Se analiza el metabolismo del Aspergillus niger A10 con un modelo estructurado que predice

cualitativamente el crecimiento de un sustrato solido cuando se utilizan diferentes duentes de

carbono.

Si bien este es un modelo simplificado ,retiene las carcteristicas importantes de las rutas
EMP,PF,CAT,y las rpoducciones de ATP,NAD+ NADP+,assi como de la biomasa .Los experimentos
realizados donde se miden conjuntamente lla cantidad de biomasa y CO2 producidos y el consumo
de O2 en una caja Petrimodificada ,permitieron una comparacin cualitativa con las predicciones del
modelo ,pero es claro que en este tipo de experimentos tambin se deben de medir los productos
excretados al medio solido, aunque esto no sea fcil. Loanterior es indisprnsable para estimar
algunos de los parmetros cinticos fundamentales ,asociados ccon la diferentes rutas metablicas
que conforman el modelo . La presencia de otra fuente de carbono ,que tiene un grado de
redduccion diferente al de la glucosa ,perturba el metabolimo normal cuando se usa conjuntamente
con esta ,y en ausencia de estaa se observa un crecimiento muy peque;o . Por otro lado es muy
importante determinar el mecanismo de asimilacin de la glucosa por el micelio ,y creemos que
esta es una de las partes importantes que ha tocado esta investigacin ,adems del uso novedoso
de una caja Petri modificada

Cualquier diseo no de ensayo y optimizacin de errores slo podra lograrse a partir de

una imagen consistente de la fisiologa celular. En este trabajo hemos hecho algunos
avances en la comprensin de la base bioqumica del metabolismo idiofsico, la etapa
productora de cido ctrico de A. niger. El modelo nos permiti cuantificar la distribucin del
flujo de carbono a travs de algunos de los principales procesos metablicos presentes (va
HMP: 16%, ciclo de Krebs: 13%, sntesis de citrato: 71% expresada como fraccin de
absorcin de carbono). Concluimos que un ciclo GABA no puede tener una influencia
significativa en la productividad del cido ctrico. Este hallazgo ha sido apoyado por Kumar
et al. (2000). Sobre bases similares se estableci la importancia energtica despreciable de
un ciclo ftil NH4 + / NH3. El modelo sugiere fuertemente un papel importante para una
lanzadera de glicerol-P (seccin de balances ATP). Junto al ciclo de Krebs, proporcionara
el FADH (m) que las clulas se desvan hacia la fosforilacin oxidativa (R16). Todo el NADH
(m) es re-oxidado por el sistema de respiracin alternativo sin ganancia de ATP (R17), ya
que el sitio de fosforilacin I es inactivo en idiofase. De hecho, la reaccin citoplasmtica R8
proporcionara el 58% del ATP total producido, ya sea directamente (fosforilacin del
substrato) o indirectamente (transformacin de NADH (c) a FADH (m)), lo que representa
una proporcin inusualmente alta para un proceso aerobio. De esta manera, las clulas son
capaces de minimizar la falta de concordancia entre las balanzas reductoras y ATP
observadas en la etapa de sntesis de cido ctrico..

Por lo tanto, de acuerdo con nuestro modelo la sntesis de cido ctrico (R12 en la Tabla 2)
producira hasta el 43% del NADH total, pero consumiendo slo el 12% del total de ATP.
Estos desequilibrios implican as el funcionamiento de algn mecanismo redox regulador
con el fin de mantener un estado estacionario. Nuestro modelo de apoyo (Apndice, seccin
IV) la afirmacin de varios autores (Kubicek et al., 1994, Kristiansen et al., 1998) de que
algunos equivalentes reductivos se consumen ya sea como polioles oa travs del sistema
de respiracin alternativa. Otro hallazgo modelo se refiere a la importancia de las H + -
ATPasas. Parecen ser el principal proceso exigente de ATP, consumiendo hasta un 55%
del ATP. La tasa de demanda de ATP para el mantenimiento celular se determin como 3,7
mmol ATP.g - 1 h - 1.

El presente trabajo constituye un intento de disear estrategias de optimizacin de la tasa

de produccin de cido ctrico en A. niger integrando en un marco matemtico los aspectos
ms relevantes de la fisiologa de A. niger. A este respecto, el hallazgo ms notable fue la
identificacin del portador de glucosa (reaccin R1) como el paso ms adecuado como
objetivo para una modulacin ascendente. La Tabla 6 muestra que la modulacin doble de
la actividad portadora de glucosa provocar un aumento del 45% en la productividad del
cido ctrico. Esta prediccin se ha hecho sobre la suposicin de que la captacin de
glucosa est acoplada con el transporte de H + a travs de un mecanismo symport
(Warnacke y Slayman, 1980, Nicolay et al., 1983). Si, como se ha afirmado recientemente
(Wayman y Mattey, 2000), la captacin de glucosa no est acoplada a un flujo de H +, el
aumento en la produccin de velocidad de citrato sera an mayor. Pero este no es el nico
proceso de transporte adecuado para la mejora de la tasa de cido ctrico. Nuestra
exploracin mostr que los aumentos en la actividad de portador de fosfato mitocondrial
(R22) mejorara la produccin de cido ctrico (Tabla 6). El principal factor que subyace a
este efecto es la mejora de la disponibilidad de ATP. As, mientras que la actividad de la H +
-ATPasa citoplasmtica disminuir, las mitocondriales deberan ser ms activas. Dado que
la bomba mitocondrial es energeticamente ms eficiente (seccin (d) del desarrollo del
Modelo) se puede esperar un ahorro neto de ATP. Se ha demostrado que otras
perturbaciones basadas en el bloqueo de algunos flujos desviadores, es decir, la va HMP
(R2) o los polioles de excrecin, principalmente glicerol (R11) y arabitol (R4) tienen un
efecto nulo sobre la produccin de cido ctrico.
Los fracasos reportados para aumentar la produccin de cido ctrico de A. niger por
sobreexpresin de una enzima (citrato sintasa, Ruijter et al., 2000) o dos enzimas
(fosfofructoquinasa y piruvato quinasa, Ruijter et al., 1997) estn de acuerdo con las
predicciones de nuestro modelo, ya que no cualquiera de estas enzimas se sealan como
pasos de control del flujo. Por otro lado, el gran control de flujo mostrado por el portador de
glucosa est de acuerdo con las conclusiones derivadas de otro modelo desarrollado
(Alvarez-Vazquez et al., 2000). En su enfoque Alvarez-Vasquez et al. mostr que para
lograr aumentos significativos en la produccin de cido ctrico, se requiere al menos 12
modulaciones enzimticas adicionales. Esta discrepancia se puede explicar en trminos de
las diferencias internas en las estrategias de modelado, as como en trminos de los
diferentes supuestos fisiolgicos subyacentes. Respecto al primer punto, cabe sealar que
los escenarios de optimizacin considerados no son los mismos. Mientras que los Alvarez-
Vasquez et al. las predicciones del modelo se refirieron a un rango ms amplio de cambios
(hasta la modulacin de las actividades enzimticas de 1-50 veces los valores basales), en
el presente los cambios no superan dos veces los valores basales. Otras caractersticas
presentes en la versin actual que ayudan a explicar las diferencias de resultados
observados se refieren al reconocimiento del hecho de que A. niger idiophase no es un
estado fisiolgico nico estacionario; la distincin establecida entre los dos grupos H + -
ATPases diferentes; la compartimentacin de los pools ATP, NADH, FADH y H +; el enlace
de cada grupo H + con la actividad de los portadores antiport y symport; y la consideracin
independiente del consumo de NADH y FADH a travs de la respiracin (reacciones R15,
R16, R17) que incluye relaciones variables de eficiencia (P / O).
En contraste con otras soluciones de optimizacin (Alvarez-Vasquez et al., 2000), la
implementacin de las soluciones ptimas a travs de cambios genticos es, en el caso
preestablecido, mucho ms factible. El primer cambio a explorar con el fin de buscar una
mejora de la velocidad de produccin es la sobreexpresin del portador de glucosa (R1).
Del mismo modo, la sobreexpresin de la actividad portadora de fosfato mitocondrial (R22)
mejorara la produccin de cido ctrico. Estos tipos de cambios genticos no se han llevado
a cabo todava, pero estn bien disponibles con las actuales tcnicas recombinantes de
ADN en el reino de produccin de cido ctrico de A. niger (Verdoes et al., 1994, Yu et al.,
2000). El portador de glucosa se ha caracterizado (Torres et al., 1996) y actualmente
estamos trabajando en la caracterizacin de las etapas de transporte mitocondrial. Estamos
seguros de que la disponibilidad de la informacin relevante sobre los pasos de transporte y
las conclusiones derivadas de este enfoque de modelo integrador fomentar en un futuro
prximo la optimizacin dirigida del proceso a travs de la sobreexpresin de pocos pasos
metablicos seleccionados.
Finalmente, es nuestra opinin que cualquier diseo racional de las estrategias de
optimizacin de los procesos biotecnolgicos debe basarse en predicciones de modelos
bien desarrollados. En el presente caso, el modelo integra la informacin disponible sobre la
bioqumica de A. niger idiophase mientras que en condiciones de produccin de cido
ctrico. El modelo actual nos proporciona no slo una mejor comprensin del metabolismo
de A. niger, sino tambin estrategias racionales para la optimizacin del proceso.