OBJETIVO

Establecer una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de Bacillus subtilis.

Establecer el grado de relacin entre la produccin metablica secundaria de proteasas y las

diferentes fases de una curva de crecimiento microbiano.

INTRODUCCIN

Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos

comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo
para proliferarse, en nuevos microorganismos. Este proceso contina hasta que algn
nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene.
Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de alguna substancia inhibidora
formada por los mismos microorganismos. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables
que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiomtrico, por el cual la concentracin final
de microorganismos obtenidos depender de la concentracin y composicin del medio de
cultivo, y el otro cintico, el que dir la velocidad con qu se lleva a cabo el proceso.
*Requerimiento de oxgeno En los microorganismos aerobios la obtencin de energa est
ligada a la presencia de oxgeno. En efecto, ste es aceptor final de los electrones provenientes
de la cadena de citocromos donde se genera abundante ATP (adenosina trifosfato). Las
molculas de ATP aportarn luego la energa necesaria para las reacciones de sntesis con las
que el organismo se "fabricar" a s mismo, y la requerida para el mantenimiento celular. *
Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento Los microorganismos pueden crecer en
una variada gama de pH que va desde pH= 2 para los acidfilos hasta pH = 11 para alcalfilos.
En general los microorganismos que toleran pH cidos no toleran pH alcalinos y viceversa.
Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante conocer
cul es el pH ptimo para el crecimiento. De la misma surge claramente que en general los
hongos tienen un pH ptimo cercano a 5 mientras que para bacterias se da alrededor de pH =
7. Durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio de cultivo,
normalmente hacindolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en las medias
substancias que acten como tampn (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje del ptimo. El
efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reaccin qumica
individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo
que un incremento de sta resulta en una mayor velocidad de reaccin. Esto se traduce en un
aumento de pH con la temperatura. Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura
inactivan las enzimas que catalizan las reacciones. Como regla general, los microorganismos
psicrofilos poseen temperatura ptima entre 10 y 20 C, los mesfilos entre 30 y 40 C y,
finalmente, los termfilos entre 50 y 60 C. La necesidad de mantener la temperatura de
cultivo en el valor ptimo, hace que los biorreactores (fermentadores) cuenten con
dispositivos apropiados para tal fin. La curva del crecimiento bacteriano resulta de la
representacin grfica de la determinacin peridica del nmero de clulas viables por
mililitro que existen en un lquido inoculado con clulas microbianas provenientes de un
cultivo que ha crecido previamente hasta la saturacin. Fases de crecimiento: Cuando
introducimos una poblacin de microorganismos en un medio de cultivo lquido, cada
organismo presenta cuatro fases de crecimiento tpicas y estas son las siguientes: - Fase de
latencia: Este es el periodo de adaptacin, gran actividad metablica, las clulas no se dividen
(min-hrs) - Fase Exponencial o logartmica (log): Aqu hay aumento regular de la poblacin que
se duplica a intervalos regulares de tiempo - Fase Estacionaria: Cese del aumento por
agotamiento de los nutrientes, por acumulacin de txicos; esto quiere decir ( # de clulas
nuevas=# de clulas que mueren) - Fase de declinacin o muerte: El nmero de clulas que
mueren es mayor al nmero de clulas que se dividen o son viables.

MATERIALES Y MTODOS

Microorganismo

Bacillus subtilis, caldo nutritivo, solucin de cido tricloroactico, casena (leche),

espectrofotmetro, agitador orbital, centrfuga, bao de agua, erlenmeyer (250 mL), tubos de
ensayo (3), pipetas estriles de 1 y 5 mL, papel milimetrado. Curva de Crecimiento Una vez
estril el medio de cultivo enriquecido, y con ayuda de un asa de cultivo, se tom una muestra
del microorganismo Bacillus subtilis y se transfiri al tubo de ensayo dispuesto con los cinco
mililitros del medio de cultivo (caldo nutritivo). Alcanzada la fase exponencial este volumen
completo se utiliz como inculo en erlenmeyer y se incub a 28 C con una agitacin orbital
permanente de 100 rpm. Cada da se tom aproximadamente 2 mL de medio de cultivo y se
cuantific la absorbancia con ayuda de un espectrofotmetro a 560 nm, utilizando como
blanco el medio de cultivo estril que se almacen en los frascos pequeos. Evaluacin de la
actividad enzimtica Para determinar la produccin de proteasas durante el tiempo del cultivo,
se tomaron muestras cada da, durante 5 das las cuales fueron sometidas a fuerza centrfuga
(4.000 rpm, 10 minutos), y se realiz la siguiente prueba. Se llenaron 3 tubos de ensayo con 1
mL de solucin de casena (1ml de leche/100ml de agua) y se agreg: Tubo 1 + 1 mL de agua
(blanco), Tubo 2 + 1 mL de medio de cultivo microbiano libre de clulas, Tubo 3 + 1 mL de
medio de cultivo microbiano libre de clulas, previamente sometido durante 2 minutos a
100C. Por ltimo se llevaron los tres tubos a bao de agua (30C) durante 30 minutos y se
adicion 1ml de cido tricloroactico para observar la precipitacin.

RESULTADOS Y ANLISIS

Curva de Crecimiento: Se evidencian tres fases de la curva de crecimiento de microorganismos

(Tabla1) - (Grafica 1). Adems de la pronunciacin en la curva de crecimiento en la parte final
de la fase exponencial, caracterstica especifica en la obtencin de metabolitos secundarios
como las proteasas.

Esta curva y grafica es lo que tienen que hacer

- Cuando una poblacin microbiana se inocula en un medio fresco, el crecimiento ocurre
despus de un cierto tiempo, ac las clulas se estn adaptando a su nuevo ambiente, por lo
que se encuentran empobrecidas en cuanto a metabolitos y enzimas necesarias para reiniciar
el crecimiento, esta fase es la fase de latencia. Una clula adaptada al medio inicia un proceso
de crecimiento sostenido, sintetizan nuevo material gentico a una tasa constante, una clula
se divide en dos, estas en otras dos y as sucesivamente, la fase exponencial del cultivo de
Bacillus subtilis se observa entre los das 0 y 1 aproximadamente, en este periodo es donde se
observa un aumento considerable de clulas, es el periodo de mayor multiplicacin celular.
Cuando el sustrato o medio nutritivo se agota las clulas llegan a una fase denominada fase
estacionaria, al no haber suficiente alimento para seguir su multiplicacin este cesa y ocurre
un periodo de mantenimiento celular, este fase tambin puede suceder por un metabolito o
producto de desecho de las clulas que se acumula en el medio alcanzando una concentracin
inhibitoria de la fase exponencial, en nuestro caso se puede considerar una fase estacionaria
entre los das 2 y 3. Entre los das 3 y 4 se observa otro aumento, esto podra deberse a una
fase estacionaria mxima donde algunas clulas alcanzan a multiplicarse, en esta fase tambin
pueden morir algunas clulas, la muerte celular no indica destruccin fsica por lo que en esta
fase estacionaria mxima cuenta tanto la masa de clulas muertas como vivas arrojndonos
este cambio considerable en la medicin de la absorbancia. Finalmente cuando las clulas no
encuentran ms sustrato en el medio y no pueden mantenerse, comienza la fase de
declinacin o muerte, en la prctica no se alcanza a ver esta fase ya que tal vez se requiere de
ms tiempo para que las clulas pasen de la fase estacionaria a la fase de declinacin.

-Evaluacin de la actividad enzimtica; Durante la fase exponencial las clulas producen

metabolitos, en este caso se hizo la prueba de proteasa que es un metabolito producido por la
bacteria Bacillus subtilis

Se puede observar que en los tubos con sobrenadante y leche que incubamos a 37 grados
centgrados no hay precipitacin debido a la hidrolisis de casena a aminocidos, partculas
ms pequeas, esto por efecto de las proteasas presentes, mientras que en los tubos con
sobrenadante que calentamos a 100 grados centgrados se present una precipitacin esto
debido a la desnaturalizacin de las proteasas impidiendo la hidrolisis de la casena.

CONCLUSIONES

Este mtodo nos permite cuantificar el desarrollo que ha tenido la bacteria durante el tiempo
de cultivo - Los requisitos para que se d un crecimiento microbiano incluye factores tanto
qumicos como fsicos, las clulas necesitan condiciones favorables que beneficien su proceso
de reproduccin, cuando las condiciones son ptimas las clulas pasan por diferentes fases
que son caractersticas de todas las formas de vida microbiana. El cultivo controlado de
Bacillus subtilis nos permiti diferenciar algunas de las fases encontrndose representadas en
una curva de crecimiento microbiano. - Cuando las clulas microbianas se alimentan, al igual
que todos los seres vivos, generan desechos. Estos desechos son conocidos como metabolitos
y pueden darse en la fase exponencial o estacionaria siendo denominados metabolitos
primarios o secundarios respectivamente. La cepa Bacillus subtilis produce como metabolito
secundario proteasas, enzimas capaces de romper enlaces peptdicos de las protenas, la
prueba de la leche permiti constatar la formacin de este metabolito por parte de la bacteria.

REFERENCIAS
Alquicira P. Lizbeth. Universidad Autnoma Metropolitana Unidad Iztapalapa. Trabajo para
obtener el grado de especialista en biotecnologa. Determinacin de la especificidad de
proteasas fngicas en la hidrlisis de protena.

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_f
armacia/catedraMicro/08_Tema_6_crecimiento.pdf

Manual de laboratorio de biotecnologa 1