PCR:

Aplicaciones en Infectologa

Laboratorio de Biologa Molecular

Facultad de Medicina UASLP

1
 Que es la PCR?

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

Mtodo enzimtico para amplificar pequeas regiones de DNA in

vitro.

Una sola bacteria no se puede

estudiar, por lo que se hace uso
de tcnicas de cultivo para
incrementar sus nmeros de tal
modo en que se puedan realizar
estudios bioqumicos.

2
 DNA

Molcula que contiene

informacin que define
la manera en que un
organismo debe:
- armarse,
3.4 nm (34 )
- funcionar y
0.34 nm (3.4 )
- degradarse (morir).

2 nm (20 )

3
 DNA
Molcula de DNA es:
- Bicatenaria
- Complementaria
- Antiparalela

4
 DNA
Molcula de DNA es: A T

- Bicatenaria T A
G C
- Complementaria C G

- Antiparalela A T
T A
G C
C G

A T
T A

G C

C G

5
 DNA
Molcula de DNA es: 5' 3'
- Bicatenaria
- Complementaria
- Antiparalela

3' 5'

6
 Desnaturalizacin Reversible

Como se descontamina una superficie de DNA?

- Detergentes o jabones
- NaOCl
- Calor
- Acidos
- Bases
- Luz Ultravioleta
- Radiacin actnica
- DNAsas

7
 Desnaturalizacin Reversible
CONTEXTO:

Una clula humana promedio contiene

entre 6 y 9 picogramos de DNA.

46 cromosomas.

100,000 genes a 22,000 genes

3 mil millones de bases

El cambio de tan solo 1 base es

suficiente para alterar al organismo.

PROBLEMA:

Como detectar un cambio de 1 base

entre 3 mil millones de bases?

8
 Desnaturalizacin Reversible
SOLUCION:

PCR

9
 Componentes
Componentes
Condiciones

Agua
Buffer
MgCl2
dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos
DNA Polimerasa
DNA

10
 Componentes
Componentes
Condiciones

Agua
Buffer
MgCl2 Estabiliza a la DNA polimerasa
Amortigua pH
dNTPs (A,C, T, G) Aportando iones necesarios (KCl)
Puede contener aceleradores (Tween)
Oligoucleotidos Promotores de la reaccin:

DNA Polimerasa FBS

DMSO
DNA Gelatina

11
 Componentes
Componentes
Condiciones

Agua
Buffer
MgCl2 Necesario para el correcto
funcionamiento de la DNA polimerasa
dNTPs (A,C, T, G)
Su concentracin modifica el xito (nivel
Oligoucleotidos de amplificacin) de la reaccin.

DNA Polimerasa
DNA

12
 Componentes
Componentes
Condiciones

Agua
Buffer
MgCl2 Monomeros que ser polimerizados
durante la reaccin.
dNTPs (A,C, T, G)
Desoxyadenosin trifosfato (A)
Oligoucleotidos Desoxyguanosin trifosfato (G)
Desoxycitidin trifosfato (C)
DNA Polimerasa Desoxytimidin trifosfato (T)

DNA
No se puede crear DNA de la nada.

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 Componentes
Componentes
Condiciones

Agua
Buffer
MgCl2
dNTPs (A,C, T, G)
Pequeos fragmentos de DNA (18-30 bp)
Oligoucleotidos
Dirigen la polimerizacin de regiones
DNA Polimerasa especficas.

DNA DICTAN LA ESPECIFICIDAD DE LA

REACCION!

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 Componentes
Componentes
Condiciones

Agua
Buffer
MgCl2
Es la responsable de polimerizar los
dNTPs (A,C, T, G) monmeros (dNTPs) para formar
copias de DNA.
Oligoucleotidos
5-3 Polimerasa
DNA Polimerasa 3-5 Exonucleasa
DNA

15
 Componentes
Componentes
Condiciones

Agua
Buffer
MgCl2
dNTPs (A,C, T, G)
Oligoucleotidos Sirve de referencia o molde para la
sntesis de nuevo DNA.
DNA Polimerasa
Le indica el orden con el cual deben
DNA agregarse dNTPs a la DNA polimerasa.

16
 Componentes
Componentes
Condiciones

Component l

Sterile Water 38.0

10X PCR Buffer 5.0 Volumen de PCR comn:
MgCl2 (50mM) 2.5 Hace 10 aos = 500 y 1000 L
dNTPs (10mM each) 1.0 Hace 5 aos = 25 y 50 L
PrimerFWD (25 pmol/l) 1.0 Hoy = 10 a 12.5 L
PrimerREV 1.0
DNA Polymerase 0.5
DNA Template 1.0

Total Volume 50.0

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 Condiciones
Componentes
Condiciones

Desnaturalizar Acidos
Bases
Hibridizar Sales
Detergentes
Extender Temperatura

18
 Condiciones
Componentes
Condiciones

Desnaturalizar Acidos
Bases Incompatibles con DNA pol
Hibridizar Sales
Detergentes
Ciclos de temperatura
Extender Temperatura
(Termociclaje)

Thermophilus aquaticus = Taq

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 Termociclador
Componentes
Condiciones

Desnaturalizar
Hibridizar
Extender

20
 Condiciones
Componentes
Condiciones

Desnaturalizar
Hibridizar
Extender

21
 Condiciones
Componentes
Condiciones

Desnaturalizar
Hibridizar
Extender

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 Cinetica de la reaccin
20 40 X
Componentes
Condiciones
95C

72C

55C

Desnaturalizacin Hibiridizacin Extensin

Hibrido= DNA + Oligonucleotido

Depende de contenido GC%
Dicta la especificidad de union del oligo al DNA

23
 Cinetica de la reaccin
20 40 X
Componentes
Condiciones
95C

72C

55C

Desnaturalizacin Hibiridizacin Extensin

Polimerasa Velocidad Exonuc Tasa Error %Prod -Mut

Taq 2 Kb/min No 8.0x10-6 16
Pfu 0.5 Kb/ min Si 1.3x10-6 2.6
Pwo 1 Kb/min Si 0.4x10-6 0.7

24
Cinetica de la reaccin

25
 Cinetica de la reaccin
Componentes
Condiciones

La especificidad est
dictada por el diseo de
oligos y optimizacin de
la tcnica.

DNA producto
primers

La sensibilidad del
proceso es alta gracias
a su elevada eficiencia.

n ciclos

La eficiencia neta del proceso es tn elevada que permite amplificar una copia
de DNA original a mil millones de copias en tan solo 30 ciclos (2 hrs)!

26
 Aplicaciones en Infectologia

Facilita procesamiento de muestras

DNA es muy estable (meses a aos).
Pequeo volumen de procesamiento y almacenamiento.
Archivable.
No requiere de red fria para transporte.

Posee mayor sensibilidad que mtodos tradicionales (serologicos)

Tericamente capaz de detectar una sola molcula de DNA.
Muestras no viables pueden ser analizadas.

Posee mayor especificidad.

Reacciones cruzadas mnimas (calidad de diseo del oligo).
Capaz de distinguir diferencias de tan solo UNA sola base nucleotdica.

Permite identificar organismos dificiles o lentos de cultivar (Mycobact)

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 Aplicaciones actuales

Multiplex PCR

Deteccin simultnea de ms de
un patgeno en la misma
reaccin.

Incorpora mayor nmero de

oligonucletidos.

del costo (obvio).

Incrementa rapidez tamizaje.

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 Aplicaciones actuales

Nested-PCR

Anidada.

Realizar una PCR sobre el

producto de otra PCR.

Deteccin de especies de DNA

raras (en nmero) en muestras
diluidas o con bajos ttulos.

Al menos cuatro oligos diferentes.

Supra-sensible (deteccin).

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 Aplicaciones actuales

Random-PCR

Aleatoria.

PCR poco especfica que permite

amplificar a muchas entidades
(especies, bacterias, etc) en una
sola reaccin.

Oligos dirigidos contra secuencias

conservadas de bacterias (16S
rRNA).

Permiten ampificar a cualquier

bacteria (bacteremias, meningitis,
etc).
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 Aplicaciones actuales

RT-PCR

Reverse Transcriptase.

PCR realizada sobre RNA.

Expresin de genes (mRNA).

Genomas virales RNA (HIV, Flu).

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 Aplicaciones actuales

Q-PCR

Quantitative.

Permite cuantificar el nivel

de los productos de PCR.

Util para medir expresin

de genes (mRNA).

Utilisima para medir

niveles de replicacin viral
(carga viral).

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 Electroforesis

Fosfatos y carga negativa del DNA responsable de migracin electrofortica.

(-)
(-)
(-)
(-)
(-) (-)
(-) (-)

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Electroforesis

34
Electroforesis

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1. Preparacin Gel Agarosa

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Preparacin Gel y Montaje

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2. Servir Muestras

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Laboratorio de Biologa Molecular

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