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1. Definiciones
Transgnico: Organismo(s) con genes de otro organismo. Puede ser tanto vegetal como animal, al
cual se le introduce un gen de otra especie para otorgarle una caracterstica que el organismo
receptor no posea. Es decir, aprovecho las caractersticas de un organismo y se las otorgo a otro
organismo de inters.
La transgnesis comienza a mediados de los aos 90s. En 1994 se lanza al mercado el primer
organismo transgnico que es el tomate larga vida. Hoy en da existen muchos organismos
transgnicos.
A estos organismos le han introducido genes para mejorar numerosas caractersticas, como por
ejemplo para resistir bajas temperaturas de los frigorficos o tener una mayor cantidad de
protenas.
Lo primero que se debe hacer es clonar el gen, es decir, tomo el gen de inters y mediante el
sistema de enzimas de restriccin y ligasas lo introduzco en un vector y ese vector con el gen lo
introduzco en el otro organismo receptor. La clonacin puede ser con enzimas de restriccin, con
un PCR junto a enzimas de restriccin o con los vectores de clonamiento, de manera tal de
obtener muchos plasmidios, los cuales portan el gen de inters en una gran cantidad de bacterias.
Por el contrario, si el gen si se introdujo en el polilinker, el gen Lac Z quedar interrumpido y por
tanto no se expresar, no metabolizndose X-gal y por tanto quedando la colonia de color blanco.
Un segundo sistema de seleccin es el gen de resistencia a la ampicilina (AMP), por lo tanto, luego
de introducirle el plasmidio a la bacteria, por algn mtodo como transformacin o
electroporacin generalmente, las hago crecer en un medio de cultivo con Ampicilina, de manera
tal que las bacterias que crecen son
necesariamente las bacterias que tienen el
plasmidio, el cual puede o no portar el gen
de mi inters.
El paso siguiente es subclonar el gen y ponerlo en un vector de expresin eucarionte, que son
distintos a los de procarionte, porque tiene un protomor eucarionte. A este proceso, introducir
DNA forneo en una clula eucarionte, se llama transfeccin, mientras que lo que hicimos
previamente al clonar, que era introducir DNA forneo en una clula procarionte se llama
transformacin.
3.1. Mtodos para transfectar
3.1.1 Microinyeccin: Se inyecta directamente la clula mirando por el microscopio. Para ello
hay un sistema que sujeta la clula y un sistema inyector muy fino que introduce
directamente el DNA en la clula.
a. Ventaja: Es un mtodo directo de transfeccin
b. Desventajas: Es tedioso, porque a veces necesitamos grandes volmenes de
clulas transfectadas, por tanto, requiere de tiempo. Es por ello que este mtodo
se utiliza para clulas que tienen una alta tasa de divisin, por ejemplo, un
embrin.
3.1.4 Policationes: Se unen al DNA y al igual que el fosfato de calcio van a ser fagocitados. Se
utilizan mucho en la terapia gnica.
a. Desventaja: Los policationes pueden ser un poco txicos, por tanto, se muere un
grupo de clulas que puede ser importante
Hasta el momento habamos visto como incorporar el DNA transgnico a la clula, pero ahora
debemos ver como ese DNA transgnico llega al ncleo para que pueda ser expresado.
En general a lo que uno debe ponerle mayor preocupacin es en elegir el mtodo de tranfeccin
(lo que vimos anteriormente) porque cuando el DNA ya est dentro, de alguna forma ste llega
hasta el ncleo utilizando sistemas propios de la clula.
3.2.1. Vectores retrovirales: Como vimos una forma de transfectar es utilizando virus. Si
se trata de retrovirus estos tienen la particularidad de tener su genoma de RNA y la
transcripatasa reversa lo retrotranscribe a DNA, y este DNA al interactuar con los
complejos de poro es reconocido como material gentico propio e ingresa al ncleo,
incorporndose al DNA de la clula y con ello utilizando la maquinaria de
transcripcin, hasta obtener el producto de nuestro inters.
3.2.3. Liposomas: Como vimos se trata de una doble membrana fosfolipdica circular en
cuyo interior se encuentra el genoma que queremos transfectar. Por tanto, cuando
la clula lo ve lo considera como algo propio, se fusiona con la membrana celular y
llega el DNA al ncleo. Ac dependiendo del vector se va a expresar, porque por
ejemplo podemos tener un vector con un DNA y un promotor eucarionte, por lo cual
para la clula va a ser algo habitual, va a producir un mensajero y posteriormente el
producto de inters.
3.3. El DNA transfectado debe insertarse de forma definitiva en el genoma celular
Ya vimos cmo hacer entrar al DNA forneo y que ste llegue hasta el ncleo, ahora veremos
cmo se inserta de forma definitiva en su genoma para que cuando se divida genera a ms clulas
transgnicas. Para este propsito se utiliza la recombinacin homloga.
Cuando se utiliza este sistema se tiene un gen que es parte de un vector, el cual en sus extremos
tiene una secuencia que es homloga a la secuencia del genoma del organismo, de manera tal que
por homologa se produce la recombinacin o intercambio, incorporando este gen al genoma del
organismo receptor.
Existen sistemas de seleccin para verificar que esta recombinacin se haya llevado a cabo con
xito, porque la idea es que sea una recombinacin dirigida, es decir, utilizando un caso de terapia
gnica yo quiero que el gen defectuoso se intercambie por uno bueno que es el que lleva el vector,
por tanto, luego de la recombinacin, el gen bueno debiese quedar en la misma posicin que
ocupaba el gen original.
Fuera de la secuencia hay un sistema de seleccin negativa, que en este caso es la HSV que es una
enzima de un virus que modifica la accin de ganciclovir (un antiviral), haciendo que las clulas
que tienen el gen presentan toxicidad hacia el ganciclovir.
Entonces tengo dos opciones, que el gen se inserte en el lugar que yo quera (recombinacin
homloga), o que el gen se inserte en cualquier parte (recombinacin heterloga). Si se inserta en
cualquier parte, tambin se va a insertar el segmento que tiene el gen de susceptibilidad al
ganciclovir, por lo tanto, la clula va a presentar toxicidad a este medicamento. En cambio, en
aquellas clulas en las cuales la recombinacin result de la manera correcta, solo queda
incorporado el gen de resistencia a la neomicina y no el gen de la toxicidad al ganciclovir.
Entonces a una clula normal el ganciclovir no le hace nada porque es un medicamento retroviral,
por lo cual no debiese afectar a una clula eucarionte, pero si la clula fue transfectada con el gen
del virus pueden pasar dos cosas: que la clula se muera al aplicar ganciclovir, lo cual quiere decir
que el gen se introdujo en cualquier parte, o que la clula sobreviva al aplicar ganciclovir, lo cual
quiere decir que el gen se introdujo correctamente, siendo ambos grupos resistentes a la
neomicina.
4. Modelos transgnicos
a. Vegetales transgnicos: En el caso de los vegetales desde una clula transgnica se puede
tener toda la planta transgnica, es decir, una clula da origen a todo el organismo planta.
Para generar la clula transgnica se utiliza la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la cual
adems de su genoma tiene un plasmidio denominado Ti al cual se le puede introducir un
gen forneo, entonces esta nueva bacteria (que es una bacteria transformada) se pone en
contacto con la clula vegetal de manera tal que la clula vegetal sea infectada por la
bacteria y adquiera el plasmidio transgnico, obtenindose una clula vegetal
transfectada, la cual se cultiva con los medios de seleccin positivo y negativo para saber
si el gen se introdujo en la posicin correcta, y eventualmente se generar una planta
completa transgnica. Entonces, por ejemplo, el gen que introduje codificaba para un
antgeno X, de manera tal que cuando me coma la planta (en una ensalada) me voy a estar
inmunizando contra el antgeno X.
Se comenzaron a generar estos organismos Knock out clula o tejido especfico, porque los
cientficos que trabajaban con estos animales se dieron cuenta que cuando se perda este gen en
todas sus clulas los animales a veces se moran. Adems de regular el tejido o la clula en la cual
quiero que sea knock out, puedo regular el momento (del desarrollo, por ejemplo) en que quiero
que el animal deje de expresar el gen.
Para lograr esto se utiliza el sistema Cre-LoxP, que consta de dos animales transgnicos, los cuales
se cruzan:
Animal 1: tiene el gen de una protena denominada Recombinasa CRE, que est bajo el mando de
un promotor tejido especfico, por tanto, yo escojo que promotor le pongo a ese gen, por lo cual
se va a expresar solamente en un determinado tejido. Por ejemplo, si quiero un knock out
heptico, pongo al gen bajo el mando de un promotor que solo se enciende en el hgado.
Animal 2: Tiene el gen que me interesa knockear interrumpido por intrones que tienen unos sitios
denominados Lox P.
Entonces, observemos la siguiente imagen: se presente el gen heptico que me interesa knockear
el cual se compone de tres exones y dos intrones, y rodeando al exn dos, el cual es muy
importante para la expresin del gen porque, por ejemplo, podra contener la secuencia para el
sitio cataltico de una enzima, existe un sitio Lox P a cada lado.
A ninguno de los ratones le pasa nada an, ambos son transgnicos, pero expresan la
Recombinasa CRE y el gen heptico respectivamente. Cuando cruzo los ratones obtengo una F1 en
que obtendr ambas cosas en un mismo animal; la expresin de la recombinasa y el Lox P,
obteniendo el Sistema CRE-LoxP. Entonces, lo que hace este sistema es formar un anillo que
contenga el exn dos y junta los sitios Lox P, eliminando lo que est entre los sitios, en este caso el
exn dos (es por esto que se utiliza la recombinasa, ya que recombino los sitios). Gracias a esto se
puede eliminar un exn importante e incluso un gen completo.
Por tanto, en este ratn F1 voy a tener la eliminacin de este gen solamente en el hgado porque
esta protena se expresar exclusivamente en ese rgano.
Adems, puedo tener un sistema Knock out tejido especfico pero temporal porque puede que me
interese estudiar un momento determinado del desarrollo del ratn. Para aquello se utiliza el
mismo Sistema CRE-LoxP, es decir, voy a tener una recombinasa al mando de un promotor
especfico (por ejemplo heptico), pero la diferencia radica en que la recombinasa es inducible, o
sea se va a expresar y posteriormente ingresar al ncleo de la clula, sin embargo no ejercer su
accin si yo no le agrego algo que induzca su activacin, como por ejemplo el Tamoxifeno. El gen
de esta recombinasa inducible se denomina CRE ERT2. Entonces, si tengo a una ratona preada y
le inyecto el Tamoxifeno voy a ver que se va a activar este sistema. De esta manera podemos ver
el efecto de la presencia o ausencia de un gen en un tejido especfico y en un periodo
determinado, lo cual resulta muy importante estudiar durante el desarrollo, en este caso, de un
ratn.
5. Animales transgnicos
Antes de todo lo nombrado en la pgina anterior debo crear un animal transgnico los que
habitualmente se generan utilizando sistemas de microinyeccin en embriones tempranos, como
en la etapa de blastocisto en donde se puede apreciar claramente la masa celular que ser la
encargada de producir el embrin propiamente tal. Por tanto, nosotros inyectamos DNA o una
clula previamente transfectada en esa masa celular y esperamos a que comience a dividirse.
Como nosotros inyectamos una o varias clulas es posible que no todos los tejidos de este animal
tengan el transgen cuando nazca. Posteriormente, cuando inyectemos este embrin en el tero de
una ratona y se desarrolle el individuo completo obtendremos animales llamados quimeras, es
decir, aquellos que tienen algunos tejidos con el transgen y en otros tejidos no, pero lo que se
busca es que est presente en todos los tejidos y sobre todo que estn en las clulas germinales
para que as el ratn herede a su descendencia el transgen.
Luego de esto, voy a tener diferentes quimeras y los voy a cruzar con un ratn normal, hasta que
pueda comprobar que obtuve un animal el cual tenga en todos sus tejidos el transgen pero en
forma heterocigota. Me interesa que est en forma heterocigota porque an no s lo que est
pasando con ese trangen y ha ocurrido que si tengo el transgen en forma homocigota el animal se
muere durante el desarrollo y por tanto no tendr animales transgnicos (de acuerdo a esto
ltimo es importante mantener una reserva de ratones con el transgen en forma heterocigota, ya
que si en algn momento se mueren todos los ratones en estudio contar con la reserva para
poder continuar con el experimento).
Teniendo cierta cantidad de animales heterocigotos para el transgen, algunos los voy cruzando
entre s y debera obtener, de acuerdo a las leyes mendelianas, un cuarto de la descendencia
homocigota para el transgen y ah veo el real afecto del transgen.
Adems:
Hay ratones que son entre transgnicos y KO para modelos de leucemia (tambin hay para otras
patologas). Estos ratones se utilizan para estudiar la biologa de la leucemia al analizar distintos
factores como genes relacionados con la sealizacin, citoesqueleto y trfico celular, proliferacin,
interaccin con el medio ambiente, etc.
Tambin se utilizan cerdos y minicerdos porque el ratn es un buen modelo para estudio gentico,
pero tiene un volumen diferente respecto al humano. En cambio, los cerdos y minicerdos pueden
alcanzar un tamao y un peso bastante ms similar, incluso logrando tener rganos de un volumen
parecido al humano.
Hay modelos de estos animales transgnicos y KO
para enfermedades cardiovasculares,
enfermedades neurodegenerativas, diabetes,
enfermedades inmunolgicas, cncer y para algo
muy importante como el xenotrasplante, es decir,
tomar rganos desarrollados en estos cerdos KO
y trasplantrselos a humanos, como por ejemplo
una vlvula cardaca previamente manipulada
para evitar un rechazo inmunolgico.
Mutagnesis
Mutagnesis significa inducir cambios estables y heredables en el DNA. Cuando hablamos de
mutagnesis habitualmente nos referimos a mutaciones puntuales, es decir, una modificacin de
una o pocas bases y no de un trozo de cromosoma.
1. Mutaciones puntuales
Las mutaciones son de diferentes tipos y van a tener diferentes efectos en la descendencia. En la
mutagnesis nos interesa que la descendencia tambin presente la mutacin.
a. Mutacin somtica: la clula mutada est en un tejido que no es el germinal, por lo tanto la
descendencia de este individuo va a ser normal ya que sus gametos no presentarn la
mutacin.
b. Mutacin germinal: la clula
mutada est inserta en el tejido
germinal, por lo que cabe la
posibilidad que un porcentaje de la
progenie tenga la mutacin.
Recordar que la variabilidad de los
gametos es tan grande por el
crossing over y la permutacin que
existen millones de posibilidades de
gametos, entonces puede que hayan
gametos sin el gen mutado.
3. Para qu mutar un gen?
a. Analizar las consecuencias de los cambios del material gentico (fenotipo). Las
enfermedades humanas ocurren por mutaciones puntuales de un gen, por tanto es mejor
realizar el mismo tipo de mutacin en los modelos de estudio. No sera lo mejor knockear
un gen porque habra menos similitud, adems esto puede resultar demasiado agresivo.
b. La funcin normal de un gen puede ser conocida al perturbarlo o eliminarlo.
c. Se realiza sobre un organismo, clula o un DNA clonado.
4. Tipos de mutagnesis
a. Aleatoria: mutaciones puntuales en cualquier sitio del genoma por agentes mutagnicos
o a travs de PCR utilizando una polimerasa de DNA propensa a errores (error prone)
b. Dirigida: alteracin de un gen o secuencia en vectores. Las sustituciones, inserciones o
deleciones se introducen con la incorporacin de partidores modificados (asociado a
replicacin).
5. Mutagnesis aleatoria
La luz ultravioleta genera mutaciones al azar y la manera en que lo realiza es formando dmeros de
timina (las timinas se unen). Estos dmeros de timina se pueden reparar, pero cuando son muchos
los mecanismos de reparacin se saturan y los dmeros persisten.
Aun as puede ocurrir que durante la
replicacin se leen correctamente y se
les unen las adeninas
correspondientes, no modificando la
secuencia del DNA (abajo a la
izquierda). Sin embargo, s puede verse
afectada la secuencia del DNA al
aparecer unas enzimas susceptibles a
error que en vez de poner una adenina
pone una citosina (abajo a la derecha).
Estas enzimas estn funcionando en
todas las clulas que en ciertas
situaciones siguen replicando a pesar
de haberse equivocado y es por esto
que se postula que son necesarias para
la evolucin al causar variacin en el
genoma.
Tambin generan mutaciones al azar, como por ejemplo el 5-Bromo Uracilo (5-BrU) que tiene una
forma enol y una forma ceto. Cuando est en su forma enol se une a la guanina y cuando est en
forma ceto se une a la adenina. Es un anlogo de base porque se comporta dependiendo del
enlace que establece, ya que puede comportarse como citosina o como timina, pero no es una ni
la otra.
Por ejemplo, en un comienzo tenemos la secuencia normal la que entra en un primer ciclo de
replicacin y este anlogo (B) no es reconocido como extrao por las polimerasas e ingresa a la
secuencia nucleotdica
comportndose como timina.
Posteriormente, despus de
realizado un segundo ciclo de
replicacin el anlogo cambia
su conformacin y se comporta
como citosina. Ya en el tercer
ciclo de replicacin la guanina
que antes estaba unida al
anlogo ahora se une a una
citosina consolidando una
mutacin. Se considera
mutacin cuando en ambas
hebras existe el cambio.
Otro compuesto que genera mutaciones es el
cido nitroso el que produce una desaminacin
de la citosina y la convierte en uracilo, por lo
que se finalmente se unir a una adenina.
El PCR debera copiar exactamente lo que estamos dando como molde, pero podemos generar un
PCR propenso a error, es decir, de baja fidelidad. De baja fidelidad quiere decir que la enzima va a
empezar a poner cualquier cosa.
a. Taq pol sin capacidad editora. Las Taq pol normales s tienen capacidad editora, lo que
quiere decir que cuando avanzan y se equivocan, son capaces de devolverse, arreglar el
error y luego continuar poniendo bases.
b. Mayor concentracin de Mg+2. Adems yo estimulo a que se equivoque al agregarle ms
magnesio teniendo presente que este ion es un cofactor que aumenta la velocidad de la
polimerasa, causando una mayor probabilidad de error.
c. Adicin de Mn+2. Produce el mismo efecto del magnesio, es decir, aumenta la velocidad
de la polimerasa y con ello una mayor probabilidad de error.
d. dNTPs con proporciones diferentes. Al tener la concentracin de nucletidos en
diferentes proporciones, como por ejemplo ms adenina, la polimerasa pondr mayor
cantidad de adenina. Todo esto teniendo presente el aumento en la probabilidad de error
de esta enzima.
Cuando uno hace un PCR la proporcin entre nucletidos es igual, pero si pongo ms
concentracin de un nucletido la polimerasa colocar ms de ese debido a su mayor
disponibilidad.
Existen diferentes formar de generar una mutagnesis sitio dirigida, entre las cuales encontramos:
Si vemos la imagen, en el primer plasmidio puedo generar una mutacin puntual y tengo uno
de los partidores mutado. Entonces, se va a copiar la hebra en la que est actuando el partidor
mutado y tambin se copiar la hebra normal. A consecuencia de la utilizacin de un partidor
mutado, en los siguientes ciclos del PCR van a empezar a aparecer hebras con la mutacin.
Es importante que para
una mutacin puntual
debo colocar partidores
que se superponen y de
esta manera me aseguro
que todo el segmento de
inters se est copiando y
se est generando la
mutacin.
Despus, sea cual sea el tipo de mutacin que se realiz, el plasmidio se recirculariza gracias a
un sistema de ligacin. Este sistema de ligacin consiste en que los partidores utilizados tienen
un extremo fosforilado el que ser reconocido por una ligasa que une los extremos del
plasmidio y lo recirculariza. Posteriormente, con un mtodo de seleccin, podr transformar
bacterias o lo que desee transformar.
b. En la mutagnesis sitio dirigida vamos a tener un plasmidio que viene habitualmente de una
bacteria, entonces nos encontraremos con el problema de que el PCR no ser eficiente y va a
quedar un porcentaje de plasmidio que no sufri la mutacin o que no se amplifica, el que
debemos eliminar para no perjudicar nuestro trabajo.
Una forma de identificar ese porcentaje de plasmidios que no amplific es que los plasmidios
que s replicaron por PCR no van a estar metilados (recordar que las bacterias metilan su DNA,
por tanto, contienen plasmidios metilados)
Entonces, despus de hacer los pasos de PCR realizamos una digestin con una enzima que es
sensible a la metilacin, es decir, va a degradar el DNA que est metilado y como lo nico que
est metilado es el plasmidio original que no fue utilizado, me quedar con el plasmidio que s
tiene la mutacin.
c. Existe un sistema que se llama CRISPR Cas9. Este es un sistema de edicin del genoma y se
puede utilizar en organismos completos, por ejemplo, a nivel embrionario para producir un
organismo que tiene una mutacin.
Se llama CRISPR, lo que significa Repeticiones palindrmicas cortas agrupadas y regularmente
interespaciadas.
Este sistema es derivado del sistema inmune de bacterias y arqueas, es decir, est
encargado de cortar ciertos DNA, pero que fue modificado por la ciencia para dirigirlo a un gen
especfico que se desea mutar. Gracias a esto se pueden hacer genes KO y mutagnesis
secuencia especfica.
Es decir, esto se basa en introducir en una clula dos vectores que llevan un gen de una
enzima llamada Cas9 (encargada de cortar) y un RNA gua (gRNA) que le dir a la enzima a qu
gen tiene que dirigirse. Este gRNA forma una doble hebra con un gen especfico indicndonos
el gen que queremos mutar, knockear, etc.
En la imagen vemos el RNA gua (gRNA) con sus 20 nucletidos unidos al gen y tambin forma
un loop que se une a la enzima. Adems observamos el sitio PAM, el cual comprende el
espacio entre la unin del gRNA al gen y la continuacin de la doble hebra. En el sitio PAM es
donde se realiza el corte.