PREPARACIN DEL DNS, CURVA DE CALIBRACIN Y DETERMINACION DE AZUCARES

REDUCTORES POR EL METODO DEL DNS

PASOS PARA PREPARAR DNS:

1. Disolver 1.6 g de NaOH en H2O destilada.

2. Adicionar 30 g de tartrato de Na y K
3. Adicionar 1 g de DNS
4. Aforar a 100 mL con H2O destilada
5. Almacenar en frascos mbar a 4 C

Se debe mantener un stock de glucosa 4 mg/mL y almacenarlo a 4 C.

A partir de la solucin de glucosa se preparan las soluciones para hacer la curva patrn con la
siguientes concentraciones (g/L): 0.25, 0.5, 1, 2 y 4.

DETERMINACIN DE AZCARES REDUCTORES POR EL MTODO DEL DNS

1. Tomar 0.5 mL de cada dilucin y agregar 0.5 mL de reactivo DNS.

2. Preparar una muestra blanco por dilucin de 0.5 mL de H2O destilada a 0.5 mL del
reactivo de DNS.
3. Agitar todas las muestras.
4. Colocar a ebullir las muestras en bao mara por 5 minutos.
5. Enfriar con hielo.
6. Adicionar 5 mL de H2O destilada.
7. Agitar y dejar en reposo 15 min.
8. Leer a 540 nm.
9. Realizar la curva Absorbancia versus concentracin. Debe tener un coeficiente de
correlacin de 0.991 a 0.999.
DETERMINACIN DE ETANOL.

MARCHA ANALTICA.

Este mtodo puede aplicarse solo con soluciones diluidas, por lo cual la muestra original debe
diluirse a 100 o 1000 veces, segn el grado de concentracin. La muestra a diluir debe tomarse
con jeringa, a fin de evitar vaporizaciones por succin. Tanto al llenar como vaciar la jeringa, su
extremo debe encontrarse sumergido en el lquido. La marcha a seguir con la muestra diluida
es la siguiente:

a) Prepare en un Erlenmeyer una mezcla con 25 cc de dicromato de potasio (K2Cr2O7)

0,1 N y 10 cc de cido sulfrico concentrado.
b) Agregue a la mezcla anterior 10 cc de la solucin a analizar y deje en reposo durante
30 minutos para que ocurra la reaccin:

c) Aada a la mezcla anterior 10 cc de solucin de yoduro de potasio al 10%

d) Titule de inmediato el yodo puesto en libertad durante la reaccin anterior con

tiosulfato de sodio 0,1 N y 0,5 cc de solucin de almidn como indicador:

e) Prepare un blanco siguiendo el proceso descrito pero con agua en lugar de la muestra.

Clculos:

Concentracin de etanol en la muestra original.

Donde:

C: concentracin, g/L

a: volumen de tiosulfato gastado en el blanco

b: volumen de tiosulfato gastado en la muestra

F: factor de dilucin de la muestra

N: normalidad del tiosulfato de sodio

v: volumen de solucin titulada

METODO DE MICRODIFUSION

Determinacin por el mtodo de Winnick o Microdifusin.

Fundamento:

El mtodo de Winnick permite la determinacin de etanol en muestras biolgicas como sangre,

suero, plasma, etc. El mtodo se basa en la reaccin de xido reduccin del etanol con el
dicromato de potasio en medio cido, el producto final de la reaccin es un compuesto
coloreado el cual puede ser determinado espectrofotomtricamente o por titulacin con
tiosulfato de sodio y almidn como indicador. La liberacin del etanol de la muestra biolgica se
basa en la volatilidad del etanol a la temperatura del ensayo y la reaccin con el dicromato de
potasio, lo cual ocurre en la cmara de difusin de Conway. La cuantificacin se hace con base
en la curva de calibracin realizada con un estndar certificado de etanol o utilizando los factores
descritos en el mtodo.

Materiales

Estufa de calentamiento programable hasta 240C

Balanza analtica
Bureta o microbureta, Clase A, de 10 a 25 ml de capacidad
Otros elementos de laboratorio para la realizacin del anlisis comprende: cmaras de
difusin de Conway, micropipetas, balones y otros elementos de uso rutinario en el
laboratorio.

Reactivos:

a. Dicromato de potasio (0,4 N), en H2SO4 (10 N): Se puede utilizar ampolleta de titrisol de
dicromato de potasio 1/10 N (1/60 mol/L), la cual se transfiere cuantitativamente a un baln de
250 ml, se enjuaga varias veces con cido sulfrico 10N permitiendo que los enjuagues sean
recibidos en el mismo baln y se completa a volumen con el cido, en todo momento se deben
seguir las recomendaciones del fabricante descritas en el instructivo que acompaa al producto.

En caso de no contar con ampolleta de titrisol, pesar 19,614 g de dicromato de potasio K2Cr2O7,
previamente pulverizado y secado en estufa a 100C, durante 4 a 6 horas y enfriado en
desecador, disolver con cido sulfrico 10 N en un baln aforado de 1000 ml y completar a
volumen con el cido.

Acido sulfrico 10N: Medir 490 ml de cido sulfrico concentrado, de densidad 1,835 g/ml y
pureza del 96%, completar a 1000 ml agua hervida, y fra; agregar el H2SO4 lentamente y
refrigerando, luego completar a volumen con H2O hervida y fra.

ADVERTENCIA: Se debe tener cuidado en la preparacin de la solucin de cido sulfrico debido

a que esta reaccin es exotrmica y produce desprendimiento de calor, el cido se debe agregar
al agua lentamente (Nunca al contrario). Se recomienda colocar el baln en el que se realiza la
dilucin en un bao de hielo o enfriar bajo chorro de agua. Se debe tener en cuenta que al
enfriarse la solucin se produce una contraccin del volumen, por lo que una vez fra la solucin
se completa a volumen con agua destilada.

b. tiosulfato de sodio 0.1 n: Se puede utilizar ampolleta de titrisol de tiosulfato de sodio 1/10 N
(0,1 mol/L), la cual se transfiere cuantitativamente a un baln de 1000 ml, se enjuaga varias
veces con agua destilada permitiendo que los enjuagues sean recibidos en el mismo baln y se
completa a volumen con agua destilada, en todo momento se deben seguir las recomendaciones
del fabricante descritas en el instructivo que acompaa al producto.

En caso de no contar con titrisol, pesar 28,818 g de tiosulfato de sodio pentahidratado RA y

completar a volumen con agua destilada hervida y fra.

c. almidon s.r. Pesar 1 g de almidn soluble, triturar con 10 ml de agua destilada y fra y verter
lentamente con agitacin constante en 200 ml de agua destilada en ebullicin hasta obtener un
lquido translcido y ligero. Dejar decantar y emplear nicamente el lquido sobrenadante. Esta
solucin debe ser recin preparada. Se puede almacenar en recipiente limpio, tipo frasco gotero,
en refrigeracin hasta por dos meses, en estos casos debe verificarse que no se presenta
crecimiento de hongos, en cuyo caso debe ser desechado

d. carbonato de potasio o de sodio al 20% Pesar 20 g de carbonato de potasio, disolver en agua

destilada y completar a 100 ml.

e. ioduro de potasio 3N: Pesar 49,8 g de yoduro de potasio RA, disolver en agua y completar a
100 ml. Almacenar en frasco color mbar, no utilizar el reactivo si ha cambiado su color original.

Procedimiento x4

Medir 0,5 ml de dicromato de potasio 0,4 N preparado en cido sulfrico y colocarlo en

el compartimiento interno de la celda de Conway.
Medir 1 ml de carbonato de potasio al 20% y colocarlo en el compartimiento exterior de
la celda.
Medir 1 ml de sangre y colocarla en el compartimiento exterior, en donde est el
carbonato. Tapar la celda, agregndole vaselina u otra sustancia en el borde dela tapa
para que quede hermticamente cerrada y evitar la evaporacin del etanol.
Mezclar por rotacin suave para que se reparta la sangre en el carbonato de potasio y
colocar la celda en estufa a 50 C durante dos horas o a temperatura ambiente durante
24 horas. El alcohol etlico se volatiliza y es atrapado por el dicromato de potasio.
Observar el color de la solucin del compartimiento interno; si la prueba es positiva el
dicromato cambia de color, pasa de amarillo a verdoso, y luego a azul por oxidacin; si
la prueba es negativa no se produce cambio del color amarillo del dicromato. Cuando se
presenta color azul, se repite el ensayo con 0,5 ml de sangre, se titula y se duplica el
resultado.
Antes de la titulacin se aplica 0.5 ml de Yoduro de potasio 3 N y 1 gota de Almidn
hidrosoluble al 1%.
Para los clculos, se halla la diferencia entre la titulacin del blanco y el problema, y se
multiplica por el factor 1,15 para obtener en forma directa la concentracin de etanol
en mg / 100 ml.
Tambin se puede calcular la cantidad de etanol en la muestra utilizando la siguiente
ecuacin:

Etanol (mg/100ml) = N * (Vb Vm) / volumen de muestra * 11,51 *100

Donde:

N = normalidad del tiosulfato

Vb: volumen de tiosulfato consumidos en la titulacin del blanco

Vm: volumen de tiosulfato consumidos en la titulacin de la muestra

11,51: PM del etanol / 4 (reaccin Redox)

La cuantificacin se puede realizar preparando una solucin stock de etanol y a partir de ella
preparar soluciones en el rango de 25 a 250 mg / 100 ml.

Procesar siempre bajo las mismas condiciones un blanco negativo y al menos un control positivo,
de concentracin cercana al lmite de deteccin, con cada lote de muestras.

Tiempo de duracin del anlisis: 3 horas

Caractersticas del mtodo:

El rango de trabajo de es 20 a 225 mg %. La menor concentracin de etanol que puede ser

determinado con confiabilidad depende de la capacidad de la bureta, generalmente no es
conveniente reportar valores menores al 20 mg%. La precisin es menor al 10 % y la exactitud
se encuentra entre el 90 al 110% en el rango estudiado.

El mtodo no es especfico para etanol, responde a sustancias oxidantes bajo las condiciones del
ensayo, es decir otros alcoholes como metanol, 2- propanol, acetaldehdo, formaldehido,
propanaldehido, alcohol amlico, octanol, ter etlico y en general cualquier sustancia voltil que
pueda reducir el dicromato en las condiciones de ensayo produce resultados falsos positivos. El
cloroformo, benceno, tetracloruro de carbono, tricloroetileno no son falsos positivos.

No es un mtodo especfico, otros alcoholes adems del etanol dan positivo al test.