadas en pares.
Altamente especfica, puede secuenciar de 2 a 4 Gb.
Equipos de NGS

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