Efecto del pH sobre la actividad de la -amilasa

David Cabrera

Laboratorio de Ingeniera de las Enzimas, Facultad de Ciencia e Ingeniera en Alimentos, Universidad Tcnica
de Ambato

Resumen

En el presente ensayo se emple -amilasa, para determinar la influencia que tiene el pH sobre la
actividad enzimtica de la - amilasa de soya, condicin que afecta en su gran mayora a la
estructura terciaria desestabilizando la enzima lo cual provoca que su velocidad enzimtica
disminuya de forma muy notoria; adems mediante la exposicin de la enzima a pH que se
encontraban dentro de un rango de 3 a 6,5 se logr determinar el pH ptimo al cual la enzima
puede trabajar sin ningn problema y con una alta eficiencia el mismo que result tener un valor
de 5,313 resultado que se pudo determinar mediante la derivacin de la ecuacin con la velocidad
promedio de formacin de maltosa que en este caso se utiliz como estndar.
Palabras Clave: -amilasa, almidn, maltosa, actividad, pH.

Introduccin

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que catalizan reacciones qumicas, siempre que
sean termodinmicamente posibles: una enzima hace que una reaccin qumica que es
energticamente posible, pero que transcurre a una velocidad muy baja, sea cinticamente
favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la presencia de la enzima. En estas
reacciones, las enzimas actan sobre unas molculas denominadas sustratos, las cuales se
convierten en molculas diferentes denominadas productos. Casi todos los procesos en las clulas
necesitan enzimas para que ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por
enzimas se las denomina reacciones enzimticas (Ruiz et.al, 2001).
La actividad enzimtica depende de la existencia de una estructura apropiada del sitio activo, el
cual est compuesto por un nmero reducido de residuos de aminocido prximos en la
estructura tridimensional de la protena pero usualmente alejados en la estructura primaria. Por
tanto, cualquier agente que promueva el desplegado de la protena separar los residuos que
constituyen el sitio activo y reducirn o destruirn su actividad biolgica. Condiciones adversas de
temperatura, pH o solvente y la presencia de sustancias caotrpicas, metales pesados y agentes
quelantes pueden producir esta prdida de funcin distorsionando la configuracin apropiada del
sitio activo (Espitia, 2009).
Las enzimas poseen grupos qumicos ionizables (carboxilos -COOH; amino -NH2; tiol -SH; imidazol,
etc.) en las cadenas laterales de sus aminocidos. Segn el pH del medio, estos grupos pueden
tener carga elctrica positiva, negativa o neutra. Como la conformacin de las protenas depende,
en parte, de sus cargas elctricas, habr un pH en el cual la conformacin ser la ms adecuada
para la actividad cataltica. Este es el llamado pH ptimo. La mayora de las enzimas son muy
sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas dcimas por encima o por debajo del pH
ptimo pueden afectar drsticamente su actividad. As, la pepsina gstrica tiene un pH ptimo de
2, la ureasa lo tiene a pH 7 y la arginasa lo tiene a pH 10. Como ligeros cambios del pH pueden
provocar la desnaturalizacin de la protena, los seres vivos han desarrollado sistemas ms o
menos complejos para mantener estable el pH intracelular: Los amortiguadores fisiolgicos.
(Gonzlez, 2012).

El objetivo de este trabajo es determinar la influencia del PH en la -amilasa a diversas

concentraciones y estimar el PH ptimo.

Materiales y Mtodos:

Reactivos Materiales

- cido actico 0,05 M - Medidor de pH o papel para medir pH

- Acetato de sodio 0,05 M
- cido ctrico 0,05 M
- Fosfato dibsico de sodio 0,1 M
- Almidn soluble de papa
- Solucin de DNS
- Pipetas de 1 ml y 5ml
- Plancha de calentamiento con agitacin
- Agitador magntico
- Bao Mara mantenido a 20 ( 25)
1 C
- Bao Mara a ebullicin
- cronmetro
- Tubos bacteriolgicos con tapa de 20 ml
- Tubos de vidrio de 15 ml
Mtodo

Preparacin del tampn acetato de sodio 0,02M de pH 4,5 (100 ml):

Preparar las soluciones de cido actico y acetato de sodio 0,02M y mezclarlas hasta conseguir
que el pH de la mezcla sea de 4,5 (relacin de mezcla aproximada de 1:1).

Soluciones tampn citrato-fosfato de pH 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 y 7,0 (50 ml).

Mezclar las soluciones de cido ctrico (0,05 M) y fosfato dibsico de sodio (0,1 M) de modo que el
pH final de cada una de ellas alcance los valores antes indicados.

Soluciones de almidn al 1% (20 ml) en cada uno de los tampones citrato-fosfato

Pesar la cantidad de almidn soluble correspondiente y suspender en 20 ml de tampn citrato -

fosfato, calentar la suspensin bajo agitacin y hervir durante 3 min. Enfriar y restituir el agua
evaporada. Medir el valor de pH de cada sustrato (valor real que ser usado para la grfica y el
clculo del pH ptimo).

Solucin de enzima 1/40 en tampn acetato (10 ml)

Preparar la dilucin final de la enzima por diluciones sucesivas (1 dil 1/10; 3,0 mL) y (2 ; 10 mL).

Determinacin de la actividad inicial a 20

Colocar en una gradilla 36 tubos bacteriolgicos perfectamente lavados y marcados con el valor de
pH, 3 tubos por cada valor de pH ms un blanco. Aadir a cada tubo 0,4 ml de la solucin de

ml de la solucin de enzima a cada una de las rplicas, dejar que la reaccin proceda durante 3
minutos y detener la reaccin con la adicin de 0,5 ml de solucin de DNS. Mezclar bien, hervir por
5 minutos, enfriar, aadir 5 ml de agua destilada y leer la absorbancia a 540 nm frente a un blanco
preparado invirtiendo el orden de adicin de los reactivos (enzima, DNS (mezclar bien) y sustrato).

Preparacin de la curva estndar de Maltosa

Utilizar los valores de absorbancia y concentraciones de la curva estndar de maltosa de la

prctica 1.
Resultados

Presente una tabla que recopile los valores de Absorbancia, concentracin de maltosa, velocidad de
formacin de maltosa, velocidad relativa en porcentaje y la desviacin estndar a los distintos valores de pH.

Obtenga el perfil de pH (Grfico de % velocidad relativa vs pH) e incluya la ecuacin de regresin que mejor
se ajuste al grfico.

Generalmente, la ecuacin obtenida es de segundo orden. En este caso, derive la expresin, iguale a cero y
obtenga el valor mximo, este pH constituye el ptimo.

Grfica #1: Estndar de maltosa

0.900
0.800 y = 0.3885x - 0.0071
R = 0.9983
0.700
0.600
Absorbancia

0.500
0.400
0.300
0.200
0.100
0.000
-0.1000.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000 2.5000
[maltosa] (mg/ml)

Elaborado por: David Cabrera

Fuente: Laboratorio ingeniera de las enzimas 2015

Clculos

NOTA: En esta ocasin se va a estimar velocidad inicial relativa, en porcentaje, a partir de las
velocidades iniciales de hidrlisis del almidn soluble de papa, obtenidos a partir de la
concentracin de maltosa producida luego de 3 minutos de re accin:

dP [Malt] 3m in [Malt] 0m in [Malt] 3m in

V0
dt 3 min 0 min 3 min
Calcule las concentraciones de maltosa a partir de la curva estndar utilizando las lecturas de
absorbancia correspondientes y determine con ellas las velocidades inciales de hidrlisis.

Con cada valor de velocidad cuantifique la actividad relativa dividiendo la velocidad de formacin
de maltosa a cada uno de los valores de pH para la velocidad mxima alcanzada y exprese en
porcentaje. Determine el valor medio y calcule la desviacin estndar.
VpH
A relativa (%) *100
Vmx
Elabore el grfico de A relativa media vs pH (NOTA: incluya en el grfico las barras de error) y
determine el valor de pH ptimo por regresin a partir de la curva.

Discusin

Reporte el valor de pH ptimo. Compare con valores reportados en bibliografa para esta enzima.
RECUERDE utilizar bibliografa existente en la biblioteca de la FCIAL tanto fsica como virtual.

En el desarrollo de la prctica se determin la influencia del pH sobre la actividad enzimtica de la

- amilasa de soya, estimando as el pH ptimo para el cual dicha enzima acte de manera
eficiente al emplear como sustrato al almidn. El efecto del pH en la actividad enzimtica es un
factor muy importante que debe ser tenido en cuenta puesto que la intensidad mxima de la
actividad de la enzima, ocurre en el pH ptimo, con rpida disminucin de la actividad a cada lado
de este valor de pH. La actividad ptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9.

El pH ptimo de una enzima puede guardar relacin con cierta carga elctrica de la superficie, o
con condiciones ptimas para la fijacin de la enzima a su sustrato. Cuando hay un exceso de iones
hidrogeno, las enzimas los unen a sus molculas y ante un dficit los ceden.

Este cambio tiene una doble consecuencia sobre la molcula. Como todas las protenas, las
enzimas desempean su funcin por los residuos de aminocidos; algunos confieren a su
superficie una distribucin de cargas elctricas. Cuando la concentracin de iones hidrogeno es
muy baja en comparacin con la concentracin optima, la molcula los cede desapareciendo
cargas positivas o apareciendo cargas negativas en su superficie. Cuando se cambia las cargas
elctricas en los residuos de aminocidos se alteran los lazos de unin dentro de la molcula
variando su acomodo tridimensional con recuperacin de la actividad de la enzima (Vsquez,
2007). El producto de la reaccin fue la maltosa que al ser cuantificada y con la curva obtenida, se
calcul el pH ptimo, y su valor fue de 5,31; adems en cuanto a la actividad relativa que dio como
15,58% de actividad, dando a conocer que la actividad de la beta amilasa empleada a pH 5,31
trabaja de forma adecuada aunque sta no sea muy eficiente en cuanto al valor general de
actividad relativa obtenida.
Adems en el desarrollo de la prctica se descart los trabajos experimentales a pH 4,5 y 5.5 ya
que al graficar la actividad enzimtica vs. pH estos dos valores mostraban picos con errores a
simple vista ya que estaban lejos de la curva generada, adems con lo realizado se logr bajar el
margen de error de la experimentacin. La relacin entre el pH y la actividad depende del
comportamiento cido-base del enzima y del propio sustrato. Sustrato y enzima (centro activo)
pueden contener grupos funcionales cidos y bsicos, siendo su grado de disociacin dependiente
del pH, lo que determinar, entre otros aspectos, la conformacin de la protena, la capacidad de
unin del sustrato al centro activo del enzima (Km) y la capacidad de transformacin del sustrato.
Los estudios cinticos a diferentes valores de pH nos proporcionan informacin sobre el
mecanismo cataltico de los enzimas y la naturaleza de los aminocidos ms directamente
implicados en la catlisis (Vsquez, 2007).

Conclusiones

El pH afecta directamente a la actividad enzimtica de la - amilasa de soya ya que este

factor influye sobre la estructura terciaria de la enzima lo cual se ve reflejado en la
disminucin de la velocidad enzimtica, por lo cual se necesita encontrar e l pH ptimo al
cual esta enzima trabaja de manera eficiente y para esto se la someti a pruebas dentro
de un rango de pH entre 3 y 6,5. Para este anlisis se prepar una solucin con la enzima y
el sustrato que en este caso fue el almidn, a la cual se le someti a los pH dentro del
rango antes mencionado hasta encontrar el pH ptimo el mismo que result ser de 5,313
es decir en este punto la enzima alcanza su mayor actividad cataltica por lo que su
velocidad de reaccin aumenta conforme los valores se ace rcan a este pH, este valor se
pudo determinar mediante la derivacin de la ecuacin con la velocidad promedio de
formacin de maltosa.
Se determin de manera experimental la actividad de la -amilasa mediante diversas
concentraciones de enzima, que de la misma manera sirvieron para verificar la diferencia
entre las velocidades de reaccin, empleando como sustrato almidn soluble, mediante la
estimacin de la cantidad de azucares reductores formados con DNS y mediante la
derivacin de la ecuacin para cuantificar la actividad de la -amilasa
Se evaluaron y compararon factores que inhiben la velocidad en la cintica enzimtica ya
que la concentracin de complejos enzima-sustrato depende, de las concentraciones de
los componentes del complejo presentes en el medio.
Cuestionario

a).- Seale que precaucin se ha tomado en el trabajo experimental de determinacin del pH

ptimo para no mezclar el efecto de la estabilidad de la enzima a los diferentes valores de pH
con la estimacin de la influencia del pH en la velocidad de reaccin.

-Se debe emplear un buffer a un pH indicado para diluir la enzima antes de realizar la estimacin
de la actividad, puesto que se puede alterar la estabilidad enzimtica.

-Se debe colocar con la mayor exactitud posible las cantidades de enzima como de buffer para
obtener una medicin de actividad lgica.

-Se debe aplicar la variacin de pH sobre el sustrato de la enzimas permitir distinguir la

disminucin de la actividad a determinado pH, evitando desestabilizar a la enzima

(Snchez, 2008).

b).-Cite al menos un ejemplo de enzima que acte sobre un sustrato que se ioniza. Mencione el
nombre del sustrato.

La Seretonina N-acetiltransferasa cataliza la conversin de la seretonina (SUSTRATO) en N -

acetilseretonina, generando un proceso de ionizacin al emplear al acetil-CoA como donador de
los grupos acetilo (Fernndez, 2009).

c).- Cuntos residuos ionizables tiene una enzima cuyo grfico de Velocidad relativa vs pH tiene
forma de campana?

Una enzima tiene 2 residuos ionizables para tener una variacin en forma de campana, los mismos
que tienen la capacidad de ionizarse o protonarse dependiendo de las condiciones del medio en el
que se hallan (Snchez, 2008).
d).- Cules son los residuos de aminocido presentes en el sitio activo de la -amilasa?

En el sitio activo de la -amilasa existen dos residuos localizados en el centro activo del enzima, en
la mayor parte de los casos asprtico o glutmico. Uno de ellos acta como donador de un protn
y el otro como nuclefilo/base, para estabilizar la estructura. (Navarro, 2009)

e).- Por qu se utiliz en este estudio tampn citrato-fosfato en lugar de tampn acetato de
sodio para preparar los sustratos?

Se utiliz tampn citrato fosfato porque el acetato de sodio tiene un rango de pH pequeo que va
de 3,6 a 5,8; mientras que el tampn citrato fosfato tiene un rango de pH ms amplio que va de
2,8 a 7,0, y nos permite trabajar en un rango acido-neutro, puesto que su pH ptimo de trabajo es
de 5,2, lo cual es el indicado para trabajar con la beta amilasa de soya (Batista, 2009).

BIBLIOGRAFA

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Espitia, C. 2009. Determinacin de la concentracin de alfa y beta amilasas comerciales en la

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Fernndez, P. 2009. Actividad Enzimtica.

Disponible en: http://www.rincondelasciencias.com/actividad%20enzimatica.pdf

Gonzlez, J. 2012. Regulacin de la actividad enzimtica.

Disponible en: http://www.ehu.es/biomoleculas/enzimas/enz22.htm

Navarro, Diana. 2009 Modificacin funcional de la glucoamilasa de Sacharomyces

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http://theindustrialenzymologist.blogspot.com/2009/12/modificacion-funcional-de-la.html

Ruiz, R.; Vsquez, J. 2001. "Hidrlisis Enzimtica de Desechos del Umar (Poraqueiba sercea
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Snchez, L. 2008. Actividad Enzimtica. Tercera edicin. Editorial Hilther Bros. Madrid-Espaa. pg.
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Vsquez, R. 2007. Cintica Qumica. Primera Edicin. Editorial Reverte. Mxico. pg. 216-218.