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LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
PRCTICA N 04
CRECIMIENTO BACTERIANO
I.OBJETIVO
Desarrollar algunas tcnicas comunes para medir el crecimiento bacteriano en
poblaciones, tanto en clulas vivas, como en muertas, comprendiendo su fundamento
y aplicacin.
Es una placa de vidrio con una cuadrcula en depresin donde se deposita la muestra
medida. Es posible relacionar el nmero de clulas observadas en la superficie de un cuadro,
con el volumen de esa rea. Considerando los volmenes en la cuadrcula se puede calcular
la concentracin de microorganismos por ml. Conteo turbidimtrico: En una suspensin
microbiana, la cantidad de clulas est directamente relacionada con la turbiedad o densidad
ptica de la misma e inversamente relacionada con la cantidad de luz que pasa a travs de
ella. Esto permite determinar con bastante exactitud la cantidad de microorganismos en la
suspensin mediante la determinacin de la turbiedad mediante un nefelmetro o un
espectrofotmetro. Los resultados se comparan con una curva estndar construida con una
suspensin testigo de concentraciones conocidas. La turbiedad que resulta en la suspensin
microbiana se aproxima a la producida por un cierto nmero de clulas en suspensin. Esta
tcnica es til solamente para organismos unicelulares de pocos mm, como las bacterias, lo
que les permite mantenerse suspendidos y homogneamente distribuidos. Contadores
electrnicos: Se hace pasar un volumen conocido de la muestra con microorganismos a
travs de un orificio de 5 a 10 mm de dimetro, mediante manipulacin con una micropipeta
de mercurio. La resistencia elctrica a travs del orificio est normalizada y se altera cada vez
que un microorganismo pasa a travs de l. La modificacin de la resistencia se amplifica y
se registra electrnicamente. Mtodos de conteo en medio de cultivo: Mediante cultivo de la
muestra, se detectan nicamente las clulas vivas. En todos los casos se parte de un
volumen o peso de muestra conocido. Conociendo la procedencia de la muestra se puede
esperar la obtencin de cuentas bajas o altas o incluso ausencia de organismos. Si se
esperan pocos microorganismos, las muestras se pueden centrifugar o filtrar. Si se esperan
cuentas altas, se puede diluir la muestra en cantidades conocidas del diluyente, utilizando
solucin salina, agua peptonada u otros. - Mtodo de las diluciones y vaciado en placa -
Tcnica de conteo en placa por extensin superficial - Recuento por filtro de membrana -
Siembra en tubo o recuento del nmero ms probable - Mtodo de la gota o de Miles y Misra.
Otros mtodos Determinacin del peso seco, determinacin del nitrgeno en las clulas
cultivadas, medicin de actividades bioqumicas.
III.MATERIALES DE LABORATORIO
MATERIAL BIOLGICO:
- Medio de cultivo previamente fundido y manteniendo una Temperatura de 50 C.
- Cultivos de E. coli
- Caldo nutritivo
MATERIALES Y EQUIPOS:
- Microscopio
- Portaobjetos
- Cubreobjetos
- 7 tubos de ensayo de 16 x 150 mm
- Gradillas
- 7 Placas Petri
- Pipetas
- Pizeta con agua destilada
- Incubadora
- Cmara cuenta colonias
- Fotocolormetro
- Galvanmetro
- Mechero Bunsen
REACTIVOS:
- Azul de metileno de Leffler.
- Solucin salina isotnica
- Alcohol
A. DETALLES EXPERIMENTALES
PROCEDIMIENTO - MTODOS:
Superficie de la preparacin
--------------------------------------------------- = nmero de campos microscpicos
Superficie del campo microscpico
10. Coloque en la platina del microscopio la preparacin teida de las bacterias y cuente las
bacterias en 10 campos. Obtenga el valor medio de organismos por campo microscpico.
11. Calcule el nmero de bacterias que hay en la preparacin (0.01 ml) y en 1 ml del cultivo,
con la frmula: # de bacterias x # de campos = # de bacterias x 100 = # bacterias/ml por
campo microscpicos en la preparacin de cultivo.
1. Prepare 7 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con 9 ml de diluyente estril cada uno (agua
peptonada al 0.1 % o una solucin salina isotnica). Mrquelos con las diluciones desde 1 x
10-2 hasta 1 x 10-8.
2. Marque 7 cajas de Petri vacas estriles con los mismos nmeros de las diluciones. Haga
duplicados con otras 7 cajas.
3. En condiciones estriles tome 10 ml de una suspensin bacteriana (puede ser E. coli), con
una pipeta estril y depostelos en el frasco con diluyente. Descarte la pipeta y colquela en
un frasco con desinfectante.
4. Tape el frasco con la muestra y agite vigorosamente, aproximadamente 25 veces. Esta
ser la dilucin 1:10.
5. Con una nueva pipeta estril tome 1 ml y transfiera al tubo de la dilucin 1:100, mezclando
en igual forma y descartando la pipeta.
6. Con una nueva pipeta distribuya alcuotas de 1 ml al tubo de la dilucin 1:1000 y a las dos
cajas de Petri correspondientes marcadas. Descarte la pipeta.
7. Repita el procedimiento mezclando bien la dilucin 1:1000 y con una nueva pipeta
distribuya alcuotas al tubo de la siguiente dilucin y sus dos cajas correspondientes y as
sucesivamente con las siguientes diluciones.
8. Enseguida adicione a cada caja aproximadamente 20 mL de medio de cultivo previamente
fundido y mantenido a 50 C. Al tapar cada caja, vaya mezclando el contenido muy
cuidadosamente, rotando la caja suavemente sobre la mesa, para que no se derrame el
lquido.
9. Deje solidificar a temperatura ambiente e incube 24 horas a 37 C.
10. Cuente las colonias desarrolladas bajo la cmara cuenta colonias. El nmero vlido del
conteo es entre 20 y 200 / caja. El nmero de colonias por caja (UFC) equivale a 1 mL de la
muestra inoculada. Calcule la cantidad de colonias por mL y por gr de muestra, mediante la
siguiente frmula:
Este mismo experimento permitir medir el crecimiento de una bacteria y obtener su curva de
crecimiento.
1. Siembre 0.1 ml de cultivo de E. coli en 13 tubos con 10 ml de caldo nutritivo.
2. Incube todos los tubos a 37 C.
3. Deje un tubo control del mismo medio, sin inocular y gurdelo en el refrigerador, servir
para ajustar el fotocolormetro a 100 % de transmitancia, antes de las lecturas.
4. Cada hora saque un tubo y determine la transmitancia en el fotocolormetro.
5. Dibuje una curva con los valores obtenidos, durante el crecimiento de la bacteria.
6. Observe algunas de las etapas de crecimiento: fase Lag, fase logartmica. Para determinar
el resto de las fases se requieren de 24 a 48 horas.
IV. CUESTIONARIO:
V. BIBLIOGRAFA
1. AQUIAHUATI, M. Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa General;
Universidad Autnoma Metropolitana; Mxico; 2004.
2. GARZN, G.G. Fundamentos de Qumica general, 211 ed. Mxico: Mc. Graw-Hill, 1986.
144p.
3. WILLEY Y OTROS., Microbiologa de Prescott, Harley Klein. 7 ed. Madrid: Interamericana
de Espaa S. A.2009. 1086 p. ISBN: 978-84-481-6827-8
4. TORTORA.FUNKE.CASE. Introduccin a la microbiologa. 9 ed. Madrid: Editorial Mdica
Panamericana S.A. 2007. 931p. ISBN:978-950-06-0740-7
5. MADIGAN, M. Martinko, J. y J. PARKER. Biologa de los microorganismos. 10a ed. Espaa:
Editorial Pearson educacin, S. A. 2006. 1008p.ISBN: 0-13-066271-2.
6. KARP, G. Biologa celular y Molecular: Conceptos y experimentos. 4a ed. Mxico: Mc. Graw-
Hill Interamericana Editores. 2011. 765p. ISBN: 978-607-15-0504-0
7. AQUIAHUATI, M. Manual de Prcticas de Laboratorio de Microbiologa General; Universidad
Autnoma Metropolitana; Mxico; 2004.
8.
9. SAWWYER, C. McCARTY, P. PARKIN, G. Qumica para Ingeniera Ambiental. 4 ed.
Editorial McGraw Hill. 2001, 716 p. ISBN: 9584101641
10. SHARPE, A. Qumica Inorgnica. 1 ed. Editorial Reverte S.A. 2008. 584 p. ISBN:
8429175016.
8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Las referencias se deben colocar segn el estilo APA deben ordenarse alfabticamente,
sangra en la segunda lnea para diferenciar del dato principal; Apellido y Nombre del autor,
edicin, ao, titulo, editorial, Pas, etc.,
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