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PROYECTO FIN DE CARRERA
Ttulo
Microbiologa residual en vinos tintos
Autor/es
Beatriz Garcia Azofra
Director/es
Marta Mara Ins Dizy Soto

Facultad
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informtica

Titulacin
Proyecto Fin de Carrera
Departamento
Agricultura y Alimentacin
Curso Acadmico
2013-2014
Microbiologa residual en vinos tintos, proyecto fin de carrera
de Beatriz Garcia Azofra, dirigido por Marta Mara Ins Dizy Soto (publicado por la
Universidad de La Rioja), se difunde bajo una Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
Permisos que vayan ms all de lo cubierto por esta licencia pueden solicitarse a los
titulares del copyright.
El autor
Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
publicaciones.unirioja.es
E-mail: publicaciones@unirioja.es

AGRADECIMIENTOS

En primer lugar quisiera dar las gracias a todo el personal docente que me ha ayudado
a realizar este proyecto, en especial a Marta Dizy por su implicacin, por su paciencia
y por los conocimientos que gracias a ella he adquirido. A Leticia Miranda Fernandes,
a Joao Verdial y a todo el personal del laboratorio del Instituto Politcnico de
Bragana (IPB) por acogerme all y hacerme sentir como en casa.
A mi familia, en especial a mis padres y abuelos por tener una paciencia infinita y
comprender los buenos y los malos das. Os quiero.
A Seila y a Fernando, cada uno a su forma me han apoyado de forma incondicional, de

ellos he aprendido muchas cosas, me han aportado tranquilidad y nimo en los
momentos ms difciles, siempre me hacis sonrer.
A mis amigos, Raquel, Mnica, Ovidiu, Alberto, Juan y otros muchos que han estado
a diario a mi lado, apoyndome en los mejores y peores momentos.
A mis compaeros de la Oficina del Estudiante de la Universidad de La Rioja que da
tras da se han preocupado por m y por el trabajo que estaba realizando. Feli, gracias
por tu comprensin y preocupacin.
Por ltimo, quisiera agradecer de forma muy especial a todas aquellas personas que de
una forma u otra han hecho posible este trabajo.
Gracias a todos

ii
A mi familia y amigos.
Este trabajo es de todos vosotros
iii

NDICE
iv
NDICE
1. INTRODUCCINYOBJETIVOS ............................................................................................... 4
1.1. Introduccin ...................................................................................................................... 4
1.1.1. Elvinoysusorgenes ............................................................................................ 4
1.1.2. Produccinmundialdevino.................................................................................. 5
1.1.3. Laelaboracindelvinoylamicrobiologaenolgica............................................ 5
1.1.4. Microorganismosresiduales ................................................................................. 9
1.1.5. Factoresqueinfluyeneneldesarrollodelosmicroorganismos......................... 12
1.1.6. Mediosdecultivo ................................................................................................ 13
1.1.7. Estabilidaddelosvinos:defectosyenfermedades ............................................ 14
1.1.8. RegindeTrsosMonteseAltoDouroysusvinos........................................... 16
1.1.9. Planteamientodelainvestigacin ...................................................................... 17
1.2.Objetivos ........................................................................................................................ 17
2. MATERIALESYMTODOS.................................................................................................... 19
2.1. Equipodelaboratorioempleado ................................................................................ 19
2.2. Materiales ................................................................................................................... 19
2.3. Reactivos ..................................................................................................................... 19
2.4. Muestrasdevino......................................................................................................... 19
2.5. Mtodos ...................................................................................................................... 20
2.5.1. Preparacindelasmuestras ............................................................................... 20
2.5.2. Preparacindelosmediosdecultivo ................................................................. 20
2.5.3. Siembra,recuentoyaislamientodecolonias. .................................................... 22
2.5.4. Siembrademicroorganismosenlosmediosdecultivo...................................... 22
2.5.5. Procedimiento para la determinacin de presencia de microorganismos y
produccindeacidez .......................................................................................................... 23
2.5.6. Recuentodemicroorganismosyestimacindepoblacin ................................ 23
2.5.7. Aislamientodemicroorganismos........................................................................ 24
2.5.8. Tcnicasparalaidentificacindemicroorganismos .......................................... 24
2.6. Mediosdecultivo ........................................................................................................ 26
3. RESULTADOS ....................................................................................................................... 28

_Toc391298751
3.1. DeterminacinAusencia/Presenciademicroorganismos .......................................... 28
3.1.1. Levaduras............................................................................................................. 28
3.1.2. Bacterias .............................................................................................................. 29
3.2. Recuentodemicroorganismosyestimacindepoblacin ........................................ 30
3.2.1. Levaduras ............................................................................................................ 30
3.2.2. Bacterias .............................................................................................................. 31
3.3. Identificacindemicroorganismos ............................................................................. 32
3.3.1. Identificacinfisiolgicadelevaduras ................................................................ 32
3.3.2. Especiesdelevadurasypoblacintotalparalasmuestrasdevinoterminado. 35
3.3.3. Especies de levaduras y poblacin total para las muestras de vino
alosdosmeses(t=40). ...................................................................................................... 39
3.3.4. Identificacinfisiolgicadebacteriaslcticas .................................................... 42
3.3.5. Especies de bacterias lcticas y poblacin total para las muestras de vino
terminado............................................................................................................................ 45
3.3.3.Especiesdebacteriaslcticasypoblacintotalparalasmuestrasdevinoalos
dosmeses(t=40). .............................................................................................................. 49
4. DISCUSIN Y CONCLUSIONES .......................................................................................... 55
4.1. Discusin ..................................................................................................................... 55
4.2. Conclusiones................................................................................................................ 57
5. BIBLIOGRAFA ...................................................................................................................... 60
vi
RESUMEN

1
RESUMEN

Enestetrabajosepretenderealizarelrecuento,laestimacindepoblacinylaidentificacin
de los microorganismos residuales presentes en los vinos tintos de D.O.C. Douro (Portugal).
Paraello,distintasbodegasdelazonahanproporcionadomuestrasdevinotintoterminadasy
embotelladaspreparadasparasucomercializacin,todoselloshansidocriadosenbarrica.Se
tratadebodegasfamiliaresopequeascooperativasdelospueblosdealrededorinteresadas
enconocerlaestabilidaddesusvinos.Lasmuestrasanalizadasprocedendelosalrededores
deBragana,regindeTrsosMontes,alnortedePortugal.
Para analizar la estabilidad de los vinos, se han llevado a cabo ensayos de bacterias lcticas,
bacteriasacticasylevadurasprestandoespecialatencinalgneroDekkera/Brettanomyces,
ya que en esa zona la contaminacin por este tipo de levadura es muy problemtica. Este
gneroproducearomasdesagradables:cuero,establo,sudordecaballo.
Se utilizaron distintos medios de cultivo sintticos especficos y diferenciales tanto en placa
comoentubosdeensayocondiferentesconcentraciones.Losmicroorganismosseaislarony
se llev a cabo la observacin macro y microscpica de las colonias y posteriormente, se
utilizaron test comerciales de asimilacin de carbohidratos/polialcoholes para realizar un
diagnstico de las especies. Todo el trabajo de laboratorio se ha llevado a cabo en el
LaboratoriodeMicrobiologadeIPB(InstitutoPolitcnicodeBragana).
Lapoblacinresidualdelevadurassesituentre104y105cls/mlenlosvinosterminadosy
aumenthasta105cls/mlentodaslasmuestrasalosdosmesesdeaperturadelasbotellas.
Los gneros identificados fueron: Saccharomyces, Candida, Brettanomyces/Dekkeras y
Rhodotorula.Lapoblacinresidualdebacteriaslcticassemantuvoprcticamenteconstante
a lo largo del tiempo, habiendo un pequeo aumento de poblacin a los dos meses de
aperturadelasbotellas,nosuperando102cls/mlenningncaso.Seidentificaronlosgneros
Oenococcus y Lactobacillus. En ninguna de las muestras se produjo crecimiento de bacterias
acticas.

INTRODUCCIN
Y
OBJETIVOS

3

1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
1.1. Introduccin
1.1.1. El vino y sus orgenes
Laformamssencilladedefinirelvinoes,bebidaalcohlicaproducidaporlafermentacindel
jugodelauva.Otradefinicinmscompletaeslaestablecidaenlaley24/2003,de10dejulio,
delaViayelVinoennuestroPas."Elvinoeselalimentonaturalobtenidoexclusivamente
porfermentacinalcohlica,totaloparcial,deuvafresca,estrujadaono,odemostodeuva".
La graduacin alcohlica adquirida no puede ser inferior a 8,5 % aunque dependiendo de la
legislacinvigenteencadaregin,elgradoalcohlicopuededescendera7%.
La fermentacin se produce por la accin metablica de las levaduras, que transforman los
azcaresdelfrutoenalcoholydixidodecarbono.Loscidosyazcarespresentesenlauva
suelensersuficientesparaqueselleveacabolafermentacin.
Losorgenesdelvinoseremontanalaantigedad,entornoalosaos6.0005000a.C.Existen
indiciosdelcultivodelaespeciesalvajeVitisviniferasylvestrisydelaobtencindebebidasa
partir de uva de esa poca. El verdadero nacimiento del vino se puede situar en la Edad de
Broncealrededordel3.000a.C.ElorigendelasprimerascosechasdeuvasefijaenSmer,en
la antigua Mesopotamia, en las tierras frtiles del Prximo Oriente. Se extendi a Egipto,
donderivalizconlacervezaqueallseelaboraba.LasorillasfrtilesdelNiloseconvirtieron
entierrasdecultivodelavidysedesarrollaronactividadeslaboraleseindustrialesentornoa
estecultivo.Elmostosefermentabaengrandesvasijasdebarroyseproducavinotintoque
erautilizadoenritosreligiososyllegoaconvertirseensmbolodeestatussocial.
LaadaptabilidaddelaespecieVitisvinferafavorecisuexpansinporlaEuropaOccidentala
travsdelasrutascomerciales,llegandohastaChina.Haciael700a.C.elvinollegalaGrecia
clsica.LosgriegostomabanelvinoaguadoycomoenEgipto,seutilizabaenritosreligiosos,
ritosfunerariosyfiestas,seasignporprimeravezunadivinidadalvino,Dionisio.
Romaextendielcultivodelavidportodosuimperioyasigntambinunadivinidadalvino,
Baco.Elvinofuecobrandocadavezmsimportancia.
EnlaEdadMedia,lasrdenesreligiosasseencargabandeelaborarvinoenlasabadasparasu
usoenlosritualesreligiosos,seleccionandolasvariedadesmsresistentesyadaptadas.
Laconquistadelosdistintoscontinentesporlosgrandesimperiosfueexpandiendoelcultivoy
laculturadelavidaprcticamentetodoelmundo.
1.1.2. Produccin mundial de vino
Lauvaesunadelasfrutasmsrecolectadasenelmundo.El60%delasuperficiedeviedos
mundialseencuentrarepartidaentrelosdiferentesestadosdelaUninEuropea,elterritorio
americano(norteysur)poseatansloun12%delasuperficie.
Del total de la recoleccin de la uva la mayora se dedica a produccin vincola

(aproximadamente un 66%). El porcentaje vara de pas en pas debido a su situacin
geopoltica y a sus creencias religiosas. El pas que ms dedica la uva al consumo en forma
fruta es China. La vid supone tan slo un 0.5% del total de la superficie dedicada
mundialmentealaagricultura.
Los tres pases con gran tradicin vitivincola son los mayores productores y exportadores, y
son Francia, Italia y Espaa. En Amrica del Norte el mayor productor es EE.UU. y en
SudamricaesArgentinaseguidodeChile.Casiun70%delaproduccinmundialytambinla
exportacin se encuentra en la Unin Europea. Desde los aos 70 la produccin mundial ha
estadoentornoalos250hastalos330millonesdehectolitros.Espaaeselpasqueposee
mayorsuperficiedeviedosdelmundo,seguidodeFrancia,perotienetendenciaadecrecer.
PasescomoPortugalyChiletienenunaltogradodeexportacindesusvinospudiendollegar
adecirqueexportancasiun80%desuproduccin.
SegnlaestimacindelaOrganizacinInternacionaldelaViayelVino(OIV),laproduccin
mundialdevinode2013,sesituen252millonesdehectolitros,15millonesmenosqueenel
aoanterior.ElprimerpasproductordevinofueFrancia,con41,4millonesdehl,seguidopor
Italia, con 40,1 millones de hl, y Espaa, con 30,4 millones de hl. Con menor volumen, la
produccincrecienPortugal,GreciaydisminuyenAlemania.
1.1.3. La elaboracin del vino y la microbiologa enolgica
Lavendimiaocosechaesunaoperacindegrantrascendenciaparalacalidaddelfuturovino.
Ha de determinarse el momento ptimo para vendimiar, el grado de madurez de la uva, su
estado sanitario y la forma en que se realice la recoleccin, tiene importancia decisiva en el
mantenimientodelacalidaddelproductofinal.
Seguidamente se realiza el transporte de la uva a bodega, este debe reunir los siguientes
requisitos, debe realizarse en condiciones tales que la uva llegue los ms entera posible a la
bodega,yeneltiempolomsbreveposible.
Unavezquelapartidadeuvasehadadodepaso,trashabersesometidoalainspeccinvisual
ytomademuestra,seprocedealadescargadesta.Actoseguidoseprocedealdespalilladoy
alestrujado,eldespalilladoconsisteensepararelraspndelgranodeuvayelestrujadoenel
queseprovocalaroturadeloshollejosyeldesprendimientodelapulpa,parafacilitarlasalida
delzumo,sinllegararomperlaspartesslidas.
El estrujado va tener dos funciones fundamentales en el proceso de vinificacin: propicia el

desarrollo de levaduras en masa, como consecuencia de la dispersin del zumo y de la
aireacinyfacilitalamaceracin,porqueaumentalasuperficiedecontactozumohollejo.
Despussellevaracaboelsulfitadoqueconsisteenlaadicindeanhdridosulfurosoenel
procesadodelauva.Elsulfitadoseempleadesdelaantigedadenlaelaboracindelvino,se
puede aadir a la uva, al mosto y al vino. Actualmente casi todos los vinos de mesa reciben
mayoromenorcantidaddeanhdridosulfuroso,enlavinificacinydurantesuconservacin.
Lasprincipalespropiedadesquellevanaemplearelsulfurososon:efectoantioxidante,porsu
avidezporeloxgeno,efectoantioxidsico,porsucapacidaddeinhibirlaspolifenoloxidasasy
efectoantisptico,principalmentefrenteabacterias.
Una vez ha sido despalillada y estrujada la vendimia debe llevarse hasta los depsitos para
encubareiniciarlamaceracin.Eltransportedelamasaserealizamediantebombasdepastas
ytuberas.Lasbombasdepasta,debentratarsuavementelamasayevitaraireaciones,perola
verdadesqueestetransportenoesbuenoparalacalidaddelproductofinal,hayqueprocurar
acortarloyrealizarloenlasmejorescondicionesposibles.Despusladescargaeneldepsito
tambindebesercuidadosaprocurandonoaplastarygolpeardemasiadolamasa.
La maceracin es el proceso ms decisivo de la vinificacin en tinto. Deben conocerse muy
bienlosprincipiosquelarigenyquefactoresintervienen.
Durante esta etapa no slo se obtiene el color, sino todos los componentes que nos van a
determinar las caractersticas organolpticas finales del vino. Entre esos componentes estn
lospolifenolesytaninos,loscompuestosresponsablesdeextracto,lassustanciasaromticas,
que pueden considerarse positivas. Pero tambin se extraen sustancias responsables de
saboresyoloresvegetales,engeneralnodeseables.
Una vez encubado el mosto, se deja en reposo para que tenga lugar la fermentacin, que
permitirlaverdaderatransformacindelmostoenvino.
Lafermentacineselfenmenoclavedelprocesodevinificacin.Sinlnotendramosvinoy
si no se cuida que tenga lugar en las mejores condiciones posibles, no llegaremos a obtener
vinodecalidad.
La fermentacin dura aproximadamente 1015 das, durante los 810 primeros das tiene
lugarlafermentacintumultuosa,enlaquelaactividaddelaslevadurasesmxima.Coincide
conelmomentodedescensomsbruscodeladensidadyconelmximodesprendimientode
carbnico e incremento de la temperatura. Despus el nivel de nutrientes del mosto
desciende, apenas queda azcar por consumir y el alcohol empieza a ser txico para las
levaduras. La actividad fermentativa se ralentiza y el descenso de densidad es muy lento, se
desprendecarbnicoreducidoylatemperaturasemantiene.
La fermentacin es un proceso exotrmico que libera energa al medio en forma de calor.
Temperaturas elevadas durante la fermentacin no son adecuadas, y en casos extremos
pueden llegar a ser peligrosas, ya que se pueden producir paradas en la fermentacin,

aumentodelasprdidasdealcoholporevaporacin,prdidadearomasvarietales...
La temperatura de la fermentacin suele oscilar entre 2026 C. Los aumentos bruscos de
temperaturadurantelafermentacindebensercontrolados.
Losremontadossonoperacionesrealizadasduranteelencubadodelostintosparafavorecerla
extraccindelassustanciasdelhollejo,perosobretodoparapropiciarsudifusinportodala
masadelquido.Elremontadoconsisteenextraerellquidoporlaparteinferiordeldepsitoy
aadirloporlapartesuperiorconsiguiendoairearlamasaypropiciandoundesarrollomayor
delaslevadurasyunamayoractividadfermentativa.
El descube constituye el final de la maceracin. Consiste en sangrar el depsito por la parte
inferior extrayendo el lquido (vino yema) para llevarlo a otro depsito donde concluir la
fermentacin,siannolohahecho.Losorujosseextraenenestemomentoysellevanala
prensa, para poder extraer el resto de vino que les queda. Se trata de un punto muy
importanteparalacalidaddelproductofinal.
Elvinopasaraotrodepsitodondeserealizarlafermentacinmalolctica.
Setratadeunprocesocontroladollevadoacaboporbacteriaslcticas,presentesenlauva.
Durantelafermentacinmalolcticatienelugarlatransformacindelcidomlico,queforma
partedelacomposicindelvino,encidolctico.
Paraelvinotintoseconsideraladescomposicinbacterianadelaacidezunfactordecalidad:
sindescomposicindelaacideznoseproduceelverdaderovinotinto.Porunladodebidoal
aumentodelpHcomoconsecuenciadelaformacindecidolcticoydeladescomposicin
delcidomlico,yporotro,debidoalosproductosmetablicos,quetieneninfluenciasobreel
sabordelvino,hacindolomsredondo,suave...
LasbacteriaslcticasquellevanacaboestaoperacinsonsensiblesalSO2.NosloalSO2libre,
sinoaunos50mgdecidosulfurosofijado.Conestascantidadespodemosinhibirsuactividad
yretrasarlaactividadyladescomposicindelaacidez.Sedebetenermuchocuidadoporlo
tantoalahoradedosificarelsulfuroso,yaqueunadosisexcesivapuedeimpedirquesellevea
cabolafermentacinmalolctica.
Latemperaturaptimaparaeldesarrollodelafermentacinmalolcticasesitaporencima
de los 20C. A estas temperaturas la actividad de las bacterias lcticas se incrementa.
Temperaturas inferiores provocan la inhibicin de la actividad de este tipo de bacterias,
retrasando la transformacin del cido lctico en cido mlico. La fermentacin malolctica
tienelugardurantelosmesesdeinvierno,cuandolastemperaturasambientalessonbajas.
Esnormalquelosvinosdespusdelafermentacinaparezcanturbios.Coneltiempoyconlos
trasiegos se produce una sedimentacin natural. Por una parte las partculas en suspensin
van sedimentando por gravedad. Por otro lado los coloides de vino: taninos, protenas y
pectinas,puedenperderlaestabilidadpordiferentesmotivos(fenmenosdepolimerizaciny
coagulacin, accin de enzimas) formando flculos y sedimentando. Es decir, el vino
permaneceduranteuntiempoeneldepsitoparaterminarconunaspectolimpio.
Unavezterminadatambinestafermentacin,seprocederadescubarnuevamente.
Enocasiones,elprocesodesedimentacindelaspartculasesmuylentoporloquehayque
forzar y acelerar el proceso mediante una clarificacin. Los vinos jvenes deben salir al
mercadoprontoynohaytiemposuficienteparaqueseclarifiquenespontneamente,adems,
siempre quedan en el vino sustancias de naturaleza coloidal que podran desestabilizarse y
enturbiarelvinodespusenelprocesodecomercializacin.
Una vez finalizada la clarificacin se procede a la aplicacin de fro al vino para precipitar
aquellas sustancias contenidas en el vino que son lbiles a bajas temperaturas (protenas,
cristales,tartratos...).Elprocesoduraunassemanasyesnecesarioparaevitarelprecipitado
detartratosyotroscristales,siunavezembotelladossonsometidosabajastemperaturas.
A continuacin, y transcurrido el perodo de estabilizacin por fro, se proceder al filtrado,
con la finalidad de eliminar los tartratos y cristales. Como filtro suele utilizarse tierras de
diatomeas,querecibeestenombreporqueellechofiltranteestconstituidoporunacapao
tortadetierrasfiltrantesenestecasodediatomeas.
Una vez finalizado el proceso de estabilizacin del vino, ste es introducido en barricas de
robleamericanoyfrancsparainiciarunlargoperododecrianza,cuyaduracindepender
deltipodevinoquesepretendaelaborar.
Unfactormuyimportanteatenerencuentaduranteelperododecrianzasonlasmermasque
se producen en barricas llenas hasta el tapn. Se trata de cantidades de vino que, como
consecuenciadelaevaporacin,deloscambiosdetemperatura,delaprdidadeCO2ydela
absorcindevinoporpartedelamaderadelabarricaentreotros.Yaqueenlasuperficiedel
vino se desarrollan microorganismos perjudiciales. Para evitar oxidaciones nocivas y el
desarrollodeorganismosaerobiosperjudiciales,sedebeprocederaunrellenadoperidicode
labarricayauncontinuocontroldelaoperacindecrianza.
Trasestosprocesosseprocedealembotelladoconsisteenllenarlasbotellashastaunvolumen
precisodevino,dejandoelespaciovaconecesarioparalapuestadeltapnmsunacmara
deairequepermitaciertadilatacin.
Durantelas24hquesiguenalembotellado,labotelladebeconservarsedepieparapermitirla
perfecta adaptacin del tapn al vidrio del cuello, sin dar lugar a prdidas de lquido y al
desarrollodeloshongosparsitosdelcorcho.
Elenvejecimientoenbotellaslovaaserpracticadaenvinosconlasdenominacionesreserva
ygranreserva.Elperododeenvejecimientoenbotellavariarenfuncindelodispuestoenel
ReglamentodelConsejoRegulador.
Una vez finalizado el embotellado y el perodo de envejecimiento en botella se procede al
capsulado,etiquetadoyempaquetadodelasbotellas.
LamicrobiologaenolgicatienesuorigenenelS.XVIIcuandoAntonVonLeeuwenhoeckllev
a cabo estudios sobre el mundo microbiano. Casi dos siglos despus, Desmazires confirm
estosestudiosgraciasalamejoradelastcnicasmicroscpicas.
En 1858 Louis Pasteur demostr que las levaduras eran las responsables de la fermentacin
alcohlicadelmosto,yqueciertasespeciesde bacteriaseranlascausantesdeldeterioro de
losvinos.Obtuvotambinlosprimeroscultivosdelevaduras.
Guilliermond fue conocido como el iniciador de la citologa de organismos unicelulares y

describi la estructura interna de las levaduras. El dans Winge destac en el campo de la
genticadelevaduras.
Todos estos autores observaron clulas apiculadas al principio de la fermentacin, otras
clulasglobosasyalargadascuandoelprocesoavanzabayuntercertipo,deformaelpticaque
sedepositabanenelfondoalfinaldelafermentacin.
La microbiologa moderna tiene su origen en los trabajos de Gino de Rossi y Castelli que
establecierondirectricesytcnicasparalatomademuestras,aislamientodemicroorganismos
y criterios taxonmicos de clasificacin. Se puso en evidencia que la fermentacin tiene dos
etapas biolgicas diferenciadas, la fermentativa en la que participan distintas especies de
microorganismos de forma sucesiva y la aerbica en la que aparecen velos sobre el vino
terminado.
Desde entonces, la microbiologa de la vinificacin ha sido extensamente estudiada y, en
consecuencia,sehareveladolagrancomplejidaddelaecologadelasfermentaciones.
Se deben considerar como principales grupos microbianos los mohos, las levaduras y las
bacterias. Las levaduras, principalmente pertenecientes al gnero Saccharomyces, son las
encargadas de realizar la fermentacin alcohlica, las bacterias lcticas llevan a cabo la
fermentacin malolctica, las bacterias acticas junto con algunas bacterias lcticas son
causantesdelasalteracionesdelvino.Losmohospuedendesarrollarsesobrelauvaoenlas
vides,disminuyendolacalidaddelosvinos.
1.1.4. Microorganismos residuales
Losmicroorganismosresidualessonaquellaspoblacionesmicrobianasquetraslaelaboracin
delvino,estabilizacin,clarificacin,sulfitadosoncapacesdedesarrollarseyformarcolonias,
provocandoenfermedadeseinestabilidadenlosvinosyaterminados.
Levaduras
Las levaduras son hongos microscpicos unicelulares, con organizacin eucariotas. Su

morfologacelularesvariada:esfrica,ovalada,alargada,apiculadaLareproduccinasexual
vegetativa se produce generalmente por gemacin, aunque algunas especies lo hacen por
biparticin.Lareproduccinsexualseproduceporformacindeesporas.Sonlasresponsables
de la fermentacin alcohlica. Las principales especies de levaduras vnicas son:
Saccharomyces cerevisiae, Kloeckera apiculata, Hanseniaspora guillermondii, Metschnikowia
pulcherrima y Schizosaccharomyces pombe. Otras levaduras presentes tambin en los vinos
corresponden a los gneros: Brettanomyces/Dekkeras, Torulaspora, Cryptococcus,
Debaryomyces,Kluyveromyces,Rhodotorula,Candida,Pichia,HansnulayZygosaccharomyces.
Lapresenciadelasdistintasespeciesalolargodelafermentacinalcohlicavara.Enlafase
inicialsepuedenencontrarlevadurasconbajaproduccindealcoholaunquealtaproduccin
de cidos voltiles como Rhodotorula, Candida, etc. En la fase tumultuosa el gnero
Saccharomyces invade el medio ya que su tolerancia al etanol es ms alta, predominando
hastaelfinaldelafermentacin,duranteestafase,laproduccindecompuestossecundarios
sermenorylasespeciesinicialesprcticamentedesaparecen.
Los principales requerimientos nutricionales de las levaduras son azcares, una fuente de
nitrgeno, minerales y vitaminas. Requieren tambin la presencia de oxgeno, ya que
intervieneenlasntesisdeesteroles,constituyentesdelamembranacelular.
Estosmicroorganismostienensuorigenenlapropiauva,enlasuperficiedelamaquinariade
labodegayenlainoculacin.
Bacteriaslcticas
Las bacterias lcticas son bacterias Grampositivas, catalasanegativas, no esporuladas e

inmviles.Setratademicroorganismosanaerobiosfacultativosyfermentadoresdeazcares.
Su morfologa celular es de coco bacilo y su reproduccin se produce por divisin celular
(biparticin). Los principales gneros implicados en la vinificacin son: Lactobacillus,
Pediococcus,OenococcusyLeuconostoc.Sonlasresponsablesdelafermentacinmaloltica.
Laspodemosdistinguirenhomofermentativas,quemetabolizanlaglucosaencidolcticoy
heterofermentativas, que la metabolizan en cido lctico pero tambin en cido actico,
etanol,diacetloyotroscompuestos.
La presencia a lo largo de la vinificacin comienza con distintas especies, casi todas ellas
homofermentativas y concentraciones de 103104 ufc/ml. Cuando se produce el inicio de la
fermentacinalcohlica,lapoblacindisminuyehastaconcentracionesde102ufc/mlyaquela
concentracin de etanol y otros compuestos txicos para las bacterias, aumentan. Tras la
fermentacinalcohlicapredominaelgneroOenococcus,puestoquetienemayorresistencia
al etanol y resiste pHs bajos. Permanecen en fase de latencia durante unos das y
posteriormente se multiplican gracias a los nutrientes aportados por la autolisis de las
levaduras hasta alcanzar concentraciones de 106 ufc/ml, se desarrollar as la fermentacin
malolctica. Tras la fermentacin, el gnero Oenococcus disminuye su poblacin,
mantenindoselosgnerosLactobacillusyPediococcus.
El origen de estas bacterias est tambin en las uvas, en la maquinaria de bodega y en los
inculosquesepuedanrealizar.
Bacteriasacticas
Se trata de bacterias Gramnegativas, catalasas positivas y oxidasa negativa, no esporuladas,

de morfologa variable: elpticas o con forma de bastn. Son mviles por la presencia de
flagelos polares o pericntricos. Son aerobias estrictas, siendo necesaria la presencia de
oxgeno molecular para su desarrollo, en casos muy extremos pueden utilizar otro aceptor
terminaldeelectrones.Tienenaltatoleranciaalaacidezyaletanolysoncapacesdeoxidarel
alcoholacidoactico.Losprincipalesgnerosson:GluconobacteryAcetobacter.
Durantelafermentacinalcohlicaeldesarrollodelaslevadurasylaadiccindesulfurosono
afectanaestasbacterias.Alolargodelafermentacinmalolctica,lapoblacinsemantieney
es durante la conservacin del vino donde se pueden producir el desarrollo de estas
poblacionesycausarenfermedades.
10
Se trata de bacterias muy extendidas en la naturaleza, suelen encontrarse sobre substratos

azucaradosybebidasalcohlicas.
Durante el proceso de vinificacin, estos microorganismos pueden ser beneficiosos o
perjudicialessegnelmomentoenqueaparezcan(Ej.Saccharomycescerevisiae,eslaprincipal
responsable de la fermentacin alcohlica y puede ser causante de la enfermedad del velo).
Otrosporelcontrario,sonperjudicialessiempre,yaquenoaportanbeneficioalosvinosyson
precursoresdeenfermedades.EnlasTablas1.1.y1.2.semuestranlosprincipalesgnerosde
levaduras y bacterias, su procedencia y las principales enfermedades que puede causar su
desarrollosucrecimientoenmomentosinadecuados.
Tabla 1.1. Principales gneros de levaduras presentes en el proceso de vinificacin, procedencia y
principalesenfermedades.
Gnero Procedencia Enfermedades

Brettanomyces/Dekkeras Barrica Anomalasolfativas

Saccharomyces Mostodeuva Refermentacin,velo
Rhodotorula MostodeUva Velo
Candida/Metschnikowia MostodeUva Velo

Kloeckera/Hanseniaspora Mostodeuva cidovoltil

Schizosaccharomyces
Mostodeuva Desacidificacindelmosto

Torulaspora
Mostodeuva Velo

Pichia Uva Velo

Hansenula Uva Velo

Zygosaccharomyces Mostodeuva Velo

Debaryomyces Mostodeuva Velo

Cryptococcus Uva Velo
11

Tabla 1.2. Principales gneros de bacterias presentes en el proceso de vinificacin, procedencia y
principalesenfermedades.
Gnero Procedencia Enfermedades

Pediococcus Uvaymosto Oloresindeseables

Oenococcus Uvaymosto Oloresindeseables

Lactobacillus Uvaymosto Ahilado,vuelta,amargor,oloresindeseables

Leuconostoc Uvaymosto Amargor,ahilado

Gluconobacter Uvaymosto Picadoactico

Acetobacter Uvaymosto Picadoactico,ahilado
1.1.5. Factores que influyen en el desarrollo de los microorganismos
Existenvariosfactoresquevanainfluireneldesarrollodeestosmicroorganismos:
Accindelosagentesqumicos
Lassustanciasqumicassegnsuintensidadpuedentenerunaaccinindiferente,estimulante
oletalparaelmicroorganismo.
Accindelpotencialredox
En el proceso de obtencin de energa estn implicadas reacciones qumicas de xido

reduccin que utilizan el oxgeno como ltimo aceptor de electrones. Hay microorganismos
quenecesitanlapresenciadeoxgenoparadesarrollarsemientrasqueotrosporelcontrario,
lapresenciadeoxgenoinhibesucrecimiento.
Existen por tanto tres grandes grupos: los aerobios obligados que necesitan la presencia de
oxgeno, los microorganismos anaerobios dentro de los cuales tenemos los anaerobios
estrictos y los anaerobios aerotolerantes y los microorganismos facultativos que pueden
desarrollarse en presencia de oxgeno y en su ausencia, utilizando otros compuestos como
aceptoresltimosdeelectrones.
12
AccindelpHylaacidez
ElpHeslogaritmodelvalorrecprocodelaconcentracindeioneshidrgeno(H+)ynosvaa
indicar la acidez, basicidad neutralidad de las soluciones. El vino es una solucin ms bien
cida, con un pH que puede variar entre 3 y 4 aproximadamente. Las levaduras del vino se
desarrollan muy bien a pHs entre 3 y 4, las bacterias propias del vino son muy acidfilas, el
crecimiento ptimo de bacterias lcticas se produce a pHs en torno a 3,23,8 y las bacterias
acticassedesarrollaninclusoapH2,5.
Accindelatemperatura
La temperatura es un factor determinante para el desarrollo microbiano, siendo la

temperatura ptima aquella en la que el microorganismo desarrolla al mximo todas sus
funcionesvitales,latemperaturamnimaesaquellaalaqueelmicroorganismoestvivopero
no desarrolla correctamente las funciones de crecimiento y reproductivas y la temperatura
mximaesaquellaalacualelmicroorganismoquedavivoperoinactivo.
Actividaddeagua
Paraquelosmicroorganismospuedanutilizarlasdistintassustanciascomoalimento,stashan
de encontrarse disueltas en agua, dependiendo de la humedad del alimento los
microorganismospodrnonoasimilarestassustancias.
Accindelaluz
Lamayoradelosmicroorganismossevendaadosporlaluzsolardirecta,sinembargonose
venafectadosporlaluzdifusa.
Accindelosagentesbiolgicos
Enlosprocesosnaturalesdetransformacindelamateriasuelenintervenirdistintasespecies
de microorganismos que influyen recprocamente unas sobre otras. Si la influencia se da en
sentido favorable se le llama sinergia, si por el contrario, es desfavorable, se conoce como
antagonismo.
1.1.6. Medios de cultivo
Pararealizarelaislamientodemicroorganismos,seutilizarondistintosmediosdecultivo,tanto
medios especficos como diferenciales. Es importante la eleccin de medios ya que la
composicindelosmediosespecficospermiteeldesarrollodeuntipodemicroorganismosy
lacomposicindelosmediosdiferencialespermiteeldesarrollodeunaespecieconcreta.Se
handebuscarmediosdecultivoparacadatipodemicroorganismoquesequieraestudiaryse
ha de prestar especial atencin a los gneros o especies que ms dificultad de desarrollo
puedanteneryalasinteraccionesquesepuedanproducirentrelospropiosmicroorganismos
presentesenlasmuestras.
Para el desarrollo de levaduras se escogieron los medios Yeast Extract Peptone Dextrose
(YPED), Wickerham y Dekkera Diferential Medium (DDM), para el crecimiento de bacterias
13
lcticas el medio Man Rogosa Sharpe (MRS) y para el desarrollo de bacterias acticas los
mediosAgarManitolymediodeCarr.

1.1.7. Estabilidad de los vinos: defectos y enfermedades
Se pueden definir los defectos del vino como aquellos que estn originados por procesos
fsicosoqumicosqueaadensustanciasextraasalvinoyproducenvariacionesdeaspecto,
olorysabor.
Las enfermedades, sin embargo, son todos los cambios perjudiciales provocados por
microorganismos.Seproducenmodificacionesenlacomposicinqumicadelvinoyseforman
sustancias nuevas indeseables. Estas enfermedades pueden llegar hasta el punto de que el
vinonoseaaptoparaelconsumo.
Suelesermsfcilprevenirlosdefectosquelasenfermedades.
DEFECTOS
Las quiebras son defectos producidos durante la elaboracin del vino que pueden tener un
efectonegativosobresulimpidez,sucolorysuspropiedadesorganolpticas.Puedentenerun
origenfsicoqumico,yaseaporexcesivaoxidacinoporpresenciadeenzimasoxidaxas,por
contaminacindemineralesycompuestosqumicos,porprecipitacionesdebitartratos.
Quiebraparda
El vino se torna color pardo en contacto con el aire, comienza por la superficie y contina
extendindoseatodoelvino,lospigmentosrojosdelvinosevuelvencastaosypuedellegar
inclusoamodificarlascaractersticasorganolpticasdelvino.
Estoesdebidoalapresenciadelaenzimaoxidasapresenteenloshollejosyenlosraspones
del racimo. Si el sulfitado del mosto se realiza correctamente, estas enzimas prcticamente
desaparecen.
Quiebrafrrica
Seobservaunveloblancoenlasuperficie,decoloracinyenturbiamientodelvino.Sueleestar
tambin asociado a precipitaciones de otros compuestos. El sabor del vino solo suele
modificarsesihaycantidadesmuyelevadasdehierro.
Esta quiebra se produce cuando el vino ha permanecido en contacto con hierro durante su
elaboracinydespusentraencontactoconelaire.
Quiebracprica
Seproducelaformacindecompuestosdecobreinsolublesqueenturbianelvino.Elsabordel
vinosevuelvedesagradable.
Cuandoelvinoestuvoencontactoconutensiliosdecobreolatnyentraencontactoconel
aireseproduceesteenturbiamiento.
14
Quiebranegra
Elvinoadquiereuncolorverdeazuladonegroazuladocuandoentraencontactoconelaire.
Esdebidoaqueduranteelprocesodemaceracin,elvinoestuvoencontactoconhierro.
Esta quiebra depender tambin del contenido de taninos, siendo ms fuerte cuantos ms
taninostieneelvino.
Precipitacindetartrico
Se pueden producir precipitados de tartrato de potasio o clcico, cuando las botellas se

depositan en una bodega fra si fueron llenadas en un ambiente fro. La formacin de
cristales se da en vinos embotellados que fueron tratados con carbonato clcico y no se
dejaron reposar el tiempo adecuado en el depsito, por tanto, los cristales precipitan en la
botella. En ocasiones con el tartrato potsico precipitan otras sustancias que perjudican el
aspectodelvino.
Precipitacinproteica
Se da en vinos blancos debido al contenido en protenas de las uvas que son degradadas
lentamente y precipitan cuando la temperatura es elevada. Este tipo de precipitado sucede
despus del embotellado, principalmente en los vinos de alto grado alcohlico. El vino se
enturbiaenelfondodelabotellaquedandoelrestodellquidosinenturbiamiento.
ENFERMEDADES
Floresdelvino
Estaalteracinseproduceporeldesarrollodelevadurasenlasuperficiedelvinodebidoasu
metabolismo aerbico. Comienzan desarrollndose islotes que se van uniendo lasta cubrir
toda la superficie. El color puede variar desde blanco hasta rosado y suele desarrollarse en
vinos jvenes pobres en alcohol. Acta sobre la acidez y sobre el alcohol. Los principales
gneros a los que se asocia esta enfermedad son: Pichia, Candida, Hansenula,
Zygosaccharomyces, Brettanomyces, Torulopsis, Cryptococcus, Rhodotorula, Debaromyces y
Trigonopsis.
Refermentacin
Se da el desarrollo de levaduras por va anaerobia cuando el vino an contiene cantidades

elevadasdeazcares,seproduceunenturbiamientoydesprendimientodegascarbnico.Es
tpicadelgneroSaccharomyces.
GneroBrettanomyces/Dekkeras
Es un gnero que provoca contaminaciones problemticas, debido a que genera graves

anomalas olfativas y afecta a las caractersticas organolpticas del vino. Este tipo de
15
microorganismosnosuelenencontrarsedeformaendgenaenlauva,sinembargosilohace
enlasbarricasderobleutilizadasparalascrianzasdelosvinos.
Mohos
Duranteeldesarrollodelgranodeuva,stepuedeseratacadopordistintosgnerosdemohos
queprovocantantolareduccindelvolumendelacosechacomoladisminucindelacalidad
del vino obtenido. Los principales gneros causantes de estas enfermedades son: Botrytis,
Penicillum,Aspergillus,MucoryCladosporium.
Ahiladoenfermedaddelagrasa
El vino presenta un aspecto aceitoso debido a los muclagos producidos por los
microorganismos.Seproduceenvinosblancosdebajaacidezfija.Losprincipalesgnerosque
producen esta enfermedad son: Streptococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Penicilium y
Acetobacter.
Vueltaorebote
El vino presenta enturbiamientos, cambios de coloracin y burbujas de gas. Se produce en

vinos de pH superior a 3,5 y a temperaturas de 25 C. El olor y el sabor de los vinos se ven
alterado debido a la formacin de compuestos derivados de tetrahidropiridinas por la
degradacindecidotartrico.ElgneroprincipalesLactobacillus.
Enfermedaddelamargor
Suele afectar a vinos tintos de bajo grado alcohlico y presenta sabor inspido amargo,
enturbiamientosyprecipitacindemateriacolorante.Laglicerinasedegradaaacrolena.Los
gnerosimplicadossonLactobacillusyLeuconostoc.
Picadoacticoavinagramiento
Aconsecuenciadelapresenciadebacteriasacticas,elalcoholetlicoseoxidayseproduce
acetaldehdoyacetatodeetilo,cuandolaenfermedadestmsavanzadasepuedeapreciar
turbidez.
1.1.8. Regin de TrsosMontes e Alto Douro y sus vinos
LaregindeTrsosMonteseAltoDouroestsituadaalnoroestedePortugal.Setratadeuna
reginquetienefronteraconlasComunidadesAutnomasdeGaliciayCastillayLen.
EldistritodeBraganadelcual procedenlasmuestraslimitaconlasprovinciasespaolasde
OurenseyZamora.
Elclimadelazonaesunclimatempladoconinfluenciascontinentalesyocenicas.Losveranos
son soleados y clidos, con variacin trmica entre al da y la noche es muy acusada y las
precipitacionesescasas.Losinviernossonmuyfrosyhmedosconlluviasfrecuentes.
16
Laproduccindevinoenestareginesalta,sobretododevinostintosconcrianza,aunque
tambin se producen vinos blancos, rosados, tintos jvenes, espumosos y de aguja. El grado
alcohlicoesvariabledependiendolavariedaddeuvautilizadaylabodegadelaqueprocede,
pudiendoencontrarvinosdesde7,58hastavinosde13,514.
Las principales variedades de uva tinta cultivadas en la zona son: Trincadeira, Bastardo,
Marufo,TintaRoriz,TourigaNacionalyTourigaFranca.
1.1.9. Planteamiento de la investigacin
Lainvestigacinqueseplanteaeselestudiodelaspoblacionesdemicroorganismosresiduales
en vinos regionales (Vinhos Regionais). Todas las muestras estudiadas son vinos tintos de
crianzaprocedentesdelaregindeTrsosMonteseAltoDouro.
LainvestigacinsellevacaboenelInstitutoPolitcnicodeBragana(IPB).
1.2. Objetivos

Los objetivos que se persiguen con esta investigacin son el estudio de microorganismos
residuales,laestimacindepoblacionespormililitroylaidentificacindelasdistintasespecies
presentesenlasmuestrasdevino.Sepretendeconocerlaestabilidaddelosvinos.
Estaspoblacionespuedenserelorigendeenfermedadesyalteracionesdelosvinos,portanto
esimportanteconocerlasespeciesylapoblacinviabledecadagrupodemicroorganismos.

17

MATERIALES
Y
MTODOS

18
2. MATERIALES Y MTODOS
2.1. Equipo de laboratorio empleado

Mechero de Bunsen, autoclave, estufa, agitador, balanza precisin, balanza analtica,
microscopio.
2.2. Materiales
Ernlenmeyer 100250 ml, matraz Quitasato, frascos Pyrex 250500 ml, trompa de vaco,
embudo de Buchner, tubos de ensayo, tapones para los tubos de ensayo, vidrios de reloj,
esptulas, pipetas de distintos volmenes, asa Drigalsky, micropipeta y puntas de 100 l,
placasPetri,aspirapipetas,portaycubreobjetos,cuentagotas,membranasparafiltrado0.45
m,algodn,papeldealuminio,papeldeestraza,esparadrapodepapel,manoplaresistenteal
calor,rotuladorpermanente,asadesiembrayalcohol96.
2.3. Reactivos
La casa comercial Panreac proporcion: Etanol, peptona, glucosa, verde de bromocresol,

cloranfenicol,extractodecarne,agarytween80.
Elcidopcumrico,eldipotasiohidrgenofosfato,eldiamonio,elacetatodesdio,elsulfato
demagnsio,sulfatodemanganesoyelDManitol.
LaempresaDifcosuministrlossiguientesreactivos:YeastNitrogenBase(YNB)yextractode
levadura.YlaempresaOxoid,cicloheximida.
2.4. Muestras de vino
Serealizaronvariosensayosdeuntotalde4muestrasdevinotintoconcrianza.Lasbodegas
queproporcionaronlosvinospertenecenalaregindeTrsosmontes(Portugal).Setratade
pequeascooperativasobodegasfamiliaresdelazonadeBragana.Estosvinoshansalidoal
mercadorecientementeoquesernpuestosalaventaenuncortoperiododetiempo.Sern
comercializados en botella bordelesa de de color verde musgo. Las muestras analizadas
fuerondenominadasmuestra1(M1),muestra2(M2),muestra3(M3),muestra4(M4).
19
2.5. Mtodos
Se llev a cabo la siembra del cultivo, posterior recuento de colonias, aislamiento de los
diferentesmicroorganismoseidentificacin.
Se emplearon distintos mtodos para la deteccin, cuantificacin e identificacin de
microorganismosresiduales.Paradetectarlapresencia/ausenciadelosmismosseutilizaron
medios de cultivo lquidos, con diluciones seriadas. El recuento se llevo a cabo en placa, en
medios slidos especficos para cada tipo de microorganismo. La identificacin se realiz de
formamorfolgicayfisiolgica.
2.5.1. Preparacin de las muestras
Paraprepararlasmuestrasdevinosefiltraron20mldecadaunadelasmuestrasM1,M2,M3
y M4 a travs de membranas de 0.45 m. Se utiliz filtracin al vaco con el material
previamente esterilizado, todo el proceso se realiz junto a un mechero Bunsen para
mantenerestrilelpermetrodetrabajo.
Unavezfiltradaslasmuestras,secolocaronenErlenmeyeresterilizados,tapadosconalgodn
ypapeldealuminioparaevitarcontaminaciones.
2.5.2. Preparacin de los medios de cultivo
Paraprepararlosdiferentesmediosdecultivo(Tabla2.1.)sepesaronlosreactivosnecesarios
en las balanzas. Se disolvieron en agua destilada y se colocaron en los frascos Pyrex para su
esterilizacindejandolaroscaunpocoflojaparaevitarlasobrepresinalentrarenebullicin.
Lasplacasseenvolvieronenpapeldeestraza,lostubosdeensayosecolocaronengradillasy
laspipetasseintrodujeronenunestuchemetlico.
Seintrodujotodoelmaterialenelautoclaveparallevaracabolaesterilizacin.Seemplela
tcnicaempleadafuelaesterilizacinporcalorhmedo,quedestruyetodaslasformasdevida
microbiana,tantolaformavegetativacomolasesporas.Eltratamientoconvapordeaguaes
muyefectivo,a120Cdurante1520mineliminainclusolasendosporasmsresistentes.
Unavezterminadoeltratamientodeesterilizacin,sedistribuyeronlosmediosdecultivocon
agar en las placas para que solidifique. En los tubos de ensayo se distribuyeron 9 ml de los
medioslquidos.Cuandolatemperaturadescendiatemperaturaambiente,seintrodujolos
mediosdecultivoenelrefrigeradorhastasuutilizacin.
Aquellosmediosqueprecisenetanol,steseincorporenelmomentodeutilizarlo,evitando
assuevaporacindurantelaesterilizacin.
20
Tabla2.1.Composicindelosmedios.
MEDIODECULTIVO COMPOSICIN

YNB0,67%(p/v)
Cicloheximida10ppm
Etanol6%(p/v)
DekkeraDiferentialMedium Verdedebromocresol22ppm
(DDM) cidopcumrico100ppm
Aguadestilada
Agar2%(p/v)

Peptona1%(p/v)
Extractodelevadura0,5%(p/v)
Glucosa1%(p/v)
Wickerham Aguadestilada
Agar2%(p/v)

Extractodelevadura1%(p/v)
Peptona2%(p/v)
YeastExtractPeptoneDextrose Glucosa2%(p/v)
(YEPD) Cloranfenicol0,05%(p/v)
Aguadestilada
Agar2%(p/v)

Extractodecarne0,8%(p/v)
Peptona1%(p/v)
Glucosa2%(p/v)
Dipotasiohidrgenofosfato0,2%(p/v)
Tween800,1%(p/v)
ManRogosaSharpe Diamonio0,2%(p/v)
(MRS) Acetatodesdio0,5%(p/v)
Sulfatodemagnsio0,02%(p/v)
Sulfatodemanganeso40ppm(p/v)
Aguadestilada
Agar1,4%(p/v)

Extractodelevadura3%(p/v)
Cicloheximida50ppm(p/v)
CARR Verdedebromocresol(2,2%)1ppm
Etanol2%(v/v)
Aguadestilada
Agar2%(p/v)

DManitol2,5%(p/v)
AgarManitol Peptona0,3%(p/v)
Aguadestilada
Agar1,5%(p/v)
Paralapreparacindemediosslidosseadicionagaral20%comoendurecedor.
21
2.5.3. Siembra, recuento y aislamiento de colonias.
Habitualmente las muestras que se estudian contienen poblaciones muy elevadas de

microorganismos y es necesario diluirlas para poder realizar el recuento. Los bancos de
dilucionesylaposteriorsiembraenplacasconmediosdecultivossonmuyfrecuentes.
Esta tcnica nos va a permitir conocer el nmero de microorganismos viables que hay en la
muestra.Losmicroorganismosviablessonaquellosquetienencapacidadparamultiplicarseen
mediosdecultivossolidificadosyformarcolonias.
Mtodosdelasdilucionessucesivas
Se llenan los tubos de ensayo con 9 ml de agua destilada. Se toma 1 ml de la muestra
problema y se aade a uno de los tubos, se agita el tubo para homogeneizar. Este tubo
presenta una concentracin 10 veces menor que la muestra inicial, concentracin 101. Se
repite la operacin a partir de esta dilucin para conseguir la dilucin 102 y as de forma
sucesiva.
Apartirdelasdilucionesobtenidassembramoslasplacas,lacantidaddeinculoquesedebe
sembrarvendrdadaporeltipodemicroorganismoquesequieraestudiar.

Figura2.1.Dilucionespararecuentodemicroorganismos.MicrobiologyMc.GrawHill.
2.5.4. Siembra de microorganismos en los medios de cultivo
Segneltipodeestudioarealizar,eltipodesiembraquesedeberealizarserdiferente.
22
Siembrademedioslquidos
Se colocan 9 ml del medio lquido en un tubo de ensayo, se aade 1 ml de inculo y se

agita con ayuda del agitador para homogeneizar los microorganismos en todo el medio.
Estasiembraescomnalosdistintostiposdemicroorganismosobjetodeestudio.
Siembraporversacin
Secoloca1mldelinoculoenunaplacaPetriysobreelmismosevierteelmediodecultivo
fundido, se mueve la placa cuidadosamente en distintas direcciones y realizando
semicrculos para garantizar la distribucin homognea de los microorganismos en el
medioysedejasolidificar.Seutilizaparamicroorganismosanaerobios(bacteriaslcticas).
Siembraensuperficie
SeviertesobrelaplacaPetrielmediodecultivofundidoysedejasolidificar,unavezslido
seaade100ldeinculoyseextiendeporlasuperficieconayudadeunasaDrigalsky.Se
utilizaparamicroorganismosaerobios(levadurasybacteriasacticas).

2.5.5. Procedimiento para la determinacin de presencia de

microorganismos y produccin de acidez
Para la determinacin de presencia de microorganismos se emplearon medios de cultivo

lquidos, analizando la turbidez de los mismos en el caso de los medios YEPD, CARR, MRS y
Manitolcomoconsecuenciadelcrecimientodemicroorganismosyelcambiodecoloracinen
elcasodelosmediosDDMyWickerhamdebidoalaproduccindecido.

2.5.6. Recuento de microorganismos y estimacin de poblacin

Traselperiododeincubacindelasplacas,seseleccionanaquellasqueposeenentre30y300
colonias aproximadamente del microorganismo que se quiere estudiar, puesto que nos
proporcionalaprecisinestadsticanecesaria.Lasplacasquetenganunnmeroinferiora30
coloniasnosetendrnencuentayaqueelmargendeerrorestadsticoesbastanteelevado,
por encima de 300 colonias es muy comn el solapamiento de las mismas y el recuento
tampocoseracorrecto.
Aquellas colonias que se encuentren presentes en un nmero reducido sern tiles para la
identificacindelmicroorganismoperonoparaelrecuento.
Paraestimarlapoblacinsecalculanelnmerodeunidadesformadorasdecoloniaspormlde
muestra(UFC/ml)secalcula:

23
UFC/ml=
2.5.7. Aislamiento de microorganismos

Cadamicroorganismoseaislenunaplacadiferenteparagarantizarelcultivopurodelmismo.
Elcriterioseguidoparaelaislamientofueelaspectodelacolonia,decadamuestrasetomaron
6cepasdelevadurasy6cepasdebacterias.
Seincubaronlasplacasparaelcrecimientodemicroorganismosydespusseconservaronen
el refrigerador a una temperatura de 4 C aproximadamente. Para realizar los anlisis de
utilizaroncultivosjvenes,encasodehabernecesitadounaconservacinalargoplazopueden
emplearsetcnicasdecongelacinliofilizacin.
Aislamientoenmediosslidosporsiembraenestras
El aislamiento se realiz tomando con un asa de siembra 6 colonias de cada muestra en las
placas de recuento y cada una se traslad a una placa Petri. Se procedi a la siembra en
superficieenestrasparalelasenuncuartodesuperficiedelaplacaPetri,posteriormentese
esteriliz el asa y se gir la placa 90 aproximadamente, se extendi en estras nuevamente
sobreotrocuartodesuperficietocando34veceselreasembradaanteriormentecubriendo
otro cuarto de la placa. Se repiti este proceso dos veces ms, sin esterilizar el asa, hasta
completar la siembra en toda la superficie de la placa. sta tcnica Se utiliza para el
aislamientodetodoslosmicroorganismosobjetodeestudio.

2.5.8. Tcnicas para la identificacin de microorganismos
Paralaidentificacindemicroorganismosseutilizarontcnicasmorfolgicasyfisiolgicas.
Morfolgicamente se analiz el aspecto visual macroscpico de la colonia: tamao, color,
brillo, contorno caractersticas especiales y microscpicamente el aspecto visual celular:
formadelasclulasdelcultivojoven.
Pararealizarlaobservacinalmicroscopiohemosdecolocarunagotadeaguadestiladasobre
el portaobjetos, con ayuda del asa de siembra se coloca una pequea cantidad del cultivo
puro,dejndoloensuspensinenlagotadeagua.Secolocaelcubreobjetos.
Elsistemadeidentificacinempleadoparalaslevadurasybacteriasserealizempleandolas
galeras API, que estn constituidas por una serie de cpulas que contienen substratos
deshidratados y permiten realizar ensayos de asimilacin. Las cpulas se inoculan con los
microorganismosenestudioenunmediomnimosemiagarysolamentecrecensisoncapaces
de utilizar el substrato correspondiente. Se realiz la lectura de estas reacciones por
comparacin con el testigo de crecimiento y la identificacin se obtuvo con la ayuda del
programainformticodeidentificacin.
Identificacindelevaduras
24
SeempleelGaleracomercialApi20CAUXdeBiomrieux(France).Estcompuestodeuna
galerayunmediopararealizarlasuspensindelmicroorganismo.
La galera posee 21 cpulas, 19 de las cuales contienen carbohidratos deshidratados, un
control y una ltima cpula en la cual se puede observar la formacin de
micelio/paseudomicelioporpartedelmicroorganismoaadiendounagotadeTween80.
El medio est constituido por sulfato amnico, fosfato monopotsico, fosfato dipotsico,
fosfatodisdico,clorurosdico,cloruroclcico,sulfatomagnsico,LHistidina,LTriptfano,
LMetionina, agente gelificante, solucin de vitaminas, solucin de oligoelementos y agua
desmineralizada.
Para preparar el inculo, esterilizamos tubos de ensayo con 5 ml de solucin salina NaCl al
0,85%.Conayudadeunasadesiembrasetomaunamuestradelacoloniaysedisuelveenel
tubo.Setransfieren100ldeestasuspensinalmedioqueproporcionaelGalera.
Paraprepararlagalera,setomaunodelosfondosdelascmarasdeincubacinysereparte
aguadestiladaenlospocillos,secogeunagaleraysedepositaenlacmaradeincubacin.
Se llenan las cpulas con la suspensin obtenida en el medio API 20 CAUX Medium,
procurando que el lquido quede con un nivel ligeramente cncavo y sin burbujas. Se cubre
con la tapa y se lleva a la estufa donde permanece 24 h a 30 C, una vez transcurrido ese
tiempo, se anotan como positivas las cpulas que presenten ms turbidez que la cpula
control.Sedebencomprobarlosresultadosalas72h.
Conlosresultadospositivos/negativossecreaunperfilnumricodesietedgitos,elfabricante
proporciona una base de datos y un catlogo analtico donde se comprueba a que levadura
perteneceeseperfil.
Tabla2.2.CarbohidratosquecomponenlagaleraAPI20CAUX.
CarbohidratosGaleraAPI20CAUX
2ceto L D D
Control DGlucosa Glycerol glucanato Arabinosa Xylosa Adonitol Xylitol Galactosa Inositol
clcico
D MetilD NAcetil D D D D D D
Sorbitol Glucopiranosa Glucosamina Cellobiosa DLactosa Maltosa Sacarosa Trehalosa Melezitosa Rafinosa
Identificacindebacterias
SeemplelagaleracomercialAPI50CHLdeBiomrieux(France).Estagaleraestcompuesto
por5galerasyunmediodesuspensin.
Elaislamientodelosmicroorganismosparalautilizacindelagalerasehaderealizarsobre
mediodecultivoMRS.
Lapruebasebasaenelcatabolismode49azcares/polialcoholesyuncontrol.Losrecipientes
tienenunapequeazonaaerobiayotraanaerobia.Lazonaanaerobiatieneformatubularque
contienelosdistintossustratosylazonaaerobiatieneformadecpula.
Elmedioestconstituidoporpolipeptona,extractodelevadura,Tween80,fosfatodipotsico,
acetato sdico, citrato diamnico, sulfato de magnesio, sulfato de manganeso, prpura de
bromocresol,aguadesmineralizada.
25

Paraprepararelinculo,setomanvariascoloniashastacrearunasuspensinenelmedioAPI
50CHLMedium.Sereparteestasuspensinenlostubosdelasgalerasyserecubreconaceite
deparafina.Seincubanlasgalerasa37Cdurante48h.
Seformancidosorgnicosqueprovocanelcambiodecoloracindeprpuraaamarillo,enel
casodelaesculinaelvirajeseproducedeprpuraanegro.
Con los resultados obtenidos, se crea un perfil bioqumico que se comprobar en la base de
datoscatlogoanalticoproporcionadoporelfabricante.
Tabla 2.3. Carbohidratos y polialcoholes que componen la galera API 50 CHL para identificacin de
bacterias.
CarbohidratosypolialcoholesGaleraAPI50CHL
MetilD
Control Galactosa Manopiranosa DMelibiosa DTuranosa

MetilD
Glycerol Glucosa Glucopiranosa DZaharosa DLyxosa

Erythrol Fructosa NAcetilglucosamina DTrehalosa DTagatosa

DArabinosa Manosa Amigdalina Inulina DFucosa

LArabinosa Sorbosa Arbutina DMelezitosa LFucosa

Ribosa Rhamnosa Esculin DRafinosa DArabitol

DXylosa Dulcitol Salicin Almidn LArabitol

LXylosa Inozitol DCellobiosa Glycogen Gluconatodepotasio

Adonitol Manitol DMaltosa Xylitol 2KetoGluconato

MetilXylosida Sorbitol DLactosa Gentiobiosa 5KetoGluconato
2.6. Medios de cultivo
Para la determinacin de presencia y para el recuento de los microorganismos residuales se

emplearondistintostiposdemediosdecultivo:mediosselectivosymediosdiferenciales.
Losmediosselectivospermitenel desarrollodeundeterminadogrupode microorganismo e
inhibe el crecimiento de los dems. Son selectivos los medios de cultivo Wickerham, Yeast
ExtractPeptoneDextrose(YEPD),ManRogosaSharpe(MRS),CARRyAgarManitol.
Losmediosdiferencialespermiteneldesarrollodeunaespecieconcretademicroorganismos
dentrodeunamezclamediantecaracteresdiferenciales.ElmedioDekkeraDiferentialMedium
(DDM)esunmediodecultivodiferencial.Laincubacinparaeltratamientodelevadurasesde
26
2448 h a una temperatura de 25 C y el periodo de incubacin para el tratamiento de

bacteriasesde24ha37C.

RESULTADOS

27

3. RESULTADOS
Los resultados que se presentan, son aquellos obtenidos tras realizar el cultivo de
microorganismosentubosyenplacasenelmomentodeaperturadelasbotellas,esdecir,del
vinoterminado(t=0)ypasadosdosmeses(t=40),laconservacindelasbotellasentrelos
ensayos se realiz en refrigeracin a 4 C para tener control sobre la temperatura de las
botellas. La presencia de oxgeno es un factor que influy en el desarrollo de los
microorganismos,yaquecuandosedescorchlabotellasepotencilaentradadeaireenel
recipiente.
Las botellas se conservaron en posicin horizontal y se homogeneizaron antes de tomar las

muestras.
3.1. Determinacin Ausencia/Presencia de microorganismos
Paradeterminarlapresenciademicroorganismosseemplearonmediosdecultivolquidos.
EnlosmediosDDMyWickerhamsevalorelcambiodecoloracindelosmediosdebidoala
produccindeacidezyelcambiodepH,enelmedioDDMelvirajeseproducedeazulaverde
yenelmedioWickerhamdedoradohaciatransparente.
EnlosmediosCARR,Manitol,YEPDyMRS,seobservlaturbidezquepresentabanlostubosa
causadelcrecimientodelosmicrorganismos.
Entodosloscasoslostubospermanecieronenlaestufa24h,lostubosquecontenanmedios
paraelcrecimientodelevadurasa25Cylostubosparaelcrecimientodebacteriasa37C.
3.1.1. Levaduras
EnlaTabla3.1.semuestralaturbidezquepresentelmediodecultivoenelvinoterminadoy
alosdosmeses,enlamuestraM2seobservaunpequeoaumentoenlaturbidezalosdos
mesesrespectodelinicio.
EnlaTabla3.2.semuestralaproduccindeacidezendosmediosdecultivodistintos,enla
mayoradeloscasoslaproduccindeacidezesmsnotablealosdosmesesqueenelvino
terminado.Setratadeunmedioselectivo(Wickerham)ydeunmediodiferencial(DDM)para
elgneroBrettanomyces/Dekkeras.
28
Tabla3.1.DeterminacindelapresenciadelevadurasmedianteturbidezenelmedioYEPDlquidoen
losvinosterminados(t=0)yalosdosmeses(t=40).
TIEMPO
PRUEBA (das) MUESTRAS
Control M1 M2 M3 M4
C1 C2 C3 M11 M12 M13 M21 M22 M23 M31 M32 M33 M41 M42 M43

Crecimiento/ 0 ++++++++ ++++ ++++++ +++++++
turbidez

(MedioYEPD) 40 ++++++++ +++++ ++++++ +++++++

Tabla 3.2. Determinacin de la presencia de levaduras mediante produccin de acidez en los medios
DDMyWickerhamlquidosenlosvinosterminados(t=0)yalosdosmeses(t=40).
TIEMPO
PRUEBA (das) MUESTRAS
Control M1 M2 M3 M4


Produccin 0 ++++++ +++ ++++++ +++
deacidez

(MedioDDM) +++++++++ +++ +++++++++ ++++++
40

Produccin 0 ++++++ +++ +++ ++++++
deacidez

(Medio 40 +++++++++ ++++++ ++++++ ++++++
Wickerham)
3.1.2. Bacterias
Elcrecimientodebacteriaslcticasfuebastantebajoentodosloscasosylaturbideznosevio
afectada por el paso del tiempo. En la Tabla 3.3. semuestran los resultados obtenidos en el
vinoterminadoyalosdosmeses.
Lasbacteriasacticasnollegaronadesarrollarseenningncaso,nienlosvinosterminadosni
alos40dascomosereflejaenlaTabla3.4.
29
3.1.2.1. Bacterias lcticas
Tabla3.3.DeterminacindelapresenciadebacteriaslcticasmedianteturbidezenmedioMRSlquido.

TIEMPO

(das) MUESTRAS
PRUEBA
Control M1 M2 M3 M4

Crecimiento/ 0 + ++++ +
turbidez

(MedioMRS) 40 + ++++ +

3.1.2.2. Bacterias acticas
Noseprodujoturbidezdebacteriasacticasenlosmediosdecultivossembradosenninguna
delasmuestrasdevino,noencontrndosepoblacinresidualdebacteriasacticasnienlos
vinosterminadosnialosdosmeses(t=40).
3.2. Recuento de microorganismos y estimacin de poblacin
Elrecuentodemicroorganismosserealizunaveztranscurridoelperiododeincubacinenlas
placasPetriquedesarrollaronentre30y300coloniasaproximadamente.
ElclculodeUnidadesFormadorasdeColonias(UFC)sellevacaboenlasmuestrasdevino
una vez terminada la vinificacin (t = 0) y a los cuarenta das (t = 40) empleando para las
levaduras los medios selectivos Wickerham y YEPD y para las bacterias lcticas el medio
selectivoMRS.
3.2.1. Levaduras
La Tabla 3.4. muestra los resultados obtenidos para el recuento de colonias y estimacin de
poblacindelevadurasenlosmediosdecultivoWickerhamyYEPD.Entodaslasmuestrasse
produceunaumentodelapoblacinalosdosmesesdelaaperturadelasbotellas.
30
Tabla3.4.Recuentodecoloniasypoblacindelevadurasresiduales(clulas/ml)enlasmuestrasdevino
terminado(t=0)yaloscuarentadas(t=40).
TIEMPO
(das) MUESTRA
Dilucin M1 M2 M3 M4
M11 M12 M13 M21 M22 M23 M31 M32 M33 M41 M42 M43

0 2
10 412 75 581 544013
Medio

Wickerham

40 2
10 287271292 10510498 307315300 203209184

4
0 * * * 3,5x10
UFC(cels/ml)
5 5 5 5
40 2,8x10 1x10 3,1x10 6x10

0 2
10 174167182 596267 942 10111097

MedioYEPD

40 2
10 258235248 799984 100105142 94107122

5 4 5
0 1,7x10 6,2x10 * 1x10
UFC
(cels/ml)
5 5 5 5
40 2,5x10 2,6x10 1,2x10 1,1x10
*:Laestimacindepoblacinresidualdelevaduraspormlpresenteenestamuestraesinferiora103
clulas/ml.
3.2.2. Bacterias
En la Tabla 3.5. se muestra el recuento de colonias y la estimacin de poblacin residual de

bacteriaslcticas.nicamenteserealizlaestimacinenlamuestraM3,yaqueenlosotros
casos el recuento de colonias fue muy bajo. La poblacin increment ligeramente a los dos
mesesdeaperturadelasbotellas.
31
Tabla3.5.Recuentodecoloniasypoblacindebacteriaslcticasresiduales(clulas/ml)enlasmuestras
devinotintoterminado(t=0)yaloscuarentadas(t=40).
TIEMPO
(das) MUESTRA
Dilucin M1 M2 M3 M4
M11 M12 M13 M21 M22 M23 M31 M32 M33 M41 M42 M43

0 1
10 17 1067 374441 335

MedioMRS

40 1
10 36 1468 384642 356

2
* * 4x10 *
0
UFC(cels/ml)
2
* * 4x10 *
40
*: La estimacin de poblacin residual de bacterias porml presente en esta muestra es inferior a 102
clulas/ml.
3.3. Identificacin de microorganismos
Laidentificacindemicroorganismosserealiztraselaislamientoyelperiododeincubacin
delascoloniasobtenidasenlasplacasconmediosslidos.Seaislaronuntotalde24levaduras
(6levaduras/muestra)y24bacteriaslcticas(6bacteriaslcticas/muestra)delasmuestrasde
vinoterminadoyelmismonmerodeellasatiempo40das.
3.3.1. Identificacin fisiolgica de levaduras
EnlasTablas3.6.y3.7.semuestraeldiagnsticodelevadurasaisladasenlasmuestrasdevino
terminadoyalosdosmesesdeaperturadelasbotellas.Serealizaronpruebasdeasimilacin
decarbohidratosparapoderrealizareldiagnstico.SeidentificaronlosgnerosRhodotorula,
Candida, Saccharomyces y Brettanomyces/Dekkeras aunque no se diagnosticaron las mismas
especiesenlosvinosterminadosyalosdosmeses.
32
Tabla3.6.Diagnsticodelascepasdelevadurasaisladasenlasmuestrasdevinoterminado(t=0).
PRUEBADEASIMILACINDECARBOHIDRATOS
NmerodeCepas

3 1 3 4 13
Substrato
Control
DGlucosa + +/ + + +
Glycerol +/ +
2cetogluconatoclcico +/ +/
LArabinosa +/ +
DXylosa +/ + +
Adonitol + +/
Xylitol
DGalactosa + + +
Inositol +/
DSorbitol +
MetilDGlucopiranosida +/ +
NAcetilGlucosamina +/ +
DCellobiosa +/ +
DLactosa +/ +
DMaltosa +/ + +
DSacarosa + + +
DTrehalosa +/ +
DMelezitosa +/ +
DRafinosa + +

DIAGNSTICO Candida Rhodotorula Rhodotorula Candida Saccharomyces
krusei glutinis mucilaginosa tropicalis cerevisiae
33
Tabla3.7.Diagnsticodelascepasdelevadurasaisladasenlasmuestrasdevinoalos2meses(t=40).
PRUEBADEASIMILACINDECARBOHIDRATOS
Nmerodecepas

15 1 3 1 4

Substrato
Control
DGlucosa + +/ + + +
Glycerol +/ +/ +
2cetogluconatoclcico +/ +/ +/
LArabinosa +/ +/ +
DXylosa +/ + +
Adonitol +/ + +/
Xylitol +/
DGalactosa +/ + + +
Inositol +/
DSorbitol +
MetilDGlucopiranosida +/ +/ +
NAcetilGlucosamina +/ +
DCellobiosa +/ +/ +
DLactosa +/ +
DMaltosa +/ +/ + +
DSacarosa +/ + + +
DTrehalosa +/ +/ +
DMelezitosa +/ +/ +
DRafinosa +/ + +

DIAGNSTICO No Rhodotorula Rhodotorula Candida Saccharomyces
Identificado glutinis mucilaginosa tropicalis cerevisiae
Algunas cepas de levaduras no pudieron ser identificadas ya que la asimilacin de

carbohidratos era muy variable y el software del fabricante no proporcion un diagnstico
concreto fiable. Se diagnosticaron como pertenecientes al gnero Brettanomyces/ Dekkeras
por discriminacin olfativa y por el periodo de incubacin. Es muy caracterstico de este
gneroeloloracuero,asudordecaballo,aestabloyelperiododeincubacinfuede78das.
La especie Pichia guilliermondii es capaz de desarrollarse en el mismo medio de cultivo que
Brettanomyces/Dekkeras, para diferenciarlos se debe tener en cuenta el periodo de
incubacin.EnelcasodePichiaguilliermondiilasprimerascoloniasseobservanalos23dasy
en el caso del gnero Brettanomyces/Dekkeras el periodo de incubacin es de 67 das
inclusosuperior(MilletandLonvaudFunel,2000;Rodriguesetal.2001).
34

terminado.
Enlassiguientestablassemuestranlasespeciesdelevadurasqueseaislaronenlasdistintas
muestrasdevinoterminado.Saccharomycescerevisiaefuelaespecieconmayorpresenciaen
todaslasmuestras.
Tabla3.8.EspeciesaisladasypoblacindelevadurasdelamuestraM1devinotintoterminado.
Caracteresmorfolgicos Caracteresfisiolgicos
Macroscpico Microscpico Diagnstico
Muestra Cepas Aspectodelacolonia Formacelular Especie
Colorblancocremoso,
M10L1 brillante,lisa,bordes Esfricasubesfrica Candidakrusei
irregulares
Colorblanco,brillante,
M10L2 convexa,formaregular
Alargada,globosa Saccharomycescerevisiae
Colorblanco,brillante,
M10L3 superficielisa,bordes Esfricasubesfrica Candidakrusei
regulares
M10
Colorblanco,lisa,regular
M10L4 ybrillante
Alargada,elptica Saccharomycescerevisiae
Colorblancobrillante,
M10L5 lisas,bordesregulares
Colorblancas,aspecto
M10L6 hmedo,brillante,bordes Globosayalargada Saccharomycescerevisiae
muyregulares

Poblacintotaldelamuestra:

1,7x105cls/ml
35

M20L1 Colorblancas,aspecto
hmedo,brillante,bordes Esfricaalargada Rhodotorulamucilaginosa
muyregulares
M20L2 Colorrosado,rugosay
Esfricaalargada Rhodotorulamucilaginosa
hmeda
M20L3 Colorcoralyaspecto
Globosayalargada Saccharomycescerevisiae
rugoso
M20 Colorblancas,aspecto
M20L4
hmedo,brillante,bordes Alargada,globosa Saccharomycescerevisiae
muyregulares
M20L5 Colorblanco,brillante,
Alargadayglobosa Saccharomycescerevisiae
convexa,bordesregulares
convexa,formaregular
6,2x104cls/ml
36

M30L1 Colorrosado,rugosay
Esfricaalargada Rhodotorulamucilaginosa
hmeda
M30L2 Coloranaranjado,aspecto
graso,satinada,bordes Ovoide,globosa Rhodotorulaglutinis
irregulares
M30L3 Colorblancocremoso,
brillante,lisa,bordes Esfricasubesfrica Candidakrusei
irregulares
M30
M30L4 Colorblancobrillante,
lisas,bordesregulares
M30L5 Colorblancocrema,
brillantes,conbordes Esfricasubesfrica Candidatropicalis
irregulares
1,3x105cls/ml
37

M40L1 Colorblanco,brillantes,
Esfricasubesfrica Candidatropicalis
conbordesirregulares
M40L2 Colorblanco,aspecto
hmedo,brillante,bordes Globosayalargada Saccharomycescerevisiae
muyregulares
M40L3 Coloryaspectocremoso,
superficielisa,conbordes Esfricasubesfrica Candidatropicalis
irregulares
M40
M40L4 Colorcrema,aspecto
Esfricasubesfrica Candidatropicalis
graso,contornoirregular
M40L6 Colorblancobrillante,
lisas,bordesregulares
3,5x104cls/ml
38

a los dos meses (t = 40).
Acontinuacinsemuestranlasespeciesdelevadurasqueseaislaronenlasdistintasmuestras
de vino transcurridos dos meses desde la apertura de las botellas. El gnero
Brettanomyces/Dekkeraselmsaisladoalosdosmesesentodaslasmuestras.
Tabla3.12.EspeciesaisladasypoblacindelevadurasdelamuestraM1devinotintoalosdosmeses
(t=40).
M140L1 Colorblanco,depequeo
Ojival Brettanomyces/Dekkeras
tamao,convexa
M140L2 Colorcremosoblanco,
dimetropequeo, Cilndrica Brettanomyces/Dekkeras
brillante
M140L3 Colorcrema,brillante,de
Cilndrica Brettanomyces/Dekkeras
bordesregulares
M140
M140L4 Colorblancomarfil,
brillante,contornoregular
M140L5 Colorcremoso,aspecto
brillante,tamao Ojival Brettanomyces/Dekkeras
pequeo
M140L6 Colorblanco,convexa,
brillante
5,3x105cls/ml
39
(t=40).
brillante,aspecto Globosa Saccharomycescerevisiae
hmedo,bordesregulares
M240L2 Colorblanco,convexa,
brillante
M240L3 Colorrosado,rugosa,
Esfrica Rhodotorulamucilaginosa
aspectohmedo
M240 Colorcremoso,aspecto
M240L4
hmedo,depequeo Cilndrica Brettanomyces/Dekkeras
tamao
Ojivalcilndrica Brettanomyces/Dekkeras
convexa,contornoregular
M240L6 Colorcoral,rugosa,
Alargada Rhodotorulamucilaginosa
bordesregulares
3,6x105cls/ml
40
(t=40).
M340L1 Colorblanquecino,
convexa,contornoregular
M340L2 Colorrosacoral,aspecto
hmedo,bordespoco Alargada Rhodotorulamucilaginosa
irregulares
brillante,lisa,convexa, Alargada Saccharomycescerevisiae
regular
M340
M340L4 Colorcrema,compacta,
Esfrica Brettanomyces/Dekkeras
convexa,regular
M340L5 Coloranaranjado,
estriada,aspectograso, Ovoide Rhodotorulaglutinis
permetroirregular
M340L6 Colorcrema,pequea,
Ovoide Brettanomyces/Dekkeras
brillante,bordesregulares
4,3x105cls/ml
41
(t=40).
M440L1 Colorcrema,compacta,
brillante,bordesregulares
Ovoide Brettanomyces/Dekkeras
pequea,convexa,regular
M440L3 Colorblanco,aspecto
Cilndrica Brettanomyces/Dekkeras
brillante,contornoregular
M440 M440L4 Colorcremoso,de

pequeotamao, Cilndrica Brettanomyces/Dekkeras
compacta,circular
Alargada Saccharomycescerevisiae
lisa,permetroregular
M440L6 Colorcrema,convexa,
brillante,grasa,bordes Esfricasubesfrica Candidatropicalis
irregulares
7,1x105cls/ml
3.3.4. Identificacin fisiolgica de bacterias lcticas
En las Tablas 3.16. y 3.17. se muestra el diagnstico de las bacterias lcticas aisladas en las
muestras de vino terminado y a los dos meses. Se realizaron pruebas de asimilacin de
carbohidratos y polialcoholes para realizar el diagnstico. Se identificaron los gneros
Lactobacillus y Oenococcus, se diagnosticaron las mismas especies en los vinos terminados y
transcurridosdosmesesdesdelaaperturadelasbotellas.
42
Tabla3.16.Diagnsticodelascepasdebacteriaslcticasaisladasenlasmuestrasdevinoterminado
(t=0).
Substrato PruebadeasimilacinSubstrato(cont.)Pruebadeasimilacin(cont.)
Control Esculin + +
Glycerol Salacin +
Erythrol DCellobiosa +
DArabinosa + DMaltosa +
Larabinosa + DLactosa +
Ribosa + DMelibiosa +
DXylosa + DZarahosa +
LXylosa DTrehalosa +
Adonitol Inulina
BMetilXylosida DMelezitosa +
Galactosa + + DRafinosa +
Glucosa + + Almidn
Fructosa + + Glycogen
Manosa + Xylitol
Sorbosa Gentiobiosa +
Rhamnosa DTuranosa +
Dulcitol DLyxosa
Inozitol DTagatosa
Manitol + DFucosa
Sorbitol + LFucosa
MetilD + DArabitol
Manopiranos
MetilD LArabitol
Glucopiranosa
NAcetilglucosamina + Gluconatode +/
potasio
Amigdalina + 2Keto
Glucanato
Arbutina + 5Keto
Glucanato

NmerodeCepas1113 DIAGNSTICO Oenococcus Lactobacillus
oeni plantarum
43

Tabla 3.17. Diagnstico de las cepas de bacterias lcticas aisladas en las muestras de vino a los dos
meses(t=40).
Substrato PruebadeasimilacinSubstrato(cont.)Pruebadeasimilacin(cont.)
Control Esculin + +
Glycerol Salacin +
Erythrol DCellobiosa +
DArabinosa + DMaltosa +
Larabinosa + DLactosa +
Ribosa + DMelibiosa +
DXylosa + DZarahosa +
LXylosa DTrehalosa +
Adonitol Inulina
BMetilXylosida DMelezitosa +
Galactosa + + DRafinosa +
Glucosa + + Almidn
Fructosa + + Glycogen
Manosa + Xylitol
Sorbosa Gentiobiosa +
Rhamnosa DTuranosa +
Dulcitol DLyxosa
Inozitol DTagatosa
Manitol + DFucosa
Sorbitol + LFucosa
MetilD + DArabitol
Manopiranos
MetilD LArabitol
Glucopiranosa
NAcetilglucosamina + Gluconatode +/
potasio
Amigdalina + 2Keto
Glucanato
Arbutina + 5Keto
Glucanato

NmerodeCepas 915 DIAGNSTICO Oenococcus Lactobacillus
oeni plantarum
44
3.3.5. Especies de bacterias lcticas y poblacin total para las muestras de

vino terminado.
Enlassiguientestablassemuestranlasespeciesdebacteriaslcticasaisladasenlasmuestras
devinoterminado.
Tabla3.18.EspeciesaisladasypoblacindebacteriaslcticasdelamuestraM1devinotintoterminado.
M10B1 Colorblanco,circular,
Bacilo Lactobacillusplantarum
opaca,lisa,irregular
M10B2 Colorblanco,lisa,
Cocobacilo Oenococcusoeni
redondeada
M10B3 Colorgrisceo,pequea,
Coco Oenococcusoeni
lisa,contornoredondeado
M10 M10B4 Colorblancoamarillo,

convexa,formaalargadae Bacilo Lactobacillusplantarum
irregular
M10B5 Colormarfil,lisa,de
pequeotamao,bordes Coco Oenococcusoeni
regulares
M10B6 Colorblanco,forma
circular,opaca,convexa, Bacilo Lactobacillusplantarum
bordesirregulares
<102cls/ml
45
M20B1 Colorgrisceo,lisay
Coco Oenococcusoeni
redondeada
M20B2 Colorblancomarfil,
pequea,bordes Coco Oenococcusoeni
regulares
Coco Oenococcusoeni
brillante,regular
M20 M20B4 Colorblanco,lisa,

pequea,bordes Cocobacilo Oenococcusoeni
regulares
M20B5 Colorblancoamarillo,
opaca,convexa,irregular
M20B6 Colorblancogrisceo,
pequea,brillante, Coco Oenococcusoeni
contornoregular
<102cls/ml
46
M30B1 Coloramarillosuave,
convexa,lisa,irregular
M30B2 Colorblanco,aspecto
suaveybrillante,circular
Coco Oenococcusoeni
pequea,regular

Coco Oenococcusoeni
redondeada
M30B5 Colorvainilla,convexa,
opaca,alargadae Bacilo Lactobacillusplantarum
irregular
M30B6 Colormarfil,pequeay
Coco Oenococcusoeni
redondeada
4x102cls/ml
47

M40B1 Colorcrema,aspecto
suave,opaca,lisa,circular Bacilo Lactobacillusplantarum
eirregular
M40B2 Colorblancogrisceo,lisa,
Coco Oenococcusoeni
regular
M40B3 Colorblanco,convexa,
alargada,bordes Bacilo Lactobacillusplantarum
irregulares
M40 M40B4 Colorblancomarfil,
brillante,lisa,contorno Coco Oenococcusoeni
regular
opaca,alargada,contorno Bacilo Lactobacillusplantarum
irregular
suave,lisa,convexa, Bacilo Lactobacillusplantarum
bordesirregulares
<102cls/ml
48
3.3.3. Especies de bacterias lcticas y poblacin total para las muestras

de vino a los dos meses (t = 40).
En las tablas que se presentan a continuacin se muestran las especies de bacterias lcticas
aisladasenlasmuestrasdevinoalosdosmeses.
Tabla3.22.EspeciesaisladasypoblacindebacteriaslcticasdelamuestraM1devinotintoalosdos
meses(t=40).
M140B1 Colorcrema,aspecto
suave,opaca,lisa,circular Bacilo Lactobacillusplantarum
eirregular
M140B3 Colormarfil,pequeay
Coco Oenococcusoeni
redondeada

Coco Oenococcusoeni
redondeada
irregular
circular,opaca,convexa, Bacilo Lactobacillusplantarum
bordesirregulares
<102cls/ml
49
meses(t=40).
opaca,convexa,irregular
opaca,alargada,contorno Bacilo Lactobacillusplantarum
irregular
M240B3 Colorblanco,circular,
opaca,lisa,irregular
M240
M240B4 Colorblancogrisceo,lisa,
Coco Oenococcusoeni
regular
convexa,lisa,irregular
M240B6 Colorgrisceo,pequea,
Coco Oenococcusoeni
lisa,contornoredondeado
<102cls/ml
50
meses(t=40).
M340B1 Colorblancomarfil,
brillante,lisa,contorno Coco Oenococcusoeni
regular
irregular
circular,opaca,convexa, Cocobacilo Lactobacillusplantarum
bordesirregulares
M340
Coco Oenococcusoeni
pequea,regular
Coco Oenococcusoeni
Coco Oenococcusoeni
redondeada
4x102cls/ml
51
meses(t=40).
suave,opaca,alargadae Bacilo Lactobacillusplantarum
irregular
M440B2 Colorgrisceo,brillante,
Coco Oenococcusoeni
lisa,redondeada
M440B3 Colorvainilla,lisa,forma
circular,irregular
M440 M440B4 Coloramarillosuave,

convexa,opaca,irregular
M440B5 Colorcrema,sinbrillo,
alargada,bordes Bacilo Lactobacillusplantarum
irregulares
redondeada,bordes Coco Oenococcusoeni
regulares
<102cls/ml
52
Tabla3.26.Microorganismosresidualespresentesenlasmuestrasdevinosanalizadas.

MuestraTiempo Microorganismospresentes
(das)

Levaduras Bacterias

Saccharomycescerevisiae Oenococcusoeni
Candidakrusei Lactobacillusplantarum
0

Saccharomycescerevisiae
Oenococcusoeni
40 Brettanomyces/Dekkeras Lactobacillusplantarum
M1
Candidakrusei

0 Saccharomycescerevisiae Oenococcusoeni
Rhodotorulamucilaginosa Lactobacillusplantarum

M2 Rhodotorulamucilaginosa Oenococcusoeni

Rhodotorulamucilaginosa Oenococcusoeni
Rhodotorulaglutinis Lactobacillusplantarum
0
Candidatropicalis

Candidakrusei


M3 Rhodotorulamucilaginosa
40 Oenococcusoeni
Rhodotorulaglutinis
Lactobacillusplantarum
Brettanomyces/Dekkeras

0 Saccharomycescerevisiae Oenococcusoeni
Candidatropicalis Lactobacillusplantarum

M4
Candidatropicalis Oenococcusoeni


53
DISCUSIN
Y
CONCLUSIONES

54
4. DISCUSIN Y CONCLUSIONES
4.1. Discusin
Los anlisis microbiolgicos se realizaron en las muestras de vino tinto una vez embotellado
parasucomercializaciny,alosdosmeses,trasexponerlosalaireparainducireldesarrollode
posibles microorganismos presentes que pudieran desarrollarse durante el periodo de
conservacin.
Se tomaron en consideracin los grupos microbianos ms significativos de levaduras y
bacteriasdesdeelpuntodevistaenolgico.
Rescpetoalaslevaduras,laespecieSaccharomycescerevisiaeeslaprincipalencargadadela
fermentacinalcohlicaaunquesepuedenencontrarespeciesqueprovocan alteraciones en
los vinos, como los gneros Brettanomyces/Dekkeras, Kloeckera, Candida, Metschnikowia,
Rhodotorula.
En cuanto a las bacterias, es habitual encontrar bacterias pertenecientes a los gneros
Lactobacillus,Pediococcus,Oenococcus,LeuconostocyAcetobacter.SiendoOenococcusoeniy
algunas especies del gnero Lactobacillus aptas para realizar el proceso de la fermentacin
malolctica,habitualenlaelaboracindevinostintosy,quetienelugar,unavezterminadala
fermentacinalcohlica.
As pues, se realizaron ensayos para detectar la presencia de poblacin residual de
microorganismos as como la estimacin de poblacin e identificacin de las principales
especiepresentesenlosvinostintossometidosaestudio.
POBLACINRESIDUALDELEVADURAS
La poblacin residual de levaduras aumenta de forma general con el tiempo. De los dos
mediosselectivosempleadosparaeldesarrollodelevaduras,elmayoraumentodepoblacin
sedioenelmedioWickerhamalosdosmesesdeaperturadelasbotellas.
Conlacmaradeairequeseformaenelinteriordelasbotellastrassuaperturasepretenda
potenciar el crecimiento de levaduras pertenecientes al gnero Brettanomyces/Dekkeras. En
los vinos terminados predomin el gnero Saccharomyces mientras que, a los dos meses, el
gnero predominante fue Brettanomyces/Dekkeras. La presencia de oxgeno es un factor
determinante para el crecimiento de este tipo de levaduras, de forma que a los 40 das se
produjoeldesarrollodepoblacindeestegnero.
EnelmediodecultivoDekkeraDiferentialMedium(DDM)lquidohuboproduccindeacidez,
virandoelcolordelostubosentodosloscasos(Tabla3.2.),sinembargo,enlasplacasnose
produjodesarrollodecolonias.Segnlainformacindelaquesedispone,existelaposibilidad
delapresenciadeestaslevadurasaunquenosemanifiestenenelmediodecultivo.
55
EnelvinoterminadolaestimacindepoblacinresidualesmayorenlasmuestrasM10yM30,
alcanzndosepoblacionesde1,7x105y1,3x105cls/mlrespectivamente,laspoblacionesde
M20yM40sondelordende104cls/ml.
Transcurridos dos meses, las poblaciones de levaduras aumentan hasta alcanzar poblaciones
del orden de 105 cls/ml, siendo la estimacin ms elevada en la muestra M440 (7,1 x 105
cls/ml)ylamsbajaenelcasodelamuestraM240(3,6x105cls/ml).
ESPECIESDELEVADURASIDENTIFICADAS
Se identificaron distintos gneros de levaduras en los vinos terminados: Saccharomyces,

CandidayRhodotorula.
EntodaslasmuestrasseprodujocrecimientodelaespecieSaccharomycescerevisiae.Aparte
deestaespecie,enlamuestraM10seidentificlaespecieCandidakrusei,enlamuestraM20la
especie Rhodotorula mucilaginosa, en la muestra M40 la especie Candida tropicalis y en la
muestraM30seidentificRhodotorulaglutinisademsdetodaslasanteriores.
En los vinos guardados en botella con una cmara de aire durante dos meses (t = 40), se
identific el gnero Brettanomyces/Dekkeras en todas las muestras de vino y adems se
identificaron los mismos gneros que en los vinos recin embotellados: Saccharomyces,
Candida y Rhodotorula aunque en algunos casos no se identificaron en las mismas muestras
queenlosvinosterminados.LaespecieSaccharomycescerevisiaetambinsedetectentodas
las muestras. A los cuarenta das, en la muestra M340 no se identific ninguna especie de
Candida, en el resto de muestras se identificaron las mismas especies que en los vinos
terminados.
LamuestraM3presentalamayordiversidaddeespeciesdelevadurasenlosdosmomentos
delmuestreo.
POBLACINRESIDUALDEBACTERIAS
La poblacin residual de bacterias lcticas aument ligeramente con el tiempo, aunque en

ningn caso la poblacin super la carga de 102 cls/ml. La estimacin de poblacin slo se
realizenlamuestraM3yaqueelrecuentodecoloniasfuemuybajoenlosotroscasos.
La poblacin estimada en la muestra M3 fue de 4 x 102 cls/ml tanto en el vino terminado
comoalos40das.
Enningunadelasmuestrasseprodujodesarrollodepoblacionesdebacteriasacticas,nien
losvinosterminadosnialosdosmeses.Aunquenopodemosdescartarlapresenciadeestas
bacterias, ya que su desarrollo en medios de cultivo es muy difcil y que durante la
fermentacin alcohlica la poblacin de levaduras restringe el crecimiento de los principales
gneros, sobre todo Acetobacter y Gluconobacter (Joyeux et al., 1984a, Drysdale and Fleet
1985). Tambin existe interaccin entre la especie Saccharomyces cerevisiae y poblaciones
elevadasdeestasbacteriasdurantelafermentacinalcohlica.Unapoblacinde106cls/ml
56
es suficiente para causar la muerte de S. cerevisiae (Grossmann and Becker 1984). Al haber
identificado esta especie en todas las muestras y al haberse desarrollado la fermentacin
alcohlica correctamente podemos pensar que la poblacin de bacterias acticas no es muy
elevadaoinclusoquenoexistapoblacinresidual.
LasbacteriasacticaspuedeninfluirenlaactividadantimicrobianadelSO2 yaumentarelSO2
total.
ESPECIESDEBACTERIASLCTICASIDENTIFICADAS
Seidentificarondosgnerosdebacteriaslcticas:OenococcusyLactobacillus.Ambosgneros
fueronidentificadosentodaslasmuestrasdevinoterminadoytambinalosdosmeses.
LasespeciesidentificadasfueronOenococcusoeniyLactobacillusplantarum.
EntodaslasmuestraslapresenciadeOenococcusoenidescendiconeltiempo,siendoms
abundanteenlosvinosterminados.LapoblacindeLactobacillusplantarumfuemselevadaa
losdosmeses.
La poblacin residual de levaduras es bastante elevada en todos los casos, identificndose

variosgneroscausantesdealteracionesmicrobianas,ensumayoraoloresdesagradables.
La poblacin de bacterias lcticas no es muy elevada en las muestras aunque las especies
identificadaspuedentambinpuedenproduciroloresdesagradables.
Todaslasespeciesdelevadurasidentificadasyahabansidodescritascomomicroorganismos
residuales presentes en el vino por V. Loureiro y M. MalfeitoFerreira en la publicacin:
Spoilageyeastsinthewineindustry.
Lasespeciesdebacteriaslcticasquesediagnosticaronsehabanencontradopreviamenteen
vinos tintos, en vinos de Rioja, en vinos de Sudfrica y en vinos de Portugal. La publicacin
Performance of malolactic fermentation by inoculation of selected Lactobacillus plantarum
andOenococcusoenistrainsisolatedfromRiojaredwines,fueescritaporI.Lpez,R.Lpez,P.
Santamara,C.TorresyF.RuizLarrea.SelectionandCharacterisationofOenococcusoeniand
LactobacillusplantarumSouthAfricanWineIsolatesforUseasMalolacticFermentationStarter
Cultures fue escrita por E. Lerm, L. Engelbrecht y M. du Toit. Y Genomic diversity of
OenococcusoenifromdifferentwinemakingregionsofPortugal,escritoporAnaPMarques,
AnaJ.Duarte,LliaChambel,MariaF.Teixeira,MariaV.SanRomoyRogrioTenreiro.
4.2. Conclusiones
Podemosconcluirquelasmuestrasanalizadaspresentanespeciesdelevaduraspertenecientes
alosgnerosRhodotorula,Candida,Brettanomyces/DekkerasySaccharomycescerevisiae.
Sepuedeafirmarlainfluenciadeloxgenoeneldesarrollodelaslevaduraspertenecientesal
gneroBrettanomyces/Dekkeras,principalesproductorasdedefectosorganolpticos.
57
En estos vinos estn presentes los gneros de bacterias lcticas Oenococcus y Lactobacillus,
ambosimplicadosenlafermentacinmalolctica.
La poblacin residual de bacterias acticas es muy baja inexistente en las muestras
analizadas.Aunquenopuededescartarseporcompletoydeberanrealizarmsestudiospara
confirmarcompletamentelaausenciadebacteriasacticas
Finalmente, se puede concluir que las muestras de vino analizadas no son
microbiolgicamente estables ya que estn presentes numerosas especies causantes de
enfermedades microbianas y la estimacin de poblacin, sobre todo en el caso de las
levadurasesbastanteelevada.
58

BIBLIOGRAFA

59
5. BIBLIOGRAFA

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60
61

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PROYECTO FIN DE CARRERA

Microbiologa residual en vinos tintos

Beatriz Garcia Azofra

Marta Mara Ins Dizy Soto

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informtica

Proyecto Fin de Carrera

A Seila y a Fernando, cada uno a su forma me han apoyado de forma incondicional, de

Este trabajo es de todos vosotros

1.1.1. El vino y sus orgenes

1.1.2. Produccin mundial de vino

Del total de la recoleccin de la uva la mayora se dedica a produccin vincola

1.1.3. La elaboracin del vino y la microbiologa enolgica

El estrujado va tener dos funciones fundamentales en el proceso de vinificacin: propicia el

pueden llegar a ser peligrosas, ya que se pueden producir paradas en la fermentacin,

Guilliermond fue conocido como el iniciador de la citologa de organismos unicelulares y

1.1.4. Microorganismos residuales

Las levaduras son hongos microscpicos unicelulares, con organizacin eucariotas. Su

Las bacterias lcticas son bacterias Grampositivas, catalasanegativas, no esporuladas e

Se trata de bacterias Gramnegativas, catalasas positivas y oxidasa negativa, no esporuladas,

Se trata de bacterias muy extendidas en la naturaleza, suelen encontrarse sobre substratos

Saccharomyces Mostodeuva Refermentacin,velo

Rhodotorula MostodeUva Velo

Candida/Metschnikowia MostodeUva Velo

Kloeckera/Hanseniaspora Mostodeuva cidovoltil

Cryptococcus Uva Velo

1.1.5. Factores que influyen en el desarrollo de los microorganismos

En el proceso de obtencin de energa estn implicadas reacciones qumicas de xido

La temperatura es un factor determinante para el desarrollo microbiano, siendo la

1.1.6. Medios de cultivo

1.1.7. Estabilidad de los vinos: defectos y enfermedades

Se pueden producir precipitados de tartrato de potasio o clcico, cuando las botellas se

Se da el desarrollo de levaduras por va anaerobia cuando el vino an contiene cantidades

Es un gnero que provoca contaminaciones problemticas, debido a que genera graves

El vino presenta enturbiamientos, cambios de coloracin y burbujas de gas. Se produce en

1.1.8. Regin de TrsosMontes e Alto Douro y sus vinos

1.1.9. Planteamiento de la investigacin

2.1. Equipo de laboratorio empleado

La casa comercial Panreac proporcion: Etanol, peptona, glucosa, verde de bromocresol,

2.4. Muestras de vino

2.5.1. Preparacin de las muestras

2.5.2. Preparacin de los medios de cultivo

2.5.3. Siembra, recuento y aislamiento de colonias.

Habitualmente las muestras que se estudian contienen poblaciones muy elevadas de

2.5.4. Siembra de microorganismos en los medios de cultivo

Se colocan 9 ml del medio lquido en un tubo de ensayo, se aade 1 ml de inculo y se

2.5.5. Procedimiento para la determinacin de presencia de

Para la determinacin de presencia de microorganismos se emplearon medios de cultivo

2.5.6. Recuento de microorganismos y estimacin de poblacin

2.5.8. Tcnicas para la identificacin de microorganismos

2.6. Medios de cultivo

Para la determinacin de presencia y para el recuento de los microorganismos residuales se

2448 h a una temperatura de 25 C y el periodo de incubacin para el tratamiento de

Las botellas se conservaron en posicin horizontal y se homogeneizaron antes de tomar las

3.1. Determinacin Ausencia/Presencia de microorganismos

3.1.2.1. Bacterias lcticas

3.2. Recuento de microorganismos y estimacin de poblacin

En la Tabla 3.5. se muestra el recuento de colonias y la estimacin de poblacin residual de

3.3. Identificacin de microorganismos

3.3.1. Identificacin fisiolgica de levaduras

Algunas cepas de levaduras no pudieron ser identificadas ya que la asimilacin de

3.3.2. Especies de levaduras y poblacin total para las muestras de vino

Muestra Cepas Aspectodelacolonia Formacelular Especie

Muestra Cepas Aspectodelacolonia Formacelular Especie