Segunda Sesin

Q Lo que sucede en la Columna: Ensanchamiento de

banda intracolumnar.
Q Sytem Suitability Test: Factor de Capacidad,
Selectividad, Platos Tericos, Resolucin, Asimetra.
Q Cromatografa de Fase Ligada
Q Cromatografa de Fase Normal
Q Cromatografa de Intercambio Inico
Q Cromatografa de Exclusin Molecular
 Factores que causan el
ensanchamiento de banda
La eficiencia de la columna es principalmente una funcin
de la longitud, el tamao y uniformidad de la partcula de
la columna
Difusin de Eddy Efecto Multi-trayectoria

Principal causa ensanchamiento de Banda), depende del tamao y

forma de la partcula y del dimetro de la columna

Zona Pre-columna Zona Post-columna

Difusin de Eddy en una Columna

Difusin Longitudinal

Es la tendencia con la cual las molculas viajan a travs de la columna.

Su magnitud es inversamente proporcional a la velocidad de flujo.
Este factor es importante si:
El tamao de la fase estacionaria es pequea (< 10 m).
La velocidad de la fase mvil es lenta.
(La velocidad de flujo de la fase mvil debe de escogerse de tal forma
que la difusin longitudinal no cause efectos adversos).
Este ocurre cuando:
> 2Dm/dp
Donde:
= Velocidad Lineal
dp = Diametro de la Partcula.
Dm = Coeficiente de Difusin

Dm = 7.4 x 10-12 MT
x Vs0.6
 Resistencia a la Transferencia de Masas
La Resistencia a la Transferencia de Masa es propia de la facilidad con la cual las
molculas de la muestra se equilibran entre la fase mvil y la fase estacionaria. Es
directamente proporcional a la velocidad de flujo.
Para prevenir esto:
Deben de utilizarse partculas pequeas (o de pelculas delgadas) o superficies
porosas como fase estacionaria.
Deben de utilizarse solventes de baja viscosidad.
Alta razon de anlisis puede obtenerse a expensas de la resolucin y viceversa.
 Nomenclatura y Clculos
Q Cromatograma: Segn IUPAC: Es un grfico u otra representacin de la
respuesta del detector, concentracin del afluente, versus el tiempo.
UnCromatograma debe de presentar Picos de forma simtrica y bien
definidos.
Debe de presentar alturas de Pico dentro de la escala de registro.
Debe de tener una lnea base consistente.
No debe de presentar bandas anchas.

tR2
tR1
Intensida

Compuesto 1
d de la
Seal

Compuesto 2

to

tR1 W1 W2
Inyeccin de tR2
la muestra
Que informacin me da un Cromatograma?

Un Cromatograma nos da dos tipos de informacin:

Informacin Cualitativa: El Tiempo de Retencin casi

siempre es constante bajo las mismas condiciones
cromatogrficas. Esto nos sirve como un parametro de
identificacin de sustancias.
Informacin Cuantitativa: El Area del Pico de cada
componente es proporcional a la concentracin del
componente en la mezcla, y este valor es utilizado para
realizar calculos de concentracin.
 Que informacin me da un Cromatograma?

Un Cromatograma tambien puede utilizarse para evaluar la eficiencia de

separacin y la performance de la columna.

Los Principales Parametros de evaluacin son:

Factor de Capacidad: k.
Selectividad:
Nmero de Platos Tericos: N
Platos Tericos Equivalentes: HETP
Resolucin: Rs
Asimetra : As
 Factor de Capacidad (k)

El Factor de Capacidad es un valor nmerico que nos indica el grado de

separacin que puede tener una columna en funcin del volumen
retenido de un analito y el volumen retenido del solvente. El factor de
capacidad se expresa en funcin del volumen por que:

El tiempo de retencin depende de la razn de flujo y las dimensiones de la

columna, por ello no es un valor apropiado para la comparacin de
Cromatogramas.
El Factor de Capacidad es independiente de la razn de flujo y de las dimensiones
de la columna.
Factor de Capacidad (k)

tr t0
k'=
t0 Vr

tr = tiempo de Retencin del

Pico de un Soluto. V0
t0 = tiempo del Solvente (Pico
no retenido)

Injecci
El tiempo de Retencin puede
utilizarse para fijar el Volumen de

n
Retencin.

Vo 1 2 3 4
k = 0
Factor de Capacidad (k)
6 min (t1)
2 min (t0)
k' = 2

4.6 mm ID x 250 mm L. (1.2 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)
k' = 2

4.6 mm ID x 250 mm L. (0.6 mL/min)

Factor de Capacidad (k)
6 min (t1)
2 min (t0)
k' = 2

6.0 mm ID x 150 mm L. (1 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)
k' = 2

6.0 mm ID x 300 mm L. (1 mL/min)

Factor de Capacidad (k)
10 min (t1)
2 min (t0)
k' = 4

6.0 mm ID x 150 mm L. (1 mL/min)

12 min (t1)
4 min (t0)
k' = 2

4.6 mm ID x 250 mm L. (0.6 mL/min)

Factor de Capacidad (k)

El Valor k puede modificarse variando la fuerza de elucin de la fase

mvil,
por ejemplo:
En fase reversa k disminuye al aumentar el componente orgnico y
aumenta al aumentar la proporcin de agua.
En fase normal k disminuye al aumentar la proporcin del solvente
polar y aumenta al aumentar la proporcin del no polar.

k debe estar entre 2 a 10 para mezclas de pocos componentes y de

0.5 a 20 para mezclas complejas.
SELECTIVIDAD
Q Mide la habilidad de una columna para distinguir entre dos
componentes
Q Se puede ajustar por medio de la fase mvil y la fase estacionaria

Tiempos de retencin corregidos de los dos picos

k2 t' R
= =
2

k1 t' R 1

donde:
k1 = coeficiente de distribucin del primer pico
k2 = coeficiente de distribucin del segundo pico
tR2 = tiempo de retencin ajustado del segundo pico
tR1 = tiempo de retencin ajustado del primer pico
Si > 1 la separacin es aceptable
 Lo que hay que tener en cuenta para la
Selectividad
La Selectividad no depende de la fuerza de elucin sino de
la afinidad del soluto con la FM y la FE.

La disminucin de la fuerza de FM produce una aumento de

retencin,
no vara la selectividad. L puede ser variado:
* Modificando el componente activo de la FM
* Modificando el pH de la FM
* Empleo de aditivos (reactivos de apareamiento)
* Cambio de la fase estacionaria
Eficiencia de la columna
Q Mide los efectos de ensanchamiento de pico que ocurren cuando un
componente viaja a travs de la columna
Las columnas ms eficientes producen picos ms estrechos para los
mismos tiempos de retencin
Q Se expresa cuantitativamente como el nmero de platos tericos
El trmino proviene de la tecnologa de destilacin
Es el nmero de veces que un componente se encuentra en estado de
equilibrio entre dos fases

Fracciones de la columna de destilacin

 Nmero de Platos Tericos
2
t' R Para picos simtricos
Neff = 5.54
W
donde:
tR = tiempo de retencin ajustado
W = ancho de pico a la mitad de la altura

Inyeccin Pico de aire

Medicin de Neff
Nmero de Platos Tericos

Si los picos son de forma Asimtrica, la ecuacin

que se utiliza es:

(tR/W0.1)2
N = 41.7 T + 1.25

Donde:
W0.1 = Es el Ancho del Pico al 10% de la altura
T = Factor de Cola del Pico.
 Nmero de Platos Tericos

Los Platos
Tericos
tambin
dependen
del
dimetro,
longitud
de las
tuberas, de
la
celda de
flujo.
 MEDICION DE LA HETP
Q La HETP describe la longitud de la columna equivalente a un
plato terico
Cuando ms pequeo es el valor de la HETP, ms eficiente es
la columna
L
HETP =
Nef

donde:
L = longitud de la columna (mm)
Nef = Nmero efectivo de platos tericos

t' R 5.0 1.3

k' = = = 2.8
1

Ejemplo:
t0 1.3
t' R 6.2 1.3
= = = 1.3
2

t' R 5.0 1.3

1

1.18tR 1.18 1.2

R= = = 5.0
W1 + W2 0.13 + 0.15
2 2
t' R 3.7
Nef = 5.54 = 5.54 = 4500
1

W1 0.13
L 25cm
HETP = = = 0.05mm
Nef 4500
Ecuacin de Van Deemter

Q La altura equivalente de un plato terico (HETP) es la suma de los tres

trminos, los cuales contribuyen al ensanchamiento de la banda.
Q Una altura de plato terico ms pequea implica un nmero ms
grande de platos tericos.

C
HETP = A + B +

donde:
A = Difusin Eddy
B = Difusin longitudinal
C = Resistencia a la transferencia de masa
= Velocidad lineal de la fase mvil
GRAFICAS DE HETP
Q La HETP se puede utilizar para seleccionar la velocidad de flujo de la fase mvil.

En la grfica, el punto mnimo representa la eficiencia ms alta que se obtiene, la cual

corresponde a la velocidad lineal ptima.

Velocidad lineal de la fase mvil vs HETP

Q El tamao de partcula del empaque es el factor principal en la determinacin de la
eficiencia.

Flujo
Efecto del tamao de partcula sobre la eficiencia
Resolucin (Rs)
Que es la Resolucin?
La Resolucin es un ndice numrico que nos indica el grado de
separacin de dos compuestos. Esta puede expresarse utilizando
los siguientes parmetros:

Matemticamente esta se
expresa como:

2(V2 V1)
Rs = (W + W )
1 2
Resolucin (Rs)
Otra forma de calcular este ndice es en base al
Nmero de Platos Tericos (N), la Selectividad () y el
Factor de Capacidad (k):

1 -1 N k
R =4 k + 1

N : Promedio de N1 y N2
k : Promedio de k'1 y k'2
Resolucin
Si los picos fueran de forma Triangular, dos picos pueden ser separados
con un valor de Resolucin igual a 1.

Rs = 0.8 Rs = 1.0?? Rs = 1.25

Sin embargo, los picos se presentan

en formas Gaussianas
Resolucin
Que tanto deben de estar resueltos dos picos?
La Resolucin mnima requerida para realizar cualquier trabajo
Cromatogrfico es de 1.25
La Separacin de la Lnea Base del Pico Cromatogrfico se lleva a cabo
cuando Rs tiene un valor de 1.50
Razn de Altura del Pico:
Resolucin:
1:1 1:4 1:16

Rs = 0.80

Rs = 1.00

Rs = 1.25
Resolucion vs Selectividad, Capacidad y
Eficiencia

Pirmide de la Resolucin

Y N 1 k'
R=
4 k '+1

donde:
N = Nmero de platos tericos
= Tiempo de retencin relativo
k = Relacin de particin (capacidad)
RESOLUCION vs SELECTIVIDAD,
CAPACIDAD Y EFICIENCIA (cont.)
A) Resolucin pobre

B) La eficiencia de la columna determina el ancho del

pico. Se tiene buena resolucin debido a la eficiencia de
la columna

C) La separacin es una funcin de la selectividad de la

columna. Se tiene buena resolucin debido a la
selectividad de la columna

D) Los tiempos de retencin se determinan por el factor

de capacidad. Una resolucin pobre resulta cuando los
componentes eluyen cerca del pico no retenido
 Resolucin
Incrementando
Inicial N

ecc
ecc

in
Iny
in
Iny

Incrementando
Incrementando
k

ecc
in
Iny
ecc
in
Iny
Resolucin
Y ... Como llevo a cabo estos cambios?

Inicial

Para Incrementar N
Utilizar una columna ms grande o una
columna de mejor performance.

Para incrementar k
Disminuir el contenido de un solvente
orgnico para columnas ODS.

Cambiando
Cambiar el contenido orgnico, pH u orden del
solvente orgnico o cambiar la temperatura de la
columna.
OPTIMIZACION DE LA SEPARACION
CROMATOGRAFICA
Q Para optimizar el factor de capacidad, k:

Ajustar la fuerza del disolvente

Cambiar la fase estacionaria

Q Para optimizar la selectividad, :

Cambiar la composicin de la fase mvil

Utilizar aditivos en la fase mvil
Cambiar el pH
Cambiar la fase estacionaria
Cambiar la temperatura

Q Para optimizar la eficiencia de la columna, N:

Disminuir el tamao de partcula

Reducir la velocidad de flujo haca un mnimo utilizando la grfica de HETP
Utilizar dos o ms columnas en serie
Utilizar disolventes menos viscosos
Aumentar la temperatura de la columna
Aumentar la uniformidad de la partcula
Asimetra (As):
Llamado tambin factor tailing, es la forma ms
comn del alejamiento de la curva gaussiana.

As = W (0.05)
2a

Es importante para reducir errores de cuantificacin.

Cromatografia de fase ligada
La Silicagel:

Slido amorfo y poroso de gran rea superficial , dimetro de poro entre 60 a

300 A.
Qumicamente es un xido de silicio hidratado (SiO2.H2O). Sus tomos internos
ligados por O2 y superficiales por OH.
La Silicagel es fuertemente higroscpica, el agua es responsable de inactividad.
Es insoluble en solventes no polares, y muy solubles en solventes alcalinos.

Q Material de Relleno: Irregular o Esfrica entre 3 a 10 um de dimetro.

Q Porosidad: Relacin entre volumen interno del poro y el volumen de la
partcula
Q Actualmente existen la slica monoltica con alta porosidad 10% ms que
las columnas de partculas
Slica Monoltica

Macropores: 2 m Mesopores: 13 nm

Total porosity: > 81% (65-70% for conventional columns)

 Preparacin de Fase Ligada
Q Preparacin de la Fase Ligada: La partcula de la fase ligada est
compuesta por un material de base: silicagel, almina, agarosa,
copolmero de estireno, que se unen qumicamente a un compuesto
con grupo funcional determinado. La unin ms frecuente es la de
Silicagel por medio de una unin covalente tipo siloxano (Partcula
Si-O-R).
Existe otros tipos de uniones:
* Tipo Amino: SiNR2
Silicagel + Cl Tionilo (estable pH 5-7)
Partcula-SiOH + SOCl = Partcula Si-Cl
Partcula Si-Cl + HNR2 = Partcula-Si-NR2 + H2O
* Tipo Carbono: Si-CR3
Partcula -SiOH + SOCl2 = Partcula Si-Cl
Partcula Si-Cl + Fenil-Mg = Partcula-Si-Fenil + Cl2Mg
* Tipo Siloxano (Si-O-SiR3): Por reaccin de los silanoles de la slica
con rgano-n-halo-silanos (clorosilanos).
Preparacin de Fase Ligada
 Sntesis de Columnas de Slica
Moniltica: Chromolith
H2O, H+
Polymer
Si(OCH3)4

Starting Phase Separation Aging and

Sol and Gelation Solvent Exchange

Mesopore Macropore

Cladding Surface Modification

Columnas de Slica Monoltica
 Cromatografa de Fase Reversa
La Cadena Hidrocarbonada.
Q Ms empleado es el C18.

Q La retencin aumenta con la longitud de la cadena hidrocarbonada:

Q A > hidrofobicidad del soluto > Retencin
Q A > longitud de cadena, la retencin es > en un factor mximo de 10
y si se aumenta el modificador orgnico en FM, la retencin
disminuye de 2 a 3 por cada 10% de modificador agregado.
Cromatografa de Fase Reversa

La Fase Mvil:

Q Constituda por solvente polar y un modificador orgnico, a

quienes se le puede agregar aditivos, sales o buffers.
Q La selectividad del sistema est dada por el modificador en
funcin a su capacidad de aceptar y donar protones.
Q Los solventes de mayor empleo: Agua, MeOH, AcN, THF. El
agua generalmente acta como carrier.
Cromatografa de Fase Reversa

Mecanismo de Retencin:
El modo de interaccin entre el soluto y la fase ligada puede ser de
3 tipos:
Q Particin: Del soluto con FM y FE lquida.
Q Adsorcin: Interaccin con FE slida
Teora Solbofbica de Horvath: El soluto es expulsado de FM
y forzado a penetrar a la FE que acta como receptor pasivo. La
interaccin con FE ser mayor, cuanto mayor sea el grupo apolar.
Formas de la cromatografia
en fase reversa

Q Fase Reversa Regular: La retencin es gobernada por la

hidrofobicidad del soluto.
Q Control de la Ionizacin (Supresin Inica):
* Los solutos ionizables dan picos con baja retencin y
fuerte asimetra.
* Debe impedirse la ionizacin:
Para cidos carboxlicos mantener a PH 2 a 4
Para los solutos bsicos: pH 7 a 8, utilizando TEA, DEA,EA,TMA
Cromatografa de Apareamiento Inico

Q Cromatografa de Apareamiento Inico:

* Para estructuras altamente hidroflicas : bases y cidos.
* El soluto se mantiene en estado inico.
* La FM contiene un contrain de carga opuesta al del analito: formando
un complejo neutro y as pasa a travs de la columna.
Xfm + Cfm === [XC]fm === [XC]fe
* Se debe regular el pH 6,57,5 para cidos y 2,5-3,5 para bases.
* Para bases se utiliza contrain aninicos: alquil sulfonatos.
* Para cidos se utiliza contrain catinico: alquil amonio.
* La retencin se regula por % de modificador orgnico y la longitud de
cadena del contrain.
* La Cromatografa de Apareamiento inico permite la separacin de solutos
inicos y no inicos en un mismo cromatograma.
* Las columnas deben reservarse para uso exclusivo de esta modalidad.
CROMATOGRAFIA EN FASE REVERSA
Ventajas:
Q Compuestos No inicos e ionizables, puede ser separados en
la misma columna, con la misma FM.
Q La adsorcin irreversible en la slica raramente ocurre.
Q La fase mvil predominante es agua, abundante y econmica.
Q El modificador orgnico abundante es el metanol.
Q El orden de elucin es predecible en funcin a la
hidrofobicidad del analito.
Q Se necesita poco tiempo para el equilibrio del sistema luego
de un cambio de fase mvil.
CROMATOGRAFIA DE FASE NORMAL
Q Fase estacionaria Hidroflica: Slice, Almina o materiales
de fase ligada: NH2, Diol
Q La Columna CN, se usa FM menor polaridad (de f.e.) act
como NP y si es mayor acta RP.
Q Mtodo apropiado para solutos de alta y mediana polaridad
o separacin de ismeros posicionales con sustitutentes.
Q Su mayor inconveniente es la alta actividad del material de
relleno para absorber agua y solventes polares.
Cromatografa de Fase Normal

Fase Mvil
* Es de naturaleza apolar: Hexano, Cloroformo.

Mecanismo de Separacin:
* Puede suceder varios tipos de interacciones:
* Interaccin dipolo-dipolo.
* Interacciones de puente de hidrgeno
* Mecanismos de transferencia de carga
Cromatografa de Intercambio
Inico (IEC)

Q La FE contiene grupo funcionales inicos y retiene el soluto

de caractersticas inicas pero de signo opuesto,
intercambindolas por un proceso irreversible con iones de la
fase mvil.
Q Se denomina intercambio aninico si el analito tiene carga
negativa y catinico si tiene carga positiva.

R+X- + A- == R+A- + X-
R-X+ + C+ == R-C+ + X+
 Cromatografa de Intercambio Inico
Q Material de Relleno:
Intercambiadores aninicos: Grupo iongnico fuertemente o
dbilmente cido (SAX WAX) : -SO3H;
-COOH; -PO3H2. Los intercambiadores catinicos, grupos ionognicos
fuertemente o dbilmente bsicos (SCX o WCX) : -NR3+ ; -NH3+
Q La Fase Mvil:
Son soluciones acuosas de pH y fuerza inica controlados por medio de
un buffer y puede contener cantidades moderadas (no ms 30%= de un
modificador orgnico: MeOH o AcN.
El anin decrece en el orden:
Citrato < SO4=<Oxalato<I-<NO3-<CrO4=
<Br-<SCN-<Formiato<Acetato<HO-<F-
El catin decrece en el orden:
Ba++<Pb++<Sr++<Ca++<Ni++<Cd++<Cu++<Co++<Zn++<Mg++
<UO2++<Ti+<Ag+<Cs+<Rb+<K+<NH4+<Na+<H+<Li+
Cromatografa de Intercambio Inico

Variable Efecto
Fase Mvil
pH La retencin depende del pKa. Permite variar tanto la fuerza como la
selectividad
Fuerza Inica A mayor fuerza inica, mayor fuerza de elucin (menor tiempo de retencin).
Escasa participacin sobre la selectividad.
Contrain A mayor valencia, mayor influencia (en proporcin directa sobre la fuerza
inica) El tipo de contrain determina la fuerza de elucin
Modificador A mayor proporcin de modificador orgnico, menor retencin.
Orgnico
Temperatura A mayor temperatura, mayor eficiencia y mayor retencin
Cromatografa de Intercambio Inico
Cromatografa de In Suprimido
Q Utiliza doble columna, la primera para la separacin de los iones y la
segunda para suprimir los electrolitos de la FM.
Cromatograf Inica de Columna Unica
Q Emplea columna inica de baja capacidad: 0,005 a 0,1 mE/g con un
eluyente de baja concentracin (0,1 mM). De esta forma la
conductividad del eluyente es tan baja que no es detectable por el
detector de conductividad.

Fase Mvil Concentracin pH Deteccin

Biftalato de Conductividad
Potasio 0,5-10 mM 1 - 6.2 UV indirecto 280 nm
Benzoato de Conductividad
Sodio 0,1 - 5 mM 3.2 - 5.2 UV indirecto 280 nm
Ac. P-hidroxi- 3.5 - 5.5 Conductividad
benzoico 3-10 mM 8.3 - 20.3 UV indirecto 370 nm
Fenolato de
Sodio 1 - 100 mM 9 - 11 Conductividad
Hidrxido de
Potasio 3 - 100 mM 11 - 13 Conductividad
Cromatografia de exclusion
molecular (SEC)

Q Separa sustancias en base a su tamao efectivo en solucin que es

proporcional a su PM.

Q Se utiliza generalmente para anlisis de compuesto de PM>2000

Q Se debe seleccionar la columna que abarque los pesos moleculares a

separar. y un solvente que solvate adecuadamente el analito (la FM
acta como carrier).

Q Se Clasifica en:

Q Cromatografa de Filtracin de Geles : Para sustancias hidrosolubles:

Pptidos, acidos nucleicos, proteinas, azcares.

Q Cromatografa de Permeacin de Geles: Para sustancias no hidroflicas:

Sintticas y elastmeros: caucho, plsticos, resinas
Cromatografia de exclusion
molecular (SEC)
Cromatografa de Exclusin
Molecular

Ventajas:
Q Separacin molecular vlida no slo para el anlisis directo sino
como mtodo preliminar de fraccionamiento de muestras complejas
para su posterior estudio por otros mtodos,
Q Picos angostos
Q Tiempos de separacin cortos y predecibles.
Q No hay prdida de muestra.
Q No hay desactivacin de la columna
Desventajas:
Q Limitada capacidad de picos: 10 a 12
Q Incapacidad de resolver muestras de PM similar
Q La resolucin no puede manipularse