You are on page 1of 4

Los carotenoides microbianos son difciles de extraer debido a su inclusin en una matriz

compacta y su destacada sensibilidad a la degradacin. Especialmente para el anlisis de


carotenoides de bacterias y levaduras, falta informacin sobre la capacidad, precisin y
recuperacin del mtodo utilizado. Por consiguiente, nosotros investig la viabilidad, el
rendimiento y la validez de un nuevo mtodo a pequea escala utilizando Micrococcus
luteus y Rhodotorula glutinis con fines de prueba.
Para la desintegracin y extraccin, combinamos principalmente tcnicas suaves:
enzimticamente utilizamos combinaciones de lisozima y lipasa para bacterias as como
lyticase y lipase para levaduras. El tratamiento mecnico adicional incluy sonicacin y
ciclos de congelacin-descongelacin. Tratamiento qumico con el dimetilsulfxido se
aplic solo para levaduras. Para la extraccin utilizamos una mezcla de metanol y
cloroformo estabilizada de manera eficiente con hidroxitolueno butilado y alfa-tocoferol.
La separacin de los compuestos se logr con HPLC, aplicando un gradiente binario de
metanol / tert-butil metil ter en un polmero invertido fase C30. Las sustancias de inters
se detectaron e identificaron aplicando un conjunto de fotodiodos (PDA) y carotenoides
cuantificados como alltrans--caroteno equivalentes. Para la evaluacin de la
recuperacin y la reproducibilidad del mtodo de extraccin, utilizamos -8'-apo-
carotenal como patrn interno.
El mtodo proporciona una herramienta sensible para la determinacin de carotenoides
de bacterias y levaduras y tambin para pequeos cambios en carotenoides espectro de
una sola especie. Los grandes experimentos de coexistencia se ven facilitados por el alto
rendimiento del mtodo. 2007 Elsevier B.V. Todos los derechos reservados.

INTRODUCCION
Los carotenoides son los pigmentos amarillos, naranjas y rojos que se encuentran
naturalmente ms extendidos. La abundancia de carotenoides en la naturaleza
probablemente se deba a su ruta biosinttica relativamente simple, que se ha demostrado
en plantas superiores y algas, pero tambin en bacterias y levaduras (Fraser et al., 2000;
Goodwin, 1980; Weedon, 1971). Para los carotenoides microbianos hay al menos tres
razones importantes para analizar todo el espectro y la cantidad correcta: en primer lugar,
los microorganismos ofrecen una produccin biotecnolgica econmica de carotenoides y
proporcionan una alternativa a la sntesis qumica (Vandammen, 1992; Buzzini et al.,
2001; Buzzini y Martini, 1999; Vzquez y Martin, 1997; de Haan y otros, 1991; Frengova et
al., 2003).
Por consiguiente, existe un mercado mundial en crecimiento de carotenoides microbianos,
en particular para alimentar a la acuicultura para colorear carne de pescado y satisfacer
las demandas de los consumidores (Meyers, 1977; Ostrander et al., 1976).

En cuanto a los mtodos utilizados para la determinacin de microbios carotenoides hay


una falta de informacin sobre la analtica fiabilidad y rendimiento en particular. Por
consiguiente, nuestro objetivo fue desarrollar una tcnica que sea robusta, precisa y
sensible para la determinacin de una amplia gama de bacterias y carotenoides de
levadura El diseo de mtodos debe ser factible y de pequea escala para maximizar el
rendimiento.
tabla 1
Perfil de gradiente utilizado para la separacin y cuantificacin de compuestos (flujo:
1.3 ml / min; temperatura de la columna 10 C)

.2.1. Cultivo y cosecha de M. luteus y R. glutinis


M. luteus se cultiv en agar Luria Bertani (LB) que contena
37,0 g de Agar estndar No.1 (Merck, Alemania), 5,0 g de trptico
caldo de soja y 4,0 g de cloruro de sodio (Sigma, Suiza)
as como 2.0 g de extracto de levadura (Roth, Alemania) por litro.
M. luteus se cultiv aerbicamente durante 7 das a 37 C en el
oscuro. R. glutinis se cultiv aerbicamente en levadura-extracto-
agar glucosa-cloranfenicol (Merck, Alemania) durante 9 das
a 25 C bajo luz difusa.
Las clulas se cosecharon con agua destilada y la clula
la suspensin se transfiri a centrfuga de polipropileno de 14 ml
tubos (Greiner, Alemania) y se centrifug a 4500 g a 4 C para
30 minutos. La capa superior se descart y las clulas residuales se
congelado inmediatamente a -80 C. Las muestras congeladas fueron liofilizadas
durante 48 h a 0,1 mbar (Maxi lyo dry, Heto, Dinamarca). Muestras
se almacenaron a -80 C para anlisis adicionales.
2.2.2. Desintegracin de las clulas antes de la extraccin
Para la desintegracin celular, entre 10 mg y 50 mg de liofilizado las clulas se pesaron
exactamente en tubos de reaccin de 2 ml Eppendorf, Alemania) y se aadieron 1200 l de
PBS. Adems, 200 l de solucin de lisozima para bacterias y 200 l de lyticase solucin
para levaduras respectivamente, as como 200 l de lipasa solucin para ambos se
aadieron (Fig. 1). Las soluciones enzimticas fueron preparado todos los das en PBS (pH
7.4, Biochrom AG) con lisozima (400 KU / 200 l), liticasa (400 U / 200 l) y lipasa
(2 U / 200 l). Los tubos se agitaron vorticialmente durante 30 sy la suspensin incubados
durante 10 ha 37 C, 250 U / min horizontalmente (Unimax 1010, Heidolph, Alemania).
Otros tratamientos fueron tres freezethawing ciclos con nitrgeno lquido y sonicacin
(UW 2070, Bandelin, Alemania) durante 3 30 s a 7 Woutput. Despus de eso, 400 l de
se aadi una solucin fra de acetato de zinc saturada para precipitar

protenas de xantofila o glicsidos de xantofila quedan en solucin.


Despus de la centrifugacin (10 min, 19,000 g, 4 C), la parte superior
la capa fue descartada y 25 l (1 mg) del estndar interno -8'-
apocaroteno (apo-CAR) que contiene 1% de alfa tocoferol
(TOC) se agreg cuando se requiri. Adems, las levaduras eran
incubados durante 5 minutos en 600 l de DMSO antes de la extraccin (Fig. 1).
Las pruebas preliminares de disrupcin celular se llevaron a cabo con un
Prensa francesa (Instrumentos SLM, celda de presin de 40 ml) a 900 PSI
en agua destilada tratando cada uno de M. luteus y R. glutinis tres
tiempos consecutivos

Extraccin de clulas desintegradas


Se extrajo material celular residual (en DMSO para levaduras)
con 800 l de MeOH / CHCl3 (7: 3, v / v) que contiene 0,05% de BHT
(m / v) mediante agitacin vigorosa. La suspensin se centrifug (3 min,
19,000 g, 4 C) y extraccin repetida hasta el sobrenadante y
el sedimento celular residual era incoloro. Los extractos agrupados se transfirieron
en un tubo de centrfuga de vidrio (100 16, Wheaton, EE. UU.).
Un volumen de 8 ml de cloruro de sodio fro al 10% (m / v) (Sigma,
Alemania) se agreg una solucin. Para separar los tubos de fases
se cerraron, se agitaron vorticialmente durante 10 segundos y se centrifugaron a 4 C,
4500 g por 10 min. La fase orgnica inferior de color claro era
eliminado con una jeringa de vidrio (Hamilton, Suiza) y
Se aadieron 500 l de CHCl3 que contena 0,05% de BHT. los
la mezcla se agit en vrtice, se centrifug y se elimin nuevamente CHCl3.
El procedimiento se repiti, hasta que la fase inferior fue incolora.
Las fases orgnicas se transfirieron a un vial mbar de HPLC
(YMC, EE. UU.) Y se evapor con una corriente de nitrgeno seco
(Linde, Alemania).

2.5. Rendimiento del mtodo de extraccin


Para determinar el rendimiento del mtodo de extraccin,
aplicacin de apo-CAR como estndar interno (Inbaraj et al., 2005; Kelm
et al., 2001). Para garantizar la separacin del estndar interno de
carotenoides de microorganismos, hemos cromatografiado muestras
con y sin apo-CAR, as como el estndar interno puro.
Las evaluaciones de linealidad, precisin y recuperacin se combinaron
en un solo conjunto de experimentos. Por lo tanto, aumentando las masas de
muestras liofilizadas de M. luteus y R. glutinis se enriquecieron con
25 l de apo-CAR antes de la extraccin y procesado. El procedimiento
se repiti cinco veces con la inyeccin de la pura interna
estndar y las reas de los picos resultantes se probaron para la normalidad
distribucin (Kolmogorov-Smirnov). La media de todas las reas de los picos
se estableci en 100% de recuperacin. La linealidad fue investigada grficamente,
trazado de CAR-EQ calculado de picos detectados sobre liofilizado
masa celular Para la evaluacin de precisin, el coeficiente de
variacin (R.S.D.) se calcul para los datos dentro del lineal
distancia.
LOD y LOQ se calcularon a partir de la desviacin estndar residual
(SDR) de la lnea de regresin, utilizando los cinco valores ms bajos y
su (s) pendiente (s) de la siguiente manera: LOD = 3,3 SDR / sy LOQ = 10 SDR / s
(DIN 32645).

You might also like