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PALOTINA - PR
Agosto de 2013
ii
Trabalho de Concluso de
Curso apresentado como
requisito parcial para a
concluso do CURSO DE
GRADUAO EM
TECNOLOGIA EM
BIOTECNOLOGIA
PALOTINA - PR
Agosto de 2013
iii
Fabrcio Carpinejar
iv
AGRADECIMENTOS
Muito obrigada!
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SUMRIO
1 INTRODUO ..................................................................................................................... 7
3 OBJETIVOS.........................................................................................................................19
4 MATERIAL E MTODOS.................................................................................................20
carvo ativado...........................................................................................................................23
isolamento de DNA...................................................................................................................23
5 RESULTADOS E DISCUSSO.........................................................................................24
LAMINAR................................................................................................................................30
6 CONSIDERAES FINAIS..............................................................................................32
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS...............................................................................33
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1 INTRODUO
2 REVISO BIBLIOGRFICA
padro de desenvolvimento in vitro. Baseiam-se nas exigncias das plantas quanto aos
nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender s necessidades especficas nas
condies de cultivo in vitro (CALDAS et al., 1998; TORRES et al., 2001).
Com base nessas exigncias, a composio dos meios de cultura utilizados para a
micropropagao varia entre as espcies e as diferentes etapas do processo (estabelecimento,
multiplicao e enraizamento). De modo geral, so compostos basicamente de macro e
micronutrientes, vitaminas, mio-inositol, sacarose, gua, agentes geleificantes e suplementos
de ferro. Quando necessrio so adicionados outros componentes, tais como reguladores de
crescimento, aminocidos dentre outras substncias (DOODS; ROBERTS, 1995).
O crescimento e desenvolvimento das plantas dependem de sinais internos e externos
que so transportados de uma parte para outra da planta atravs dos hormnios (HINOJOSA,
2000). Essas substncias podem ser produzidas pelas plantas (fitohormnios) ou podem ser
sintticas (fitorreguladores) (HARTMANN et al., 2002). A adio destas substncias
sintticas no meio visa suprir possveis deficincias endgenas de hormnios nos explantes
(GRATTAPAGLIA; MACHADO, 1998). As auxinas e citocininas so os reguladores de
crescimento mais usados na cultura de tecidos. Neste sistema a morfognese regulada pela
disponibilidade e interao dessas classes de reguladores (SKOOG; MILLER, 1957).
Skoog e Miller (1957) demostraram que a reao do tecido in vitro depende do
balano entre auxina e citocinina: aumentando a concentrao de auxina haveria a formao
de razes; aumentando a de citocinina haveria formao de gemas adventcias; e, numa
relao intermediria a formao de calo, o qual considerado um tecido indiferenciado, ou
pouco diferenciado, podendo ser induzido, tornando-se determinado e, finalmente sofrer
diferenciao para formar gemas caulinares ou razes, conforme o balano hormonal
oferecido (SKOOG, MILLER, 1957).
Em vrios tecidos cultivados in vitro, a utilizao de substncias reguladoras de
crescimento tem se mostrado de importncia fundamental para o estabelecimento da
competncia e determinao, necessrias para a formao de meristemas caulinares e/ou
radiculares, condies estas fundamentais para o desenvolvimento da planta.
Hinojosa (2000) define os hormnios vegetais como substncias orgnicas naturais,
ativas em concentraes muito baixas, produzidas em um tecido e transportadas para outro,
onde provocam respostas fisiolgicas. Por outro lado, Grattapaglia e Machado (1998)
explicam que se, em caso de combinaes de hormnios, no houver um balano entre eles,
as concentraes excessivas de auxina, quando utilizadas, podem inibir a multiplicao ou
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3 OBJETIVOS
4 MATERIAL E MTODOS
2,5% (v/v) durante 15 minutos, passando, ento, por triplo enxgue em gua destilada e
autoclavada (Figura 2).
A C
FIGURA 1 A) Escarificao mecnica com lixa N 100 na regio oposta ao embrio B) Frascos de vidro
contendo slica gel e sementes de Peltophorum dubium C) Semente escarificada.
Foi utilizado, como meio de cultivo das sementes, o gar-gua a 0,7% (p/v). As
sementes foram inoculadas em cmara de fluxo laminar, em frascos de vidro com capacidade
para 150 mL, contendo 30 mL de meio previamente autoclavado, por um perodo de 40
minutos a 120C e 1 atm de presso. Em cada frasco foram inoculadas cinco sementes. Aps,
os frascos foram vedados com papel alumnio e dispostos em sala de cultivo, sob fotoperodo
de 16h/8h com escuro , intensidade luminosa de 20mol m-2s-1, fornecida por lmpadas
fluorescentes brancas frias tipo luz do dia e temperatura de 25 3 C.
A B C
FIGURA 2 A) Soluo de etanol a 70% e gua destilada e autoclavada; B) Triplo enxgue em gua destilada e
autoclavada ;C) Inoculao de sementes em meio de cultivo gar-gua a 0,7%.
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5 RESULTADOS E DISCUSSO
Ento,
no material vegetal in vitro. Por isso, os meios nutritivos se baseiam nas exigncias das
plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificaes para atender as
necessidades especficas in vitro (CALDAS et al., 1998) e o estabelecimento de um
meio nutritivo adequado para o material em estudo de fundamental importncia
(SANTOS, 2003).
(Tabela 1, pg. 13). As solues do meio WPM so classificadas como A1, A2, B, C, D, E, F,
G e H.
Para a elaborao de 1000 mL de meio MS so pipetados 10 mL de cada uma das
solues-estoque que so colocados em um Becker. O volume de cada soluo deve ser
retirado com pipeta, para obter uma maior preciso, utilizando-se sempre uma pipeta para
cada frasco, a fim de evitar contaminao das solues. Em balana analtica, so pesados 7 g
L-1 de gar, 30 g L-1de sacarose e 100 mg L-1 de mio-inositol, sendo a sacarose e o mio-
inositol adicionados ao Becker com as solues-estoque. Em seguida, feito o ajuste do
volume, para uma maior preciso, transferindo o contedo do Becker para uma proveta de
1000 mL, onde completa-se o restante com gua destilada. Esse volume pode ser dividido
conforme o nmero e os tratamentos usados. Quando utilizados outros componentes no
meio, como vitaminas ou carvo ativado, a adio feita juntamente com o mio-inositol e a
sacarose, exceto o gar que deve ser colocado por ltimo, somente aps a correo do pH.
Em seguida, o meio nutritivo dividido de acordo com o nmero de tratamentos em
questo e, ento, pode-se acrescentar ao meio nutritivo os fitorreguladores, com auxlio de
micropipetas, pois estes, geralmente, so utilizados em concentraes muito pequenas, na
ordem de microlitros (L). importante que os fitorreguladores sejam guardados no
congelador, desta maneira possuem uma maior durabilidade. Antes de us-los devem ser
descongelados, a temperatura ambiente. O procedimento de preparo do meio WPM
semelhante, adicionando-se apenas outras solues.
Com o meio nutritivo preparado, o pH do meio ajustado. O pH ideal dos meios
nutritivos para cultivo in vitro de espcies arbreas 5,8. Inicialmente, o medidor de pH
deve ser ligado meia hora antes do uso e as solues tampes de pH 4,0 e 7,0 precisam estar
em temperatura ambiente, para ento ser feita a calibragem do aparelho conforme o manual
de instrues. Aps este procedimento o pH pode ser medido e ajustado, inserindo o eletrodo
no meio e aguardar a leitura, se esta no acusar um valor maior que 5,8 utilizado HCl a
1M, j se o pH acusar um valor menor que 5,8 utilizado NaOH a 0,3M, que uma
substncia bsica, portanto elevar o pH. Para homogeneizar a soluo usado um agitador
magntico, que no deve entrar em contato com o eletrodo, visto que este muito frgil e
pode ser danificado quando em movimento com o agitador.
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Por fim, o gar, usado para geleificao do meio, adicionado ao meio nutritivo
aps o ajuste do pH a 5,8. A consistncia do meio depende da concentrao de gar utilizada,
pois ele facilita a difuso dos nutrientes, do meio para o explante. Na sequencia, a soluo
levada ao microondas, para que ocorra o cozimento, em potncia alta por aproximadamente
10 minutos, agitando no tempo intermedirio. O meio estar pronto quando ocorrer uma leve
fervura e o meio apresentar uma cor transparente. Aps a fervura, com o auxilio de um
Becker o meio vertido nos frascos. Em seguida, usado papel alumnio para vedar os
frascos cuidadosamente para que eles no abram durante o processo de autoclavagem.
6 CONSIDERAES FINAIS
7 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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