Produccin de anticuerpos monoclonales (mAb).

El fundamento de la tcnica de la produccin de anticuerpos monoclonales consiste en fusionar

clulas de mieloma de ratn con linfocitos B provenientes de un ratn inmunizado con el antgeno
de inters. Los hbridos resultantes poseen dos propiedades: proliferan indefinidamente y
secretan anticuerpos especficos hacia el antgeno empleado en la inmunizacin (Fainboim, 2005).

El protocolo para la produccin de anticuerpos monoclonales est dividido en varias etapas las
cuales se describen a continuacin, el procedimiento est descrito utilizando un solo ratn de la
cepa BALB/c.

Inmunizacin.

En el da uno: tomar 100 g del antgeno, diluir en 300 L de PBS estril y mezclar con 300 L de
adyuvante de Freund. Inyectar no ms de 300 L del preparado anterior por va intraperitoneal.

Semana dos: repetir la inyeccin por va intraperitoneal.

Semana tres: inyectar por va intraperitoneal el antgeno diluido en PBS estril, pero ahora sin el
adyuvante.

Semana cuatro: recoger una muestra de sangre de la cola, centrifugar para obtener el suero, hacer
diluciones seriadas del suero resultante en PBS y realizar una prueba ELISA contra el antgeno, esto
para comprobar si el ratn ha reconocido el antgeno y desarrollado una respuesta inmune eficaz.

Dejar al menos tres semanas entre la tercera inyeccin y el refuerzo final de antgeno (100 g en
150 L de PBS estril), administrar por va intravenosa tres o cuatro das antes de la obtencin de
las clulas del bazo. Sacrificar el ratn tres das despus del impulso final, extraer el bazo
aspticamente y colocarlo en un recipiente estril que contiene 5 mL de medio C.

Produccin de hibridomas.

Crecimiento de las clulas de mieloma: Retirar el vial congelado de clulas de mieloma, colocar las
clulas en bao de agua a 37 C hasta que se descongelen, enseguida, llevar a la campana de
cultivo y limpiar el exterior del vial con un 70% de etanol y retirar la parte superior. Retirar
cuidadosamente la suspensin de clulas utilizando una pipeta Pasteur estril y transferir el
contenido a un tubo de centrfuga que contiene 10 mL de medio A, centrifugar durante 5 minutos
a 1,500 rpm. Eliminar el sobrenadante y resuspender las clulas en 10 mL de medio A fresco,
tomar 1 mL de la suspensin del matraz original y aadir a un segundo matraz con 9 mL de medio
A. Por ltimo, llevar a incubacin. Tres das antes de la fusin, se preparan las clulas de mieloma
haciendo una dilucin de 1:40 y otra a 1:60.

Fusin de las clulas de mieloma y clulas del bazo: Realizar todo el proceso en una campana de
flujo laminar. Transferir el bazo con pinzas para diseccin estriles a una placa Petri y lavarlo,
retirar cualquier adherencia y transferirlo a una segunda placa Petri.

Cortar el bazo en dos, suavemente retire las clulas hacia fuera de las cpsulas del bazo. Eliminar
los restos de las cpsulas del bazo y con una pipeta Pasteur estril, mezclar suavemente las
clulas. Transferir la suspensin celular a un tubo de 15 mL y utilizar 5 mL de medio C para lavar la
placa Petri y transferir la mayor cantidad de clulas esplnicas posibles al tubo.
Contar las clulas de mieloma y el bazo, es necesario tener una proporcin de una clula de
mieloma por cada 10 clulas de bazo. Aadir las clulas de mieloma a un tubo cnico de 50 mL y
centrifugar a 1,500 rpm durante 10 minutos, tanto las clulas del bazo contenidas en el tubo de 15
mL y las clulas de mieloma contenidas en el tubo de 50 mL.

Cuidadosamente verter el sobrenadante de ambos tubos y volver a suspender los sedimentos de

cada uno en 10 mL de medio B. Combinar las clulas del bazo resuspendidas y los sedimentos de
mieloma en un tubo para centrfuga de 50 mL y centrifugar durante 5 minutos a 1,500 rpm.

Deseche el sobrenadante (tanto como sea posible), colocar el tubo en bao de agua y aadir 1.2
mL de PEG gota a gota durante un minuto, agitando suavemente con cada gota, aadir 1 mL de
medio B, gota por gota durante un minuto, agitando suavemente, aadir 2 mL ms de medio B,
gota a gota durante dos minutos, agitando suavemente, aadir 4 mL ms de medio B, gota por
gota durante cuatro minutos, agitando suavemente, por ltimo, aadir 8 mL de medio C.
Centrifugar el tubo de las clulas durante 5 minutos a 1,500 rpm.

Cuidadosamente descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento celular durante 1 minuto

con 10 mL de medio A+. Verter los 10 mL de mezcla de fusin resuspendido en 190 mL de medio
A+ caliente. Colocar 1 mL de esta suspensin en cada pocillo de placas de 8x24 pocillos (192
pocillos en total). Dejar las placas en incubacin durante 24 horas aproximadamente.

Pasado el tiempo de incubacin aadir 8 mL de medio HAT en 200 mL de medio A+, colocar 1 mL
de este medio selectivo en cada pocillo de las 8 placas (este medio selectivo propicia a que solo las
clulas del hibridoma crezcan con xito, evitando el crecimiento de las clulas no fusionadas),
dejar las placas en la incubadora. Las colonias aparecern entre 7 a 10 das transcurridos. Aislar las
clulas hbridas individuales que producen el anticuerpo deseado.

Clonacin de las clulas del hibridoma.

El medio de clonacin se prepara de la siguiente manera:

Medio RPMI 1640 con L-glutamina.

o 10% de FBS (previamente inactivado por calor).
o Penicilina (100 U / ml) / estreptomicina (100 mg / l) (Gibco 15950-017)
o Ultroser G (1%).
o HAT (Hypoxathine, aminopterina y timidina) suplemento que suele ser 50X (diluir 10 ml en
500 ml de medio).
o 1% o 2% Condimed.

Mezclar bien las clulas en el frasco y realizar un recuento preciso del nmero de clulas. Colocar
10 L de las clulas en 10 mL de medio de clonacin en un tubo de centrfuga de 15 mL (esta es la
mezcla madre para diluir), agitar suavemente. Aadir 200 L a cada uno de los 80 pocillos en una
placa de microvaloracin de 96 pocillos, dejar incubar a 37 C durante 5 a 7 das. Observar los
clones utilizando un microscopio marcando los pocillos de clones individuales. Dejarlos crecer
aproximadamente 1/3 del tamao del pozo y probarlos de forma adecuada utilizando una prueba
ELISA o una tcnica de tincin inmunocitoqumica. Expandir los clones positivos movindolos
lentamente en pocillos de 2 ml utilizando el medio de clonacin.
Produccin en masa de anticuerpos monoclonales.

Para el crecimiento del clon seleccionado de clulas hbridas se utiliza la cavidad peritoneal de
ratones. Primero, se inyecta en la cavidad peritoneal un irritante orgnico, por ejemplo, pristano,
para producir una peritonitis qumica. Luego, se inyectan las clulas hbridas de la lnea
seleccionada dentro de la cavidad peritoneal, en el transcurso de los das se desarrolla un tumor
conocido como hibridoma, este tumor produce grandes cantidades de anticuerpos monoclonales
que pueden obtenerse por aspiracin del lquido asctico a partir de la cavidad peritoneal del
ratn. Un ratn que tiene el tumor puede sobrevivir entre 4 y 6 semanas, durante las cuales se
pueden recolectar grandes cantidades de anticuerpos.

Reactivos y medios utilizados.

Adyuvante de Freund

Es un aceite mineral que contiene una suspensin de micobacterias muertas por calor.
Emulsionado junto con una solucin del antgeno de inters para formar una emulsin de agua-en-
aceite, es eficaz en la potenciacin de las respuestas inmunitarias celulares y humorales contra el
antgeno inyectado. Su actividad adyuvante es un resultado de la liberacin sostenida de los
antgenos de la emulsin oleosa y la estimulacin de una respuesta inmune innata local de lo que
resulta en la inmunidad adaptativa mejorada. Un componente esencial de esta respuesta es una
reaccin inflamatoria intensa en el sitio de la deposicin de antgeno, que resulta de una afluencia
de leucocitos y su interaccin con los antgenos.

PEG (polientilenglicol)

Reduce la tensin superficial clula-clula, esto posibilita que las clulas se encuentren muy
prximas entre s y que sus membranas se fusionen entre s.

Medio de cultivo A:
RPMI 1640 con L-glutamina (bicarbonato tamponada).
o 10% de FBS.
o Penicilina (100 U/mL) / estreptomicina (100 mg/l).

Medio de Cultivo A +:
RPMI 1640 con L-glutamina (bicarbonato tamponada).
o 10% de FBS.
o Penicilina (100 U/mL) / estreptomicina (100 mg/l).
o Ultroser G (1%).

Medio de Cultivo B (sin FBS):

RPMI 1640 con L-glutamina.
o Penicilina (100 U/mL) / estreptomicina (100 mg/l).
Medio de cultivo C:
RPMI 1640 con L-glutamina.
o 10% de FBS.
o Penicilina (100 U/mL) / estreptomicina (100 mg/l).

Medio de Cultivo D:
RPMI 1640 con L-glutamina (bicarbonato tamponada).
o 10% de FBS.
o Penicilina (100 U/mL) / estreptomicina (100 mg/l).
o Ultroser G (1%).
o HAT (Hypoxathine, aminopterina, timidina) suplemento que es generalmente 50X (diluir
10 ml en 500 ml de medio).

Referencias.

Faiboin L, Satz L. Introduccin a la Inmunologa humana. 4a ed. Buenos Aires, 1999.

Lodish H, Baltimore D, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Darnell J. Molecular Cell Biology (3rd Ed),
Sci. Amer. Books, New York. 1995.

Sikora K, Smedley HM. Anticuerpos Monoclonales. Revert. 1ra ed. Barcelona. 1986.