Ao del buen servicio al ciudadano

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS

BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR

BACILLUS THURINGIENSIS: IMPORTANCIA EN EL CONTROL DE INSECTOS

DOCENTES:

Dr. BLAS CERDAN, William Genaro

Dr. MURO MOREY, Juan Cesar.

Ms. PESANTES VERA, Manuel Fernando.

Dr. SALDAA JIMENEZ, Jos Antonio.

ESTUDIANTES:

FASANANDO SANCHEZ, KENERITH

LONGA NELGAR, RENATO
LOPEZ ZAVALETA, ANGELICA
MENDOZA CHIQUIPOMA, CARLOS
PRADO VALDEZ, MICHAEL
SALINAS MORALES, BRAYAN
SANCHEZ BOBADILLA, BEATRIZ
VALDIVIA AREDO, CHRISTIAN
VARGAS VILLEGAS, HOMERO
VSQUEZ VILLANUEVA, KATHERINE

CICLO:

VI-Seccin A, Mesa 4.

Trujillo, 19 de octubre del 2017.

 BACILLUS THURINGIENSIS: IMPORTANCIA EN EL
CONTROL DE INSECTOS
Autor: Dr. William Genaro Blas Cerdn.

I. INTRODUCCIN:

Por dcadas se han utilizado indiscriminadamente insecticidas qumicos, como compuestos

organoclorados, organosfosforados, carbamatos, entre otros, que han provocado grandes
problemas de contaminacin de los productos agrcolas, suelos y agua. Tambin han
ocasionado un desequilibrio ecolgico al no ser biodegradables y por tener un poder residual
elevado; como consecuencia de ello, los insectos han desarrollado mecanismos de resistencia
al soportar concentraciones de insecticidas cada vez mayores y ms frecuentes.
Esto ha llevado a buscar nuevas y mejores alternativas para controlar insectos plaga, como el
empleo de diversos productos basados en diferentes organismos como virus, bacterias y
hongos (Ortiz y Ortiz,1992)
Los bioinsecticidas, ya sea organismos naturales o modificados genticamente y/o los
productos de sus genes usados para controlar a una poblacin plaga son el ms importante
ejemplo del empleo de sistemas de control biolgico. En la actualidad, Bacillus thuringiensis
es, sin duda, el producto comercial de mayor difusin y uso a nivel internacional (Fietelson et
al. 1992)
B. thuringiensis es una bacteria del suelo Gram positiva: que produce inclusiones proteicas
cristalinas durante el proceso de esporulacin. Las protenas que forman estas inclusiones se
denominan delta-endotoxina (Aronson et. al. 1986) A la fecha se han identificado una gran
cantidad de capas de B. thuringiensis con diferentes rango de accin insecticida. La mayora
de las cepas tienen actividad contra larvas de insectos lepidpteros, pero tambin se han
encontrado cepas de la misma bacteria con actividad contra dpteros, colepteros, acaros,
platelmintos, protozoarios y nematodos. (Feitelson et. al, 1992)
Comercialmente B. thuringiensis se usa desde hace muchos aos en el control de las plagas
agrcolas el cual presenta algunas ventajas bastantes significativas que le han permitido tener
xito sobre los insecticidas orgnicos; tales como: a) Es inofensivo al hombre, animales
domsticos, flora y fauna silvestre, b) Su ataque es especfico para el estado larvario del
insecto y su uso no genera tolerancia a los mismos, c) Se puede mezclar con adhesivos para
aumentar su accin biocida, d) Su degradacin en el ambiente es rpida, por lo tanto no causa
problemas de contaminacin y e) Sus costos de produccin se reducen, debido al avance
tecnolgico en las reas de fermentacin microbiolgica y gentica (Rodriguez et. al., 1991)
Recientemente la clonacin de los genes de las delta-endotoxinas ha permitido el
planteamiento de nuevas estrategias para proteger a los cultivos del dao por insectos ya que
varios grupos de investigacin han logrado la expresin de estos genes en vegetales,
obteniendo as plantas transgnicas. (Bravo y Quintero, 1993)
El presente trabajo tuvo como objetivo realizar un estudio sobre las caractersticas
morfolgicas y fisiolgicas de Bacillus thuringiensis y de la produccin de delta-endotoxina, as
como su aplicacin en el control de insectos plaga.
 II. BACILLUS THURINGIENSIS

2.1 Aislamiento

Fue aislado y descrito por primera vez por Ishiivata en 1905, quien lo llam Bacilo de Soto.
En 1991, Berliner le da el nombre de Bacillus thuringensis (Fast, 1973)

Heimpel(1958) y Angus(1960), lograron identificar por primera vez a B. thuringensis

realizando pruebas bioqumicas en 1962. De Barjac y Bonnefoi diferenciaron algunas
variedades dentro de la misma especie a travs de ensayos serolgicos, comparando
anticuerpos de flagelares y Norris Burges (1965), se distinguen otras variedades de Bt
utlizando patrones electroforticos de la enzima entereasa (Burges, 1981)

El aislamiento se hace a partir de muestras tomadas de suelos, estas muestras se inoculan

en un medio nutritivo y selectivo (LB: Caldo de Luria con acetato de sodio) posteriormente
se incuban a 60C durante una hora, con el propsito de eliminar otras bacterias en estado
vegetativo. Las esporas, usualmente resistentes a estas temperaturas, se inoculan en medio
T3, para favorecer su germinacin y recuperacin. Este medio est constituido por triptona,
triptosa, extracto de levadura, MnCl2 y agar, disueltos en una solucin buffer fosfato a ph 6.8.
Realizada la siembre se deja en incubacin a 26C por 24 horas y se procede a indentificar
las cepas de Bt por su morfologa colonial caracterstica. Estas colonias son particularmente
blancas y deprimidas con borde rugoso o forma estrellada. Las colonias seleccionadas se
transfieren a un medio LB slida y nuevamente se deja en incubacin a 26C hasta obtener
completa esporulacin.

Las colonias, productoras de cristales y esporas, son sometidas a un mtodo de coloracin

rpido y simple, utilizando una solucin de Azul brillante de Coomassie (0.25 gr de colorante,
50 ml de etanol, 7ml de ac. Actico y agua destilada); a travs del cual y empleando el
microscopio ptico, se puede distinguir los cristales que captan el color violeta y las esporas
mantienen su apariencia blanca y elptica (Ortiz y Ortiz, 1992)
2.2. Clasificacin de cepas

El primer enfoque en la caracterizacin de cepas de B. thuringiensis, es la forma de la delta-

endotoxina presente, y la clasificacin de las mismas, se hace de acuerdo a los genes que
portan cada una de las cepas.(Bravo y Lorence. 1993).
Los genes codifican la delta-endotoxina, llamado Cry, se han clasificado en cinco grupos
principales y varias subclases; en total se tiene una familia de 26 genes diferentes que
codifican para estas protenas, donde cada uno es altamente especfico para un blanco
determinado (tabla 1).

Tabla 1. Clasificacin de los genes de la delta-endotoxina y la forma del cristal biocida que
expresan
Genes Forman del cristal Blanco
Cry I Bipirasidal Lepidpteros

Cry II Cuboidal Lepidpteros y

Dpteros

Cry III Romboidal Colepteros

Cry IV Ovoidal Dpteros

Cry V ---------- nematodos

FUENTE: Feitelson et. al ., (1992)

2.3. Proteinas Cry

Las protenas Cry son un grupo de protenas de inclusin paraesporal de B. thurigiensis que
manifiestan una funcin txica frente a diferentes organismos. Estas protenas pertenecen al
grupo de - endotoxinas, cuya caracterstica general es que son toxinas formadoras de poro
(PFT), cuyo foco de accin es la membrana de clulas epiteliales del intestino medio de
insectos. Son toxinas muy especficas de especie, por lo que no todos los insectos son blanco
para alguna de ellas. Adems, se ha comprobado que son inocuas para vertebrados.
Asimismo, con el fin de agrupar a esta familia de protenas e introducir nuevos miembros que
se descubran en un futuro, las protenas Cry se han definido como: cualquier protena
paraesporal de Bt que muestre un efecto txico hacia algn organismo, verificable por medio
de bioensayos o cualquier protena que muestre similitud con las protenas Cry. Actualmente
se han encontrado toxinas Cry en otras especies de bacterias, como Clostridium bifermentans
(clasificadas como Cry16A y Cry17A), con actividad frente a mosquitos. Por todas estas
caractersticas, las protenas Cry se han venido utilizando como bioinsecticidas para especies
plaga y, adems, se han usado para obtener plantas transgnicas resistentes a la especie que
las ataca.
En 1989, Hofte y Whiteley propusieron una nomenclatura y clasificacin de las protenas Cry
basados en la similitud de su secuencia de aminoacidos y el rango de especificidad. En esos
aos, las protenas Cry I, Cry II, Cry III,Cry IV eran las especficas contra lepidpteros,
lepidpteros-dpteros, colepteros y dpteros, respectivamente. Las clases V y VI, activas
contra nematodos, fueron consideradas posteriormente en la clasificacin por Feitelson y
colaboradores en 1992. En 1998, Schnepf y colaboradores propusieron una nueva
clasificacin basada solamente en la similitud de secuencias primaria entre las protenas Cry.
La nomenclatura actual de las toxinas Cry las agrupa como: 1. protenas txicas a lepidpteros
grupos Cry1, Cry2 y Cry9; 2. toxinas activas contra colepteros grupos Cry3, Cry7 y Cry8; 3.
protenas con actividad dual grupos Cry1B y Cry1I; 4. protenas con actividad nematicida,
grupos Cry5, Cry12, Cry13 y Cry14; 5. protenas txicas a dpteros, grupos Cry2, Cry4, Cry10,
Cry11, Cry16, Cry17, Cry19 y las Cyt. (Orietta Fernndez -Larrea Vega, 2002)
Hasta ahora, se han clonado y secuenciado ms de 200 genes cry, cuyas protenas Cry se
han distribuido en 50 grupos y varios subgrupos. Cada uno de estos grupos presenta una
toxicidad muy concreta a un determinado tipo de insecto, por lo que la clasificacin de este
tipo de protenas est muy relacionada con su toxicidad. El aumento en el nmero de nuevos
genes cry descubiertos hizo que la clasificacin vigente hasta ese momento se quedara
obsoleta. Esto desencaden el diseo una nueva nomenclatura propuesta por Crickmore et al.
en 1998, donde se utilizan nuevos criterios para este tipo de toxinas (Neil Crickmore, 2011):
nombre genrico de la familia (Cry), seguido de un nmero arbigo que agrupa a las que
comparten el 45% de identidad (Cry1, 2, 3, etc), a continuacin le sigue una letra mayscula
donde aumenta la identidad entre 45 78% (Cry1A, Cry1B, etc), en tercer lugar se asigna una
letra minscula que corresponde a identidades de entre 78 - 95% (Cry1Aa, Cry1Ab, etc) y
finalmente se utiliza de nuevo un nmero arbigo para identidades superiores al 95%
(Cry1Aa1, Cry1Aa2, etc). La extraordinaria diversidad de estas protenas insecticidas se cree
que es debido a un alto grado de plasticidad gentica. Muchos de estos genes estn asociados
a elementos transponibles que puede facilitar la amplificacin del gen, lo que lleva a la
evolucin de nuevas toxinas. (Izquierdo R. Lucia, 2011)
 III. LA DELTA ENDOTOXINA

3.1. Modo de accin

El ciclo infectivo se puede dividir en las siguientes etapas:
1. Primero, una larva ingiere las esporas y los cristales de B. thurigiensis que se encuentran
presentes en su alimento habitual.
2. A continuacin, las esporas y cristales viajan a lo largo del aparato digestivo de la larva,
hasta llegar al intestino medio. All, los cristales se disuelven a causa del pH del medio, que se
caracteriza por ser alcalino en los lepidpteros, en torno a pH = 10. A veces, las diferencias en
el grado de solubilizacin de este tipo de protenas puede explicar el grado de toxicidad de
cada una de las toxinas Cry en cada especie de insecto (Schnepf et al. 1998).
3. En este momento, las pro-toxinas estn de forma soluble en el medio y hace que, por
digestin proteoltica mediante la accin de proteasas del intestino del tipo tripsina y
quimiotripsina, se active la protena y pase a ser la toxina activada. Para que esto suceda, los
enzimas deben cortar unos 30 aminocidos del amino-terminal y una parte variable del
extremo carboxi-terminal de la protoxina, lo cual normalmente ocurre de forma progresiva,
cortando fragmentos de unos 10 kDa (Schnepf et al. 1998).
4. La toxina activa, se une a los receptores de naturaleza glicoprotena (cuyo peso est en
torno a 120- 180 kDa) presentes en las microvellosidades de las clulas epiteliales del intestino
medio.
4.1. El primer receptor (ej: Cadherina), se encarga de realizar un corte proteoltico a la toxina
eliminando una hlice . Esta caracterstica hace que esta protena se una con mucha afinidad
al siguiente receptor.
4.2. La unin de la toxina a un segundo receptor, hace que se formen poros de unos 0,6 nm
de radio en las clulas epiteliales de las microvellosidades que hace que stas rpidamente
se hinchen y pierdan funcionalidad debido a que se produce un intercambio de fluidos entre la
luz intestinal y la cavidad hemoclica, que produce un choque osmtico.
Estos receptores son claves para la actividad de las protenas Cry, ya que son especficos de
cada toxina y el nmero de ellos en el epitelio es importante para la accin de las mismas.
5. La lisis celular producida por estas toxinas puede ser suficiente para matar a la larva. Aun
as, las esporas pasan a la hemolinfa aprovechando las lesiones que ocasiona la toxina,
producindose as septicemia debido a que se produce la germinacin de las esporas en esta
zona y adems, ya en forma de bacteria, se puede reproducir de manera muy activa en este
fluido (van Frankenhuyzen 1993), debido a que se encuentra en un ambiente lo
suficientemente favorable como para germinar. A nivel de microscopa, se puede diferenciar
la fase de espora a la de bacteria porque esta ltima pierde la refringencia. Finalmente, estas
bacterias vuelven al medio exterior, donde comenzar de nuevo el ciclo infectivo. (Izquierdo
R. Lucia, 2011)

El primer sntoma detectado es la parlisis muscular del intestino, esto desemboca en que la
larva deja de alimentarse. A continuacin, se produce un rpido aumento del pH y de la
concentracin de K+ en la hemolinfa, que hace que la larva ralentice todos sus movimientos.
En este momento es cuando empieza un transcurso de vmitos, diarrea y despus la parlisis
intestinal se convierte en generalizada. Adems, desaparecen los movimientos reflejos y la
larva finalmente muere, originndose unas manchas oscuras en el tegumento. (Izquierdo R.
Lucia, 2011)

Cuando la protoxina entra al tracto digestivo de la larva, esta es solubilizada en el ambiente

alcalino del interior del intestino y es procesada a la forma toxica, por accin de los protozoos.
El siguiente paso es la unin de la toxina al receptor presente en la membrana intestinal del
insecto susceptible. Experimentos realizados con diferentes toxinas y diferentes insectos
blanco, han demostrado que existe una correlacin estricta entre unin de las toxinas al
receptor del insecto blanco y la toxicidad (Van Rie et. at .. 1990).
Aunque se ha reportado un papel muy importante del receptor en la toxicidad; en algunos
casos no es suficiente para matar al insecto, lo que sugieren que existen otros factores
involucrados en el mecanismo de accin de la toxina (Wolferoberger, 1990). Se han
encontrado que los receptores son diferentes en cada tipo de insectos, lo mismo que su
nmero y la eficiencia de unin entre la toxina y el receptor. Hasta el momento se conoce muy
poco sobre la naturaleza bioqumica del receptor y su papel fisiolgico dentro del intestino
larvario. El modelo aceptado a la fecha es que en la membrana del insecto existen diferentes
protenas que pueden funcionar como receptor de las toxinas de B. thuringiensis y que
diferente insectos pueden tener varios receptores en diferente cantidad que son reconocidos
especialmente por diferentes toxinas. De esta manera se explica la alta especificidad de accin
de la delta-endotoxina. La toxina de B. thuringiensis ejerce su accin biocida desde la
microvellosidad apical y esta no se internaliza, como lo demuestran estudios
inmuoacidoquimicos. (Bravo y Lorence, 1993).
En cuanto al efecto que produce la toxina en la membrana intestinal del insecto se ha
propuesto que altera el transporte de iones potasio de las clulas epiteliales (Sacchi et. al .,
1986). Mediante el uso de bloqueadores de canales de potasio.
(calcio y bario). Se ha demostrado que se puedes revertir y prevenir el efecto de la toxina en
un sistema in vitro a base de clulas epiteliales.(Crawford y Harvey. 1998).
Recientemente se ha logrado incorporar diferentes delta-endotoxinas en bicapas planas
sintticas, esto demostr que la toxina es capaz de incorporarse en membrana en ausencia
del receptor y que induce la formacin de un poro selectivo (Slatin el. At., 1990). Por otro lado,
no ha logrado incorporar a la toxina de B. thuringiensis en liposomas sisnteticos, en donde
tambin se ha visto que altera la permeabilidad de las membranas ( Yunovits y Yawetz, 1988).
Todos estos estudios demuestran que la toxina es capaz de interaccionar con membranas y
afectar su permeabilidad a diferentes iones. Al receptor se le ha dado un papel de catalizador
en la interaccin de la toxina con la membrana intestinal.
El modelo de accin aceptado es el siguiente: se propone que la unin de la toxina al receptor
disparara un cambio conformacional que induce la integracin de la toxina en la membrana.
La insercin en la membrana es rpida y la toxina no puede ser desplazada por otras toxinas
que comparten el mismo tipo de receptor, ya que la unin es irreversible. El extremo amino
terminal de la toxina de B. thuringiensis, se inserta en la membrana y estara encargado de la
formacin del poro. (Bravo y Lorence, 1993).
3.2. Desarrollo de la resistencia:
La toxina B. thuringiensis tiene un tiempo de permanencia muy corto en el medio ambiente,
esto aunado a que es altamente especifico, ha permitido que se desarrollen pocos insectos
resistentes a este insecticida. Sin embargo Mac- Gaughey en 1985, encontr que Plodia
interpuctella fue capaz de presentar resistencia a productos derivados de B. thuringiensis en
varias generaciones; concluyendo que esta se hereda en forma recesiva (Bravo y Quintero,
1993).
El mecanismo de resistencia a nivel molecular, se presenta con alteraciones en el receptor de
la toxina en el intestino del insecto. Se ha reportado que una disminucin en la afinidad del
receptor por alguna delta-endotoxina, puede provocar resistencia hacia la misma. Sin embargo
como en un mismo insecto existen distintos receptores para diferentes delta-endotoxinas, un
insecto que puede desarrollar resistencia contra una toxina y seguir siendo igualmente o ms
sensible a una segunda delta- endotoxina (Van Rie et. al., 1990).
Se ha sugerido que la aplicacin a campos de cultivo con productos de B. thuringiensis debe
estar constituido por dos o ms tipos diferentes de delta-endotoxina, que acten sobre el
mismo insecto pero que se unan a diferente receptor siendo una buena alternativa para
demorar el desarrollo de resistencia. Otra propuesta ha sido la rotacin de insecticidas
qumicos con productos basados en B. thuringiensis. Con la misma idea se ha propuesto el
uso alternado de diferentes insecticidas que contengan diferentes delta endotoxinas pero que
se unan a diferentes receptores (Fox, 1991).

IV. USO COMO BIOINSECTICIDA

Se estima que a nivel mundial el 15% de las perdidas en agricultura se debe nicamente al
ataque de insectos, aunque en algunos pases es mucho mayor; como es el caso de Mxico,
donde estudios realizados por la FAO han llegado a establecer que las prdidas ocasionadas
por el ataque de insectos es de 20 -30%; de all el gran inters en desarrollar insecticidas
efectivos en l control de insectos plaga (Altieri; 1988).
Desde hace varios aos los pases industrializados han iniciado la bsqueda de sistemas de
control biolgico menos txicos para el hombre y el ecosistema en general., de mayor
eficiencia y especialidad. Esto significa que habr un crecimiento muy importante de nuevos
productos, entre los cuales los bioinsecticidas tendrn una participacin muy relevante; siendo
B. thuringiensis el producto comercial de mayor difusin y uso mundial. En 1990 el mercado
de B. thuringiensis era de 105 millones de dlares y se estima que esta cifra se duplicara en
el ao 2000, este crecimiento indica las grande expectativas que se tiene para B. thuringiensis
(Feitelson, et. al., 1992).

4.1 Espectro de accion en el control de plagas

Se han identificado una gran cantidad de cepas de B. thuringiensis con diferente rango de
accin insecticida, la mayora de cepas tienen actividad contra lepidpteros, pero tambin se
han encontrado cepas con actividad contra dpteros, colepteros, caros, platelmintos y
nematodos (Feitelson, et, al, 1992).

En la tabla 2, se muestra el espectro de accin de B. thuringiensis contra insectos plaga.

Tabla 2. Espectro de accin de Bacillus truringiensis contra insectos plaga.
INSECTO PLAGA PLANTA HOSPEDERA
Nombre Cientifico Nombre Comun
Agrotis sp. Gusano cortador Algodn, cereales, crucferas,
curcubitaceas, tabaco.

Alsophila sp. Gusano de cancer Ornamentales

Anticarcia sp. Gusano terciopelo Soya, Albahaca
Autographa sp. Gusano medidor Alfalfa
Batrachedra comosaea Pia
Copitarsia sp. Gusano corazn de col Cruciferas, garbanzo, fresa,
melon, pepino, sandia.
Desmia sp. Enrollador Vid
Diatrea sp. Gusano barrenador Caa de azucar, cereales,
bocoli, berenjena, maiz
Diphania sp. Perforador del melon Cucubitaceas
Eudamus sp. Enrollador de hoja Frijol, papas
Keiferia sp Gusano aguja Tomate
Ostrinia nubalis Gusano barrenador maiz Maiz
Scrobipalpula sp. Gusano cogollero Tomate
Fuente: Bravo y Quintero (1993)
4.2 Proceso de produccion

El proceso de produccin de B. truhingiensis puede dividirse en las siguientes etapas: a)

Fermentacin, b) Separacin de esporas y cristales, c) Secado, d) Formulacin y e) Envasado.

A nivel industrial el proceso de produccin se lleva a cabo generalmente en lotes (batch). La

fermentacin se realiza en bioreactores comerciales con control de temperatura, pH y otro
parmetro el cultivo se hace por lo general sumergido por lo general con una duracin de 40
horas (Bravo y Lorence, 1993).
La composicin de un medio tpico y las condiciones experimentales de B. thuringiensis se
muestran en la tabla 3.

Tabla 3. Composicin de un medio de cultivo tpico y condiciones experimentales

recomendadas para obtener altos rendimientos de Bacillus thuringiensis

COMPOSICION DEL MEDIO DE CULTIVO (g/L) CONDICIONES EXPERIMENTALES

Glucosa (30) Fermentador de 500 L
Licor macerado de maiz (5) Temperatura 32C
Peptona de soya (2) pH 6.2 7.4
Extracto de levadura (4.5) Aireacion 3 vvm
KCl (3) Agitacion 120-160rpm
(NH4)2 SO4 Tiempo de cultivo 60h
CaCL2H2O (0.036) Rendimiento 4 x10 ucf/mL
FeSO4 . 7H2O (0.0135)
H3PO4 (7ml)
CuSO4 . 5H2O (0.0075)
ZnSO4 . 7H2O (0.0075)
MnSO4 . 4H2O (0.04)
Fuente. Bravo y Quintero (1993).

La separacin de las especies y los cristales se lleva a cabo comnmente mediante un proceso
de centrifugacin. Dada la termoestabilidad del producto, el proceso de secado se realiza
preferentamente en un secador por aspersin. La mezcla de los ingredientes de las
formulaciones solidas se lleva a cabo por lo general en tambores rotatorios o en mezcladores
tipo y; para el caso de formulaciones lquidas, la mezcla de los ingredientes de la formulacin
se hace en tanques agitados ( Bravo y Lorence, 1993).
Pustzal. Et al (1991), encontraron que el mecanismo principal de inactivacin de los cristales
de B. thuringiensis causada por la luz solar es el proceso de fotosensibilizacin; dicho proceso
involucra la presencia de un cromforo (absorbido dentro o en la superficie del cristal). Estos
autores demostraron que los cristales son ms estables a la luz solar, mientras menos tiempo
estn en contacto con el medio de cultivo; con estos resultados proponen que un mecanismo
adecuado para aumentar la estabilidad de los cristales a la inactivacin causada por la luz es
centrifugar a las clulas de B. thuringiensis de que stas liberen las esporas y los cristales,
lavar con agua para eliminar los residuos de medio de cultivo y causar la citlisis por agitacin
en medio acuoso con 50% v/v de glicerol.

4.3. Formulaciones
Los productos comerciales de B. thuringiensis se presentan como formulaciones solidas o
liquidas. Las formulaciones solidas pueden ser polvos mojables i granulados dispersables,
obtenidos al mezclar las esporas y cristales proteicos de B. Thuringiensis, con materiales
inertes como minerales orgnicos, tales como: Borosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, o
con materiales biolgicos como la mazorca de maz y cascara de nuez. Estas formulaciones
pueden incluir adyuvantes para la dispersin, agentes estabilizantes, otros aditivos y
surfactantes. Los productos son aplicados a plantas, suelo, agua o a granos almacenados por
aspersin o espolvore (pusztal et. Al., 1991).
Las formulaciones liquidas pueden ser de base acuosa o no acuosa y se emplea como
espumas, geles, suspensiones o concentraciones emulsionantes. Los ingredientes pueden
incluir agentes geolgicos, surfactantes, emulsionantes, dispersantes y polmeros. Un
ingrediente comn en ambos tipos de formulaciones liquidas o slidas, son la foto protectores
ya que la inactivacin de las preparaciones de B. thuringiensis por la accin de la luz solar es
un problema que afecta la eficacia de estos bioinsenticidas (pusztal et. Al., 1991).
La mayora de los productos comerciales B. thurigiensis se presentan en forma de polvos
humectante y de suspensiones emulsionables. La variedad de B. thurigiensis mas usada como
base de las formulaciones destinadas al combate de lepidpteros es la kursati; mientras que
para el combate de moscas y mosquitos se usan preparaciones a base de la variedad
Israeliensis, as como la variedad tenebrionis es la base de productos contra colepteros. El
uso de diferentes unidades (esporas /ml., gr. De biomasa/L., gr. De clulas/gr. De glucosa)
para describir la potencia y actividad de los productos analizados, dificulta la comparacin de
los mismos, (Bravo y Lorence, 1993).

Tabla 4. Productos comerciales producidos a partir de diferentes variedades de Bacillus

thuringiensis.
PRODUCTO VARIEDAD OBJETIVO
1 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros
2
82 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros
1 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros

3 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros
10
4 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros

3 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros
12
63 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros
4 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros
1
4 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros
1 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros

488 2 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros
2 Tenebrionis/ 8a 8b Larvas coleopteros

2 Israeliensis/ H14 Larvas dipteros
4 Kurstaki/ H3 Larvas lepidodpteros

3 Kurstaki/ SA- 11 Larvas lepidodpteros
1 Kurstaki/ 11a 11b Larvas lepidodpteros

4 Tenebrionis/ 8a 8b Larvas coleopteros
1 Kurstaki/ E6 2371 Larvas lepidodpteros

1.Polvo humectable 2. Concentrado diluible 3. Granulo dispersable 4. Suspension acuosa

Fuente: bravo y quintero (1993)

V. ORGANISMOS TRANSFORMADORES CON GENES DE LA DELTA-

ENDOOXINA
5.1 Plantas transgnicas

Los genes Cry de Bacillus thuringiensis se convirtieron en los candidatos ideales para
transformar plantas, debido a que para obtener actividad insecticida se requiere solo de la
expresin de una sola protena de delta-endotoxina. (Vaeck et. al. 1987)

La ingeniera gentica desarroll muchas especies de plantas que expresan genes cry de
B. thuringiensis y las convirti as en plantas insecticidas. Comnmente se hace referencia
a este tipo de plantas como plantas o cultivos Bt (por ejemplo, maz Bt, algodn Bt, etc.).
(D.Sauka y G. Benintende, 2008)

El primer grupo que tuvo xito en la transformacin de plantas con este gen fue la compaa
Plant Genetic Systems in 1987, logrando la transformacin en tabaco con la porcin txica
del gen Cry IA (b), utilizando un promotor fusionado al gen de la toxina con el gen de
resistencia a la Kanamicina con el propsito de facilitar la seleccin de las transformantes
(Vaeck et. al. 1987) Desde entonces, al menos diez tipos de genes Cry distintos se
introdujeron en 26 especies vegetales: cry1Aa, cry1Ab, cry1Ac, cry1Ba, cry1Ca, cry1H,
cry2Aa, cry3A, cry6A y cry9C. (D.Sauka y G. Benintende, 2008)

El segundo reporte de transformacin de plantas con genes E. thuringiensis fue de la

compaa Mosanto, con la expresin del fragmento txico del gen Cry IA (b) en tomate.
Para la expresin de este gen se utiliz el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor.
En el mismo ao la compaa Agracetus report la expresin del gen Cry IA (b) en tabaco
utilizando tambin el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, pero unido a una
secuencia lder del virus del mosaico de alfalfa. (Fischhoff et al. ,1987)

Actualmente se han transformado otras plantas como papa y algodn: y se estn realizando
esfuerzos para transformar otras, como se muestra en la Tabla 5. Tambien se han utilizado
otros genes como el Cry IA (c) y Cry IIIA.

Tabla 5. Plantas transformadas con genes de Bacilus t. que han sido llevadas a nivel de
campo.

PRODUCTOS
ALIMENTOS BSICOS FRUTAS HORTALIZAS
INDUSTRIALES
Abeto Arroz Nuez Tomate
Alamo Maiz Uva
Algodn Papa Manzana
Caa de azucar
Petunia
Remolacha
Tabaco
Girasol
FUENTE: Perlak et. al. (1991)

Agrobacterium tumefaciens, es el sistema biolgico ms usado en la transformacin de

plantas superiores esta bacteria es capaz de transferir un elemento mvil de su plsmido Ti
dentro del genoma de la planta hospedera. Se ha comprobado que casi todo el ADN-T del
plsmido, a excepcin de 25 pares de bases de cada extremo, pueden reemplazarse por un
ADN forneo sin que pierda la capacidad de integracin al genoma de la planta (Reed y
Rhem, 1994)

5.1.1. Ventajas

Sin duda la ventaja ms importante es la econmica, ya que como la toxina se expresa

constantemente en la planta, no es necesario hacer explicaciones de insecticidas; por lo que
los costos en mantenimiento de los cultivos se reducen considerablemente. Una segunda
ventaja es que no se daa el medio ambiente, pues la toxina est contenida dentro de la
planta y no es lavada por la lluvia, por ello no existe ningn peligro de contaminacin de
suelos y ros. Adems es efectivo y tambin se protegen partes de la planta que antes eran
casi imposible de hacerlo, por ejemplo la raz, por ltimo, slo ataca a los insectos parsitos
(Bravo y Quintero, 1993) .

El empleo de este tipo de plantas posee la ventaja de reducir la necesidad de aplicar

insecticidas y de proveer una proteccin duradera a lo largo de la temporada de cultivo. Otra
caracterstica muy importante que poseen es que los nicos insectos expuestos a la toxina
son aquellos que se encuentran alimentndose de los cultivos y no otros. No obstante, la
mayor ventaja de estas plantas Bt es que brindan a los agricultores una alternativa al uso de
pesticidas qumicos tradicionales y constituyen una herramienta para el control de plagas de
importancia econmica que son difciles de controlar por los primeros. Todas estas ventajas
se veran reflejadas finalmente en beneficios enormes para la produccin de alimentos y en
una calidad medioambiental mejor en todo el mundo. (D.Sauka y G. Benintende, 2008)

5.1.2. Desventajas
Una de las dificultades, es obtener niveles de expresin de la toxinas suficientemente altos
para matar a diferentes tipos de larvas; se ha reportado que no todos los insectos son
igualmente susceptibles a determinadas delta-endotoxinas, por lo que una dosis muy baja
podra no afectar a una plaga ms tolerante. Otra desventaja importante es el desarrollo de
insectos resistentes. Por ltimo, los cultivos que expresan protenas de delta-endotoxina son
organismos transgnicos y el proceso de registro para su comercializacin es muy lento y
costoso, lo que resulta un gran obstculo (Bravo y Quintero. 1993) .

Poseen la gran desventaja que radica en la posible generacin de resistencia en ciertas

poblaciones naturales de insectos que se alimentan de ellas. Este fenmeno determinara la
inutilizacin de determinadas protenas Cry para su control, ya sea mediante su empleo en
plantas transgnicas o con los bioinsecticidas que los contengan. (D.Sauka y G. Benintende,
2008)

Actualmente existen una gran cantidad de plantas que han sido transformadas con genes de
delta-endotoxina, pero ninguna se ha liberado para su comercializacin, pues se requiere
probar que efectivamente la delta-endotoxina no es txica para el hombre u otros animales.
Hasta el momento los estudios de toxicologa con protoxinas no han mostrado efecto alguno
(Goldburg y Tjaden, 1990) .

5.2 Bacterias transgnicas

Muchas bacterias del suelo han sido transformadas con los genes B. thuringiensis. El uso de
estas bacterias transgenicas han permitido extender el rango de distribucion de la delta-
endotoxina al habitar otros nichos ecologicos: como es el caso de Clavibacter xyli, bacteria
endofita que crece en el tejido vascular del maiz y de otras plantas, o Pseudomonas y
Agrobacterium, bacterias que crecen en la zona de la rizosfera y Bradyrhizobium que adems
de crecer en la rizosfera, coloniza las raices en una relacion simbiotica con la planta formando
nuevas estructuras denominadas ndulos, dentro de estos la bacteria se reproduce y fija el
nitrogeno. Se ha demostrado que Bradyrhizobium transformada con el gen de la delta-
endotoxina produce ndulos que son resistentes al ataque de larvas de Rivella angulata, lo
que estos insectos preferencialmente se alimentan de las zonas noduladas y no del resto de
la raiz (Nambiar et. al,1990)

El utilizar otras bacterias como vehiculos portadores de la proteina insecticida ha resultado

de gran eficacia, ya que ademas de proveer constantemente de esta proteina a las plantas,
presentan una ventaja respecto a Bacillus thuringiensis, pues este no sobrevive muy bien en
el suelo y adems el cristal es rapidamente inactivado en el ambiente, especificamente por
la luz ultravioleta de los rayos solares (Pusztal et. ak.,1991)

La compaa Mycogen ha desarrollado una estrategia denominada encapsulacion de celulas

muertas, para evitar la degradacion de la toxina y aumentar su permanencia en el ambiente.
Su tcnica consiste en utilizar Pseudomonas transformadas con el gen de delta-endotoxina
para producir los cristales insecticidas en fermentadores; como esta bacteria no esporula, los
cristales no son liberados al medio de cultivo. Al final de la fermentacion agregan un fijador
que mata a las clulas conteniendo la proteina insecticida. Actualmente constituye el unico
 producto transgenico portador de genes de B. thuringiensis que ha sido aceptado
comercialmente. (Bravo y Quintero, 1993)

5.3 Virus portadores del gen de la delta endotoxina

Los agentes Cry han sido utilizados para aumentar la patogenicidad de ciertos virus que
atacan a insectos. Los baculovirus son patgenos especficos de insectos, cuyo principal
problema es que los matan lentamente, por lo que no son considerados como una
herramienta eficaz en el control de insectos plaga. Los genes Cry IA (b) y Cry IA (c) fueron
introducidos en el genoma del virus de Autographa californica, bajo el control del promotor
tardo de la protena polihedrina (Martens. Et al., 1990).

La deltaendotoxina se expresa muy bien en las clulas de los insectos infectados con los
virus transgnicos; sin embargo no se tiene una patogenicidad mayor del virus, debido a que
el sitio de expresin no es el sitio de accin, pero se ha propuesto que como el virus induce
la expresin de la toxina en la larva infectada, cuando este muere deja restos de la toxina en
la superficie de la planta y puede tener un efecto importante en la poblacin de insectos plaga
(Bravo y Quintero, 1993).

VI. CONCLUSIONES

El espectro de accin de las diferentes delta-endotoxinas de B. thuringiensis es

bastante amplio, encontrndose actividad contra lepidpteros, dpteros, colepteros,
caros, platelmintos y nematodos.
Es posible encontrar en un futuro nuevas toxinas con diferentes espectros de accin.
B. thuringiensis ofrece ventajas muy importantes como insecticida porque es seguro
para el hombre y no contamina el medio ambiente.
Con las tcnicas de ingeniera gentica se desarrollarn nuevos productos con mejor
distribucin y calidad del insecticida, ya que se podrn disear nuevas combinaciones
de delta-endotoxinas que permitirn el control de un mayor nmero de insectos plaga.
Las plantas transgnicas sern el medio ms eficiente y econmico para distribuir a
toxina de B. thuringiensis; sin embargo stas no estarn en el mercado hasta fines de
los aos noventa.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

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