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Info para discu

La enzima de restriccin EcoRI reconoce y se une a la secuencia palindromica GAATTC.Los

fragmentos de ADN producidos por este corte tienen colas protuberantes de cadena
sencilla(extremos cohesivos) que pueden formar puentes de hidrogeno con colas complementarias
de cadena sencilla de fragmentos de ADN que provengan de cualquier otra fuente. Si se mezclan en
las condiciones adecuadas, los fragmentos de ADN de dos fuentes diferentes forman molculas
recombinantes por la unin mediante puentes de hidrogeno de sus extremos cohesivos. La enzima
ADN ligasa puede unir covalentemente los fragmentos para formar una molcula de ADN
recombinante.KLUG

Se utiliz la enzima de restriccin EcoRI ya que adems de que corta en los extremos del gen de la
insulina,para insertar un fragmento de ADN, se corta el vector con una enzima de restriccin y se
mezcla con una coleccin de fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.KLUG

Los fragmentos de rstriccion de adn no pueden entrar directamente en las celulas husped para
ser copiados. Sin embargo, cuando se une el fragmento de restriccin a otra molecula de adn
denominada vector, puede entrar e una celula uesped, donde se puede replicar o clonar en mucas
copias.KLUG

Aunque generalmente en la celula bacteriana uesped solo entra un plasmido, una vez dentro
algunos plasmidos pueden incrementar el numero de copias de manera que haya diversos
centenares de ellos presentes en la celula.

EcoRI su lugar de reconocimiento es en GAATTC y su sitio de ruptura es entre G y A de ambas

cadenas, requiere Mg2o Mn2+ .MATEWS
es enndonucleasa, metilasa en una protena independiente, 1 subunidad,aunque actua como
homoimero, palindromica su sitio de reconocimiento,metila adenina o citosina muy especificas
dentro de la secuencia de reconocimiento en ambas hebras.INGENIERIA GENTICA

EL PRODUCTO DE LA REASOCIACION DE LOS DOS FRAGMENTOS EN NINGUNO DE LOS CASOS ES

IDENTICO AL DNA DE PARTIDA, PUES ESTA FORMADO POR DOS MOLECULAS.

Es conveniente que el vector posea el mayor numero posible de sitios de restriccin, para insertar
el fragmeto de adn que se quiere clonar, y que incluya al menos un gen marcador que permita
identificar y/o seleccionar las celulas que llevan el adn recombinante.

En la practica pueden ocurrir diversos tipos de asociacin entre fragmentos de restriccin con
extremos compatibles, todas ellas catalizadas por la ligasa. En primer lugar, siempre puede darse
la asociacin intramolecular, es decir, entre los dos extremos de una misma molecula(vector o
inserto); si se trata de un vector circular, da lugar a su recirculazacion. Esta interaccion esta
favorecida cuando la concentracin de adn es baja(pues la probabilidad de que dos molculas se
encuentren es menor). En segundo lugar, puede tener lugar una asociacin intermolecular, tanto
la que conduce al radn(vector+inserto) como otras que conducen a productos no deseados:
vector+vector,inserto+inserto,unin de mas de dos molculas,etc.;todas ellas pueden ser
circulares o lineales. Estas interacciones son mas robables para concentraciones elevadas de adn.

Para evitar la formacin de estos productos secundarios, que disminuye el rendimiento de la

clonacin, se acude a estrategias experimentales, previas a la mezcla de vector e isnerto, tales
como la escisin con dos enzimas de restriccin diferentes, que evita la recirculacin del vectoro ,
la desforsforilacion del vector con fosfatasa alcalina.

PAGINA 206 INGENIERIA GENETICA. DIVERSOS PRPDUCTOS