Avances en Biologa Molecular

(PCR en tiempo Real)

MsC Pool Marcos Carbajal

Clnica Americana Juliaca
Universidad Peruana Unin / Universidad San Martin de Porres
poolmarcoscarbajal@gmail.com
23/11/2017
Reaccin de la polimerasa en cadena
 Taq Polimerasa Polimerasa termoestable aislada de
Thermus aquaticus
Temperatura ptima 75 C y puede
soportar mas de 95C.
Actividad DNA polimerasa en
direccin 5-3.
Actividad exonucleasa en DNA de
doble hebra 5-3.
Templado: ssDNA con primers unidos.
Produce un extremo protruyente en 5.
Requiere cationes divalentes (Mg2+).
pH ptimo 8.3 a T amb

Una subunidad de 65 kD
Primers Forward (sense) y Reverse (antisense)
5- GATTCAATAGGTTGTATGCATGGTT -3
12- GATTCAATAGGTTGTATGCATGGTTCATCCGAACCG

GATTTGAGAAACTGGAAATCGCCAACCCCCCAGTTC

ACTCAAGGAGCCCGGCCGGATGAACACCCATAAGCA

TGCCCGATTGACCTTCCTACGTCGACTCGAAATGGTC
3- GCGGGTAGTTCAAACACACGGACTT -5
CAGCAATTGATCGCCCATCAAGTTTGTGTGCCTGAA-192

5- GATTCAATAGGTTGTATGCATGGTT -3
5-TTCAGGCACACAAACTTGATGGGCG -3

Fragmento de la IS481 de Bordetella pertussis (GenBank n M22031)

 Eleccin de partidores
Interaccin entre partidores: dmeros de primers.
Loops o hairpins internos
Tms demasiado altas >70o demasiado bajas <50
Diferencia de Tms no mayor de 5C
Evitar repeticiones
No mas de 3 GC en el extremo 3-OH
Especificidad
Grado de pureza
 Efecto del Mg2+ en la PCR

PCR with a degenerate primer at different Mg and dNTP concentrations.

Each of the Mg concentrations ( 1.5, 2, 3, 4, 5 mM ) were combined
with each of the following dNTP concentrations (each): 200M, 400M,
600 M and 800 M. Results indicate that increasing dNTP
concentrations require increasing Mg concentrations for the PCR
reactions to work.
 Concentracin final de reactivos en una PCR
DNA templado <500ng/rx
Buffer 1x (10mM Tris-HCL ph 7.4-8,0; EDTA 0,5-1,0mM)

Mgcl2 0,5-6,0mM Algunas enzimas requieren MgS04

dNTPs 0,25mMc/u dATP+dCTP+dGTP+dTTP (dUTP*)

Primer Forw 0,5-2,0uM Purificado HPLC; Marcado 5; 15-30nt

Primer Rev 0,5-2,0uM Purificado HPLC; Marcado 5; 15-30nt

Sonda(s) 0,2 uM TaqMan, FRET, Quimioluminiscente; 15-30nt

Taq Polimerasa 1,0-5,0U Hot Start; Alta Fidelidad; RT y Taq

Uracil-N-glicosilasa* 2,0U Opcional, elimina contaminacin carry-over

Agua c.s.p 20ul Desionizada; bidestilada; DNAsa-RNAsa free.
Soluciones descontaminantes
 Deteccin PCR tradicional
Fases del
PCR
Area de [DNA]
deteccin por
tiempo real

Ciclos
Deteccin PCR tradicional

Area de
cuantificacin Log
por tiempo real [DNA]

Ciclos
Progreso PCR en Tiempo real
Deteccin fluorescencia en tiempo real

106
3x105

105

3x104
104
 Rn= Valor normalizado de fluorescencia
Fluorescencia relativa

Ciclos

Ct= Cycle threshold cross point

 Ct5=38,3 Lmite deteccin
Ct4=37,0
Ct3=33,6

Ct2=30,3
Ct1=27,2

del amplicn
N de copias

El Ct (Cp) es inversamente
proporcional a la cantidad
inicial de templado.

Ciclos
Curva de Melting
Termocicladores de tiempo real
Termociclador en tiempo real
Light Cycler de Roche
 Termociclador
LightCycler de Roche
Termociclador Rotor-Gene 6000
Sistema ptico termociclador Rotor-Gene 6000
Control de temperatura Rotor-Gene
Optimizacin parmetros PCR
en tiempo real
 Concentracin
de primers
Los valores de Ct (Cp) son
fuertemente afectados por la
concentracin de los primers
Hay una regin de plateau
donde los valores de Ct
no son afectados.

A medida que se reduce

la concentracin de los
primers se reducen los
valores de Rn
Titulacin de MgCl2
Reportadores para deteccin
fluorescente en tiempo real
SYBR Green
 Taq Tth Pol
Alta energa. 5
Baja energa. 3

Actividad 5
exonucleasa

Sonda TaqMan
Fluorescence resonance energy transfer (FRET)
 FRET

Fluorescena Red-640
Sonda Scorpion
Molecular Beacons
Fluorforos