El rápido descubrimiento de mutaciones nocivas de

novo en el ganado mejora el valor de la ganadería

como especie modelo
Abstracto
En humanos, la caracterización clínica y molecular de los síndromes esporádicos a menudo se ve obstaculizada
por el pequeño número de pacientes y la dificultad en el desarrollo de modelos animales para condiciones
dominantes severas. Aquí mostramos que la disponibilidad de grandes conjuntos de datos de secuencias de
genoma completo, genotipos de chips de SNP de alta densidad y un amplio registro del fenotipo ofrece una
oportunidad sin precedentes para disecar rápidamente la arquitectura genética de las condiciones dominantes
severas en el ganado. Informamos sobre la identificación de siete mutaciones de novo dominantes en CHD7 ,
COL1A1 , COL2A1 , COPA y MITF y explotamos la estructura de las poblaciones de ganado para describir sus
consecuencias clínicas y los loci modificadores de mapas. Además, demostramos que la aparición de defectos
genéticos recesivos se puede controlar mediante la detección de mutaciones de novo nocivas en el genoma de los
toros utilizados para la inseminación artificial. Estos resultados demuestran el atractivo del ganado como una
especie modelo en la era postgenómica, particularmente para confirmar la etiología genética de los informes de
casos clínicos aislados en humanos.

Introducción
Durante siglos, los humanos han aprovechado sus aparentes similitudes con los animales para obtener
información sobre su propia anatomía, fisiología y enfermedades. En la biología moderna, la investigación se
centra principalmente en un número muy limitado de especies (es decir, animales de laboratorio) seleccionadas
por su alta tasa de reproducción, intervalo de pequeña generación y facilidad de manipulación 1 . El estudio de
animales de laboratorio ha mejorado dramáticamente nuestra comprensión de las bases moleculares de varios
fenotipos, y en particular trastornos genéticos humanos, con la caracterización de miles de genes / mutaciones en
los últimos 30 años.

Sin embargo, el uso de animales de laboratorio tiene limitaciones cuando se trata del estudio de ciertas
condiciones dominantes. Por ejemplo, los roedores, que son los mamíferos más comúnmente estudiados, han
experimentado una rápida evolución y muestran una tolerancia inusual a la haploinsuficiencia de los genes del
factor de transcripción 2 . La ausencia de variabilidad genética en cepas endogámicas requiere varias generaciones
de cruzamiento con otras cepas para mapear mutaciones espontáneas de novo . Finalmente, las mutaciones
dominantes más dañinas no se pueden estudiar ya que (i) dan como resultado la muerte de los portadores antes
de que alcancen la madurez sexual y (ii) la prolificidad de los animales de laboratorio a menudo no es lo
suficientemente alta para producir suficientes individuos afectados entre la progenie de padres de mosaico.

La ganadería, como el ganado, tiene el potencial de ser modelos relevantes para estas condiciones dominantes.
El ganado tiene mayor prolificidad efectiva (es decir, mediante el uso de inseminación artificial (IA), los toros
pueden tener miles o decenas de miles de crías), una mayor diversidad genética y una mayor similitud con los
humanos en términos de fisiología, tamaño corporal y longevidad. En el pasado, los costos por animal y la falta
de herramientas genómicas limitaban el valor del ganado como especie modelo. Recientemente ha habido una
rápida acumulación de secuencias de genoma completo (WGS) de toros, datos de genotipo de chips SNP a escala
industrial para evaluaciones genómicas rutinarias (con millones de animales genotipificados) y fenotipificación
completa en grandes genealogías bien registradas (a través del registro de rendimiento de la industria) . Esto
brinda una oportunidad única para acelerar la identificación de mutaciones asociadas con enfermedades
mendelianas en el ganado y hace que el ganado sea una especie modelo atractiva 3 , 4 .
El objetivo de este estudio fue (i) identificar mutaciones de novo nocivas utilizando los datos del WGS como
fuente primaria de información y (ii) llamar la atención de la comunidad científica sobre las oportunidades que
ofrece el modelo de animales bovinos.

Resultados y discusión
Descubrimiento rápido de mutaciones nocivas de novo utilizando datos WGS

Recolectamos muestras de animales afectados y sus parientes sanos por siete condiciones autosómicas
dominantes en cuatro razas de ganado: albino de ojos de vidrio (GEA) y rojo dominante (DR) en ganado Holstein,
neurocristopatía (NC) en ganado Montbéliarde, osteogénesis imperfecta tipo 2 ( OI) en el ganado Fleckvieh, y el
síndrome de ternero bulldog (BD1, BD2 y BD3) en una cruz Charolais X Salers y en dos pedigríes Holstein (Fig.
1 ; para información sobre pedigríes, ver Nota complementaria 1 ).

Figura 1
Breve reseña de las condiciones dominantes estudiadas. Glass-Eyed Albino ( a - d ) los animales se remontan a
una vaquilla mutante nacido en 1994. Las características clínicas incluyen el color del pelaje blanco ( a ), la
sordera y los "ojos de vidrio" ( b ). Reversión fenotípica parcial ...

Secuenciaron el genoma de un animal por condición con una cobertura de nueve a 20,7 veces en los instrumentos
Illumina HiSeq utilizando lecturas de pares apareados (ver Métodos). Llamamos variantes con SAMtools 5 y las
filtramos para retener polimorfismos heterocigóticos que estaban ausentes de 1230 genomas de control 4 (Tabla
1
complementaria) y se predijo que serían perjudiciales para la función de la proteína de acuerdo con las
anotaciones del Predictor del efecto de variante en conjunto 6 . Para cada una de las siete condiciones estudiadas,
la gran cantidad de genomas de control nos permitió disminuir el número de polimorfismos causales candidatos
de millones a una sola mutación (Tabla 1 , Tabla Suplementaria 2 y Figura 1 complementaria).

tabla 1
Resultados de todo el enfoque de secuenciación y filtrado del genoma.

Confirmación de la naturaleza de novo y validación de la causalidad de las mutaciones

candidatas

Se realizaron varios análisis para confirmar la causalidad de las mutaciones candidatas y la fiabilidad de nuestro
enfoque.

Para GEA, DR y NC, aprovechamos los grandes pedigríes de las poblaciones de ganado y mapeamos las
condiciones a intervalos de 1.6, 4.6 y 0.7 Mb, respectivamente, usando la prueba de asociación de casos y
controles con los datos del genotipo Illumina BovineSNP50 (ver Métodos, Tabla Suplementaria 3 ). Extraemos
los datos de WGS de un animal afectado por enfermedad e identificamos solo 3, 4 y 2 pequeñas mutaciones
privadas que eran compatibles con la herencia dominante y que se encontraban dentro de los intervalos asociados
a GEA, DR y NC, respectivamente. Además, realizamos la detección de variante estructural en los datos de
secuencia de animales de casos y controles con Pindel 7 , DELLY 8 y el Visor de Genómica Integral (IGV) 9 , y
no detectamos ninguna mutación candidata adicional dentro de estos intervalos. Luego extraemos Illumina
BovineSNP50 genotipos escalonados de parientes de casos y de la gran base de datos de selección genómica
francesa (231,115 genotipos de bovinos Holstein y 99,044 genotipos de ganado Montbéliarde) para identificar
individuos no afectados portadores de versiones ancestrales de los haplotipos asociados a la enfermedad, es decir,
sin las mutaciones causales. Finalmente, genotipificamos estos individuos control específicos y animales
afectados mediante PCR y secuenciación de Sanger para las mutaciones candidatas. Observamos que solo la
mutación p.R211del en el factor de transcripción asociado a microftalmia (MITF) para GEA, la mutación
p.K594AfsX29 en la proteína 7 de unión a ADN de cromodomain-helicasa (CHD7) para NC y la mutación
p.R160C en la subunidad de complejo de proteína de clotómero alfa (COPA) para DR estaban ausentes de los
animales de control portadores de versiones ancestrales de los haplotipos asociados a la enfermedad. Nuestros
resultados confirman la naturaleza de novo de estas mutaciones y respaldan su causalidad (Tablas
complementarias 4 y 5 ).

Para OI, BD1 y BD2, analizando muestras de ADN extraídas de sangre y semen con secuenciación y / o
pirosecuenciación de Sanger, demostramos que los tres sementales sanos de terneros afectados eran mosaico
germinal y somático para las mutaciones p.A1049_P1050delinsS en colágeno tipo I alpha 1 cadena (COL1A1),
y p.G600D y p.G996S en colágeno tipo II cadena alfa 1 (COL2A1), respectivamente (Figuras complementarias
2 4
- ).

Finalmente, para BD3, secuenciamos los padres no afectados del ternero bulldog y determinamos que entre las
supuestas variantes perjudiciales ausentes de 1230 genomas de control, solo la mutación COL2A1 p.G720S
ocurría de nuevo (Tabla 1 , Fig. 5 complementaria).

Ganado, un modelo animal confiable para estudiar defectos genéticos humanos

Sorprendentemente, los exámenes clínicos mostraron correlaciones genotipo-fenotipo perfectas entre terneros
afectados y pacientes humanos con mutaciones que afectan los mismos dominios de las mismas proteínas (es
decir, para BD1-3 y COL2A1, OI y COL1A1, GEA y MITF, y NC y CHD7), demostrando que el ganado puede
ser un modelo útil para las enfermedades genéticas humanas.

Por ejemplo, COL2A1 codifica la cadena alfa-1 del colágeno tipo II, un colágeno fibrilar que se encuentra en el
cartílago y el humor vítreo del ojo en forma de homotrímeros. En los seres humanos, las mutaciones en este gen
pueden causar hasta 16 afecciones diferentes con herencia recesiva y dominante según su naturaleza y ubicación
( http://www.omim.org/entry/120140 ). Estas condiciones incluyen hipocondrogénesis / acondrogénesis tipo II
(MIM: 200610), un síndrome dominante que muestra una gran similitud con el síndrome de ternero Bulldog (Fig.
2 , Figs. 6 y 7 complementarias). Curiosamente, la hipocondrogénesis / acondrogénesis tipo II está causada por
polimorfismos no sinónimos que (i) interrumpen el motivo estructural Gly-xy esencial para el ensamblaje del
colágeno triple-hélice 10 y (ii) se producen de nuevo o se heredan de los padres mosaicos. Este es exactamente el
caso para las tres mutaciones de BD presentadas en esta memoria y la p.G960R que informamos previamente 4
(figura 2 , figuras complementarias 3 - 5 ). Por lo tanto, informamos cuatro modelos bovinos para
hipocondrogénesis / acondrogénesis humana tipo II. Además, además de los síntomas comúnmente descritos en
humanos, observamos fibrosis hepática en la necropsia en algunos de los terneros afectados (Figuras
Suplementarias 6 y 7 ), lo que apoya la opinión de que la acumulación anormal de colágeno tipo II entre otras
proteínas de la matriz extracelular puede jugar un papel en la fibrosis de órganos 11 .

Figura 2
Los terneros Bulldog muestran correlaciones genotipo-fenotipo perfectas con humanos afectados por
hipocondrogénesis / acondrogénesis tipo II. ( a - h ) Características fenotípicas de un ternero bulldog (aquí el
ternero COL2A1 p.G720S / + BD3) que, al igual que los humanos ...

La forma más severa de osteogénesis imperfecta (OI), es decir, OI tipo II (OMIM 166210) en humanos y en la
progenie del toro Fleckvieh "Halvar PP" se caracteriza por fragilidad ósea, con muchas fracturas pre o perinatales,
severas inclinaciones de huesos largos, desmineralización y alta mortalidad perinatal por insuficiencia respiratoria
(nota complementaria 1 , figura complementaria 8 ). En humanos, el tipo 2 de OI es causado por mutaciones
heterocigotas en el gen COL1A1 (OMIM 120150) o el gen COL1A2 (OMIM 120160). Ambos codifican,
respectivamente, las cadenas pro-alfa1 y pro-alfa2 del colágeno tipo I, un colágeno fibrilar cuya triple hélice
comprende dos cadenas alfa1 y una cadena alfa2 y que es la proteína más abundante en la matriz ósea 12 . Más
del 90% (80/88 variantes para COL1A1 y 44/46 para COL1A2; http://www.uniprot.org/uniprot/P02452 ;
http://www.uniprot.org/uniprot/P08123 accedido 2016/06 / 01) de las mutaciones que causan OI tipo 2 afectan el
motivo estructural Gly-xy típico de estas proteínas, como también es el caso de la mutación COL1A1
p.1049_1050delinsS informada aquí (Fig. 2 complementaria).

Cabe destacar que, al genotipificar siete progenie afectada y 20 no afectadas del padre del mosaico mediante la
secuenciación de Sanger, se encontró un ternero macho asintomático que portaba el alelo mutante (Figuras
complementarias 2 y 9 ). La inspección de los datos de secuenciación en bruto indicó una subrepresentación del
alelo mutante en este animal, posiblemente como resultado del quimerismo. Este fenómeno no es raro en bovinos
donde la tasa de gemelación es de alrededor del 1% y donde las anastomosis entre las placentas de los gemelos
son frecuentes. Dado que el ternero macho nació de un embarazo de gestación único, planteamos la hipótesis de
que (i) pudo haber recibido células sanguíneas de un gemelo que murió durante la gestación o que (ii) podría ser
el resultado de una fusión temprana entre dos embriones. La genotipificación de dos muestras de sangre diferentes
de este animal utilizando una matriz de genotipado de bovinoSNP50 arrojó evidencia de que el ternero sano era
una quimera y proporcionó una explicación molecular a su fenotipo no afectado (Fig. 9 ). Por lo tanto, no solo
informamos la identificación del primer modelo bovino de osteogénesis imperfecta tipo 2 en humanos, sino
también el caso excepcional de un toro mosaico no afectado que engendró una quimera asintomática. Este raro
descubrimiento ilustra aún más el poder de las herramientas y recursos disponibles en el ganado.

GEA, un modelo animal sin igual para el síndrome de Tietz humano

Con el ejemplo de GEA, causado por una mutación dominante en MITF , también podemos demostrar que el
modelo bovino es, en ciertos casos, un mejor modelo que el mouse.

MITF es un factor básico de transcripción de cremallera de leucina hélice-bucle-hélice que actúa como regulador
principal del desarrollo, la función y la supervivencia de los melanocitos 13 . En humanos, las mutaciones en
MITF causan dos síndromes autosómicos dominantes distintos según su tipo y ubicación. Las mutaciones no
truncadoras que afectan la unión de MITF al ADN tienen un efecto negativo dominante con proteínas mutantes
que interfieren con el dominio de unión al ADN de las proteínas de tipo silvestre 14 . Tales mutaciones resultan
en una hipopigmentación tipo albinoide de la piel, el cabello y el iris y la pérdida auditiva severa conocida como
síndrome de Tietz (MIM: 103500). En contraste, otras mutaciones MITF causan el síndrome de Waardenburg
tipo 2A (MIM: 193510) que se caracteriza por despigmentación en parches y sordera unilateral o bilateral.

Hasta donde sabemos, hasta ahora se han informado siete mutaciones no truncadoras del dominio básico MITF
en mamíferos no humanos (Figura 10 complementaria). Mutaciones MITF p.H209R (mitf Mi-enu5 y mitf Mi-bcc2 ),
p.I212N (mitf Mi-wh ), p.R216K (mitf Mi-Or ) y p.R217del (mitf Mi ) en ratón, y p. N310S en el caballo causa una
combinación de manchas blancas, dilución del color del pelaje y, a veces, pérdida de la audición en el estado
heterocigoto, pero no el síndrome de Tietz sensu stricto 15 - 19 . Debido a la tolerancia específica del ratón a la
haploinsuficiencia de los genes del factor de transcripción 2 , solo los animales homocigotos muestran una
despigmentación general de la piel y el cabello que, además, se asocia con otros síntomas. Por el contrario, las
dos mutaciones bovinas p.R210I18 y p.R211del dan como resultado un fenotipo similar al síndrome de Tietz en
heterocigotos. Entre ellos, solo la mutación MITF p.R211del descrita en este estudio es ortóloga a una mutación
observada en humanos, es decir, MITF p.R217del (Fig. 10 suplementaria). Esta última es la mutación MITF más
frecuente observada en pacientes con síndrome de Tietz y a menudo ocurre de nuevo . Su recurrencia podría
deberse a la presencia de una pequeña repetición de triplete de nucleótidos 20 . Curiosamente, en un estudio
reciente, Léger et al . 20 informaron que p.R217del no siempre da como resultado el síndrome de Tietz regular,
sino más bien en una amplia gama de fenotipos con algunos pacientes que muestran máculas de café con leche.
También informaron que las pecas expuestas al sol se observaron con mayor frecuencia en las poblaciones
asiáticas, lo que sugiere una posible interacción con los loci modificadores. Finalmente, Léger et al . 20 resaltaron
la imposibilidad de usar el ratón como modelo para esta enfermedad dadas las diferencias en la transmisión en el
ratón y el ser humano. Por el contrario, la existencia del fenotipo de Tietz regular y del fenotipo de Tietz con
heterocromía irida y parches revertidos (es decir, pequeñas manchas negras) en ganado MITF p.R211del / + (Fig.
1 ; Fig. 11 complementaria) hace que GEA sea un modelo perfecto para investigar la base molecular de la reversión
fenotípica.

Los estudios histológicos y de microscopía electrónica revelaron la presencia de melanocitos en muestras de piel
blanca de ganado MITF p.R211del / + que consiste en células de forma redonda que se sientan en la capa basal
de la epidermis (Fig. 3a-h ). Se observaron gránulos de melanina y melanosomas en la epidermis de los controles,
pero no en muestras de piel blanca de animales MITF p.R211del / +. Finalmente, la ausencia de pigmento se
evidenció en la coroides de los animales afectados frente a los controles (Fig. 3d, e ). Este conjunto de pruebas
confirmó a nivel microscópico la similitud perfecta entre las condiciones humanas y bovinas. Un estudio de
expresión génica mostró que en muestras de piel blanca de animales MITF p.R211del / +, MITF normalmente se
expresaba y que, de acuerdo con la ausencia de síntesis de melanina, los genes diana MITF tales como TYR ,
TYRP1 y DCT se regulaban por disminución ( Fig. 3i ). Curiosamente, la expresión de estos genes se restauró
solo parcialmente en parches revertidos de los mismos individuos en comparación con los controles de tipo
salvaje. Para obtener más información sobre los mecanismos moleculares implicados en esta reversión fenotípica,
extrajimos el ADN genómico y el ARN de biopsias de piel blanca y negra de tres animales MITF p.R211del / +.
La secuenciación de Sanger del ADN genómico extraído de parches de piel blanca y negra no reveló ningún signo
de reversión genética (es decir, de mutación del alelo mutante al tipo salvaje; Fig. 10 complementaria). Además,
se utilizó una prueba de pirosecuenciación para cuantificar la expresión alélica. No se encontraron diferencias en
la proporción de alelos tipo salvaje / mutante entre las muestras de piel blanca y negra de los mismos animales
(Fig. 10 complementaria) que indicaban que ni la reversión genética ni el desequilibrio alélico estaban implicados
en la reversión fenotípica observada. La persistencia de parches revertidos a lo largo de la vida, su ubicación en
áreas del cuerpo ricas en términos de melanocitos y el efecto negativo dominante de esta mutación 14 sugieren
una etiología estocástica en la que los melanoblastos raros que tienen niveles ligeramente más altos de
homodímeros de tipo salvaje se someterían a diferenciación normal. En conclusión, presentamos un modelo de
mamífero sin igual para el síndrome de Tietz humano y la primera investigación del mecanismo molecular
subyacente a los parches revertidos observados en algunos individuos afectados.

figura 3
Análisis histológico y de expresión génica de biopsias de piel de GEA y animales de control. ( a - c ) Secciones
de biopsias de piel de oreja teñidas con hematoxilina-eosina. ( a ) Piel negra de un animal Holstein en blanco y
negro de control. Los melanocitos se encuentran en el ...

Los pedigríes medios-hermanos grandes permiten el mapeo de loci modificadores en síndromes

clínicamente variables

La disponibilidad de pedigríes de medio hermanos grandes y fenotipos recogidos rutinariamente en el ganado

ofrece la oportunidad de explorar aspectos de síndromes clínicamente variables que son difíciles de investigar en
especies menos prolíficas. Un caso ejemplar es el síndrome de CHARGE en humanos que, como NC en ganado
Montbéliarde, es causado por la haploinsuficiencia de CHD7, un remodelador de cromatina dependiente de ATP
esencial para la activación de los componentes centrales de la circuitería transcripcional de la cresta neural 21 .
"CHARGE" es un acrónimo acuñado por Pagon et al . 22 refiriéndose a cinco características cardinales del
síndrome: c oloboma (de los ojos), enfermedad de la arteria , a tresia coanae, crecimiento retardado y retraso en
el desarrollo y / o anomalías del sistema nervioso central, anomalías génitales y / o urinarias, y e anomalías y / o
sordera. Desde entonces, los criterios de diagnóstico han sido reevaluados 23 - 25 ; los pacientes deben tener cuatro
síntomas principales (coloboma ocular, atresia o estenosis coanas, disfunción o anomalía del nervio craneal y
oídos característicos) o tres síntomas principales y al menos tres menores (que incluyen hipoplasia genital, retraso
del desarrollo, malformaciones cardiovasculares, deficiencia de crecimiento, orofacial hendidura, fístula
traqueoesofágica y rasgos faciales distintivos) que se considerará que tienen el síndrome CHARGE. Hasta la
fecha, se han identificado más de cien mutaciones patológicas (incluido el cambio de marco, el sitio de empalme,
el sentido erróneo, el sinsentido y las variaciones estructurales) en todo el gen CHD7. La mayoría de ellos son
privados y ocurrieron de novo , pero también se han reportado algunos casos con mosaicismo germinal y herencia
familiar 26 - 31 . No se ha observado ninguna correlación entre el tipo o ubicación de estas mutaciones y fenotipos,
incluso en grandes cohortes de pacientes, y se han notificado diferentes manifestaciones clínicas en pares padres
/ hijos o hermanos con la misma mutación que sugiere la posible participación de loci modificadores 26 - 31 .

Aquí el análisis de los numerosos descendientes (n = 1058) del toro NC "Etsar" (MONFRAM002528725202),
que es heterocigótico para una mutación del marco de lectura en CHD7 (p.K594AfsX29), nos permitió (i)
observar cada uno de los más comunes síntomas del síndrome CHARGE y (ii) para mejorar nuestro conocimiento
sobre las características clínicas variables que pueden estar asociadas con este defecto genético (Fig. 4 , Nota
Suplementaria 2 , Figuras Suplementarias 12 y 13 y Tablas Suplementarias 6 y 7 ). Además, nos dio una oportunidad
única para mapear loci modificadores que influyen en las características clínicas del síndrome de CHARGE.
Aunque el enfoque habitual es comparar individuos leve y gravemente afectados, la muerte rápida de estos
últimos animales impidió el muestreo de un número suficiente de ellos (n = 7). Por lo tanto, comparamos
frecuencias de haplotipos para ventanas deslizantes de 10 marcadores entre 49 animales levemente afectados y
89 medios hermanos no afectados genotipados con el BovineSNP50 Beadchip de Illumina, usando la prueba
exacta de Fisher para la asociación alélica. Se observó asociación significativa (valor de p empírico de todo el
cromosoma = 0,03) para siete ventanas consecutivas que constituían un haplotipo de 16 marcadores localizado
en el cromosoma 24 bovino (marcador BTB-00883964 con marcador ARS-BFGL-NGS-1731; Chr24:
29,068,445-29,893,427 Fig. 4f ). El segmento asociado estuvo presente en el estado heterocigoto en 24.5%
(12/49) de los animales levemente afectados, 2.2% (2/89) de los medio hermanos no afectados, y en ninguno de
los siete animales severamente afectados. Este enriquecimiento en diez veces en la frecuencia entre los animales
levemente afectados y de control es particularmente llamativo considerando que el primer grupo consiste
aproximadamente del 10% de individuos menos afectados entre los portadores de la mutación del marco de
lectura CHD7 (ver Métodos). Sugiere que este haplotipo tiene un efecto positivo importante en la presentación
clínica del síndrome de CHARGE. Sorprendentemente, la región correspondiente contiene un único gen, CDH2
, que es un objetivo del factor de transcripción CHD7 de acuerdo con el conjunto de datos de objetivos de factor
de transcripción CHEA 32 disponible en el Harmonizome 33 ( http://amp.pharm.mssm.edu/Harmonizome ) .
Además, la inactivación convencional y específica de tejido de CDH2 en ratones ha revelado el papel crítico
desempeñado por este gen en la formación del corazón y del tubo neural 34 - 36 , dos procesos de desarrollo
afectados por la haploinsuficiencia de CHD7. Nuestros resultados apoyan la participación de loci modificador en
la expresión variable del síndrome CHARGE, una hipótesis que nunca se ha confirmado en humanos debido al
número limitado de pacientes que portan la misma mutación.

Figura 4
Un pedigrí grande de medio hermano bovino permite el mapeo de loci modificadores para los síndromes
CHARGE. ( a - e ) Presentación en CHD7 p.K594AfsX29 / + bovino de los diferentes síntomas que dieron lugar
al acrónimo CHARGE en humanos (C-coloboma (de los ojos), H-corazón ...

Las condiciones raras que se producen en el ganado proporcionan modelos interesantes para
la investigación básica

También podemos demostrar que las mutaciones naturales que ocurren en las especies de ganado, como la
sustitución p.R160C en COPA, pueden proporcionar modelos interesantes para la investigación básica.
COPA es una subunidad del complejo proteína I de la cubierta (COPI), que media el transporte retrógrado de
proteínas marcadas con dilisina del cis-Golgi al retículo endoplásmico rugoso (ER) 37 , 38 . Se ha informado que
varias mutaciones que afectan otras subunidades de COPI causan hipopigmentación junto con fenotipos severos
en el pez cebra 39 y el ratón 40 , lo que sugiere una posible participación de este complejo proteico en la
pigmentación.

En un estudio independiente, Dorshorst et al . 41 identificaron la misma mutación candidata para el fenotipo DR

en el ganado Holstein que presentamos en el Congreso Mundial de Genética Aplicada a la Producción Ganadera
celebrado en Vancouver 42 . El enfoque descrito en nuestro estudio demostró definitivamente la naturaleza de
novo y la causalidad de la mutación. El análisis del pigmento capilar 41 , los estudios de expresión y los análisis
histológicos revelaron que la sustitución COPA p.R160C provoca una regulación negativa de los genes
melanogénicos y un cambio hacia la producción de feomelanina en animales que, siendo homocigóticos para un
receptor MC1R constitutivamente activo, deberían producir solamente eumelanina (Figs. 14 y 15 suplementarios).

Poco se sabe sobre las consecuencias clínicas de las mutaciones de COPA en vertebrados. Hasta donde sabemos,
solo cuatro mutaciones se han descrito hasta ahora en humanos 43 (figura 5a ). Todas estas mutaciones están
localizadas en una región particular de la proteína humana, al final de la quinta y al comienzo de la sexta repetición
WD40, y causan un nuevo síndrome dominante con penetrancia incompleta caracterizada por enfermedad
pulmonar mediada por autoinmunidad y artritis. , 44 (es decir, "síndrome de COPA"). Estas mutaciones humanas
no tienen ningún efecto visible sobre la pigmentación del cabello (Anthony Shum, pers.comm), que está en
contraste con la mutación p.R160C bovina, que se encuentra en la cuarta repetición WD40 de COPA. A pesar de
las diferencias en las manifestaciones clínicas y la localización dentro del dominio de repetición WD40 de la
proteína, asumimos que las mutaciones bovina y humana podrían compartir mecanismos patogénicos comunes,
posiblemente asociados con el transporte anormal retrógrado de Golgi a ER de proteínas etiquetadas con dilisina.
Para probar esta hipótesis, volvimos a analizar los datos de secuenciación de ARN producidos por Dorshorst et
al . 41 (Datos suplementarios 1 ).

Figura 5
Caracterización del efecto de la sustitución bovina p.R160C en COPA. ( a ) Información de dominio para COPA
obtenida de la base de datos de UniProt ( http://www.uniprot.org/ ; números de acceso: ...

Sorprendentemente, Ingenuity Pathway Analysis identificó la respuesta de proteína desplegada (UPR) y

ubiquitina proteasoma vía (UPP) como las dos vías canónicas más enriquecidas (P <0.001) entre los genes que
son marcadamente upregulated en la piel de RD frente a ganado Holstein negro (pliegue cambio ≥2; FDR <0.05;
Fig. 5b y Tabla Suplementaria 8 ). El UPR es una respuesta de estrés celular activada en reacción a una
acumulación de proteínas mal plegadas o no en el ER. Notablemente, los estudios en humanos han demostrado
que las variantes de COPA alteran la unión a las proteínas dirigidas para el transporte retrógrado de Golgi a ER
y causan un marcado aumento en el estrés ER en el epitelio pulmonar y los macrófagos alveolares. La UPP es el
mecanismo principal para el catabolismo proteico en el citosol y el núcleo de las células eucarióticas 45 . La
regulación al alza de esta vía, en el contexto de la regulación al alza de la UPR, es consistente con la necesidad
de degradar cantidades aumentadas de proteínas anormales que se han eliminado de la ER para preservar su
homeostasis.

Además, anotamos la función de los genes que se regulan negativamente en la piel de la RD frente al ganado
Holstein negro (cambio de pliegues ≤1, FDR <0,05) usando Enrichr 46 , 47 . Observamos un enriquecimiento
significativo (P <0.05) para cuatro "MGI Mammalian Phenotype Level 3": anexos cutáneos anormales,
morfología cutánea anormal, sistema hepatobiliar anormal y sistema respiratorio anormal (Fig. 5c , Tabla
Suplementaria 9 ). Este último enriquecimiento es particularmente interesante teniendo en cuenta que las
mutaciones de COPA causan enfermedad pulmonar crónica en humanos. Es aún más sorprendente observar que
comprende genes cuya mutación en ratones causa malformaciones pulmonares (por ejemplo, CTGF 48 , NFIB 49
y PDPN 50 ) y genes implicados en la respuesta / inflamación inmune (por ejemplo, IL25 51 , IL33 52 , MMP9 53
y RELB 54 ) Dicha combinación de perturbación general del sistema inmune y desarrollo subnormal de un órgano
específico podría explicar la naturaleza específica de tejido de las manifestaciones autoinmunes observadas en el
síndrome de COPA humano.

Tres genes entre los que están regulados negativamente en muestras de piel de ganado vacuno Holstein frente a
negro llamaron particularmente nuestra atención ( RELB , IL25 y NFIB ). RELB , es el único gen común a los
cuatro Fenotipos de mamíferos mencionados anteriormente. Su pérdida de función en el ratón causa la infiltración
de células inflamatorias en órganos 54 , un hallazgo frecuente en pacientes con trastornos autoinmunes. Además,
Valéro et al . 55 demostraron que la vía defectuosa NF-kappa B / RELB se asoció con una expansión ineficaz de
timocitos y células dendríticas en ratones negros neozelandeses con tendencia autoinmune. IL25 es el segundo
gen más downregulated (fold fold = 0.11) y un regulador clave de las enfermedades inflamatorias y autoinmunes
51
. La regulación negativa de ambos genes RELB e IL25 podría jugar un papel central en la autoinmunidad en
pacientes con síndrome de COPA. Finalmente, hasta donde sabemos, NFIB es el único gen entre 642 genes
expresados diferencialmente (FDR <0.05; Datos Suplementarios 1 ) que potencialmente afecta el desarrollo
pulmonar y la melanogénesis. De hecho, NFIB es esencial para la maduración pulmonar 49 y también controla el
comportamiento de células madre melanocíticas epiteliales 56 . Una regulación a la baja de NFIB (cambio veces
= 0,62; P <0,0001) podría ser la causa principal de la regulación a la baja de ocho genes de queratina del cabello
( KRT17 , KRT25 , KRT35 , KRT71 , KRT73 , KRT74 , KRT79 y KRT85 ; cambio de 0,51 ≤ 0,66 ) y la expresión
diferencial de cinco genes implicados en la melanogénesis ( ATRN que está regulada positivamente con un cambio
en el pliegue de 1.74 y LEF1 , OCA2 , TFAP2A y TYRP1 que están regulados negativamente; 0,36≤ cambio de
pliegue ≤0,73). Curiosamente, el análisis inmunohistoquímico con anticuerpos policlonales de conejo contra
factores de transcripción NFI (es decir, NFIA, NFIB, NFIC y NFIX) reveló diferencias marcadas en términos de
distribución de señal intracelular entre muestras de piel de animales DR (COPA +/-) y animales rojos dominantes
recesivos y negros ( COPA + / +). Este resultado sugiere que, en las células epiteliales de la piel, la mutación
COPA p.R160C afecta no solo a la expresión de NFIB sino también al transporte celular de al menos uno de los
factores de transcripción de NFI (Fig. 5e-h ).

En conclusión, estos resultados requieren un examen clínico completo del ganado COPA +/- y proporcionan vías
interesantes para explorar con el fin de comprender mejor los mecanismos patogénicos asociados con las
mutaciones que afectan a las repeticiones WD40 de COPA.

Detección de mutaciones de novo en la secuencia del genoma de los sementales de élite - hacia
la identificación in silico de defectos genéticos recesivos

Después de identificar mutaciones que causan condiciones dominantes, investigamos la posibilidad de anticipar
la aparición de defectos genéticos recesivos mediante la detección de mutaciones nocivas de novo en el genoma
de toros sanos de IA. Para lograr ese objetivo, seleccionamos los genomas de 43 toros franceses (24 Holstein, 11
Montbéliarde, cinco Normande y tres Charolais) nacidos una o cuatro generaciones antes que la población actual
(ya que los defectos recesivos suelen aparecer en la quinta generación con el primer apareamiento consanguíneo).
entre descendientes de un ancestro común).

Identificamos 18 mutaciones privadas deletéreas, de las cuales se confirmó que siete eran mutaciones de novo
después del genotipo mediante PCR y la secuenciación de Sanger de los toros y varios de sus parientes cercanos
(Methods, Supplementary Table 10 , Supplementary Fig. 16 ).A excepción de FAM189A1 y CSNK1G2 para los
que, hasta donde sabemos, ningún mutante homocigoto se ha descrito en los mamíferos, los otros cinco
mutaciones en el COL6A3 , EDAR , ITGA3, SLC35A3 y SOWAHB , se espera que cause condiciones recesivas
graves que conducen a la letalidad embrionaria, la mortalidad perinatal o la eutanasia de acuerdo con la literatura
(Tabla 10 ).

Como una prueba de concepto, se investigó el efecto putativa de una mutación de desplazamiento en el
ectodysplasin un receptor (EDAR p.P161RfsX97) que se encuentra en el cromosoma paterno del toro Charolais
“Invincible” (CHAFRAM001893105503 nacido en 1993) .Esta es la mutación predicho para dar lugar a un
receptor truncado que carece del dominio de muerte (Fig complementario. 17 ) que es esencial para la interacción
con la proteína EDAR muerte asociada de dominio (EDARADD) y la activación de la señalización aguas abajo
vías de 57 . En los seres humanos, se sabe que las mutaciones en EDAR y en otros miembros de la vía
ectodisplasina (es decir, EDA y EDARADD) para causar displasia ectodérmica anhidrótico 58(AED, MIM:
305100, 129490, 224900, 614940 y 614941), un síndrome caracterizado por hipotricosis (diseminación de pelo),
hipo o un-hidrosis (disminución de la capacidad a sudar), y hipodoncia (ausencia congénita de dientes). Aquí,
nos aprovechamos de la población monta natural Charolais que tiene un intervalo de generación más corto que
los esquemas de selección AI y minado las bases de datos genealógicas apareamientos consanguíneos entre los
descendientes de “Invincible”. Estimamos que se esperaba que 14 de los 344 564 terneros nacidos de raza
Charolais en 2013 para ser mutantes homocigotos. De acuerdo con esta estimación, una encuesta nos permitió
detectar diez becerros, nacido de padres no afectados, y que muestra síntomas de la displasia ectodérmica
anhidrótico (ver Métodos, Fig. 6 y en las figuras complementarias 18 y 19). Es de destacar que los terneros
afectados crecieron cuernos normales que sugieren que la vía ectodysplasin, que desempeña un papel clave en la
diferenciación de los apéndices de la piel en los vertebrados 58 , no está involucrado en la ontogénesis cuerno.
Por lo tanto, estos animales representan un modelo atractivo en la biología evolutiva y del desarrollo. Genotipado
de siete terneras afectadas utilizando la matriz Illumina BovineSNP50 reveló que, en la escala del genoma, que
eran homocigotos para un único haplotipo compartido de 26 Mb en el cromosoma 11, que abarca EDAR.
Genotipado subsiguiente por PCR y secuenciación de Sanger confirmó que estos siete animales también eran
homocigotos para la mutación EDAR p.P161RfsX97. Además, la proyección de la base de datos de la selección
genómica French (8179 animales Charolais) reveló la existencia de tres animales no afectados que también eran
homocigotos para el mismo segmento de 26 Mb IBD pero sólo heterocigotos para la EDAR mutación. Análisis
Pedigree demostró que uno de los haplotipos de estos individuos se puede remonta a Invincible mientras que el
otro haplotipo se originó a partir del padre de Invincible y no directamente de él. Estos resultados confirman la
causalidad de la mutación y validar nuestro enfoque para anticipar la aparición de nuevos trastornos recesivos.

Figura 6
La identificación de un novo mutación que causa la displasia ectodérmica anhidrótico recesiva (AED) antes de la
aparición de este defecto en la población. ( Una ) de un mes de edad del becerro de control. ( B ) un mes de edad
AED ternera afectada mostrando hypotrichosis generalizada. ...

Es importante destacar que esta estrategia se puede adaptar fácilmente para investigar las consecuencias
fenotípicas de novo mutaciones que afectan poco o genes no caracterizados como FAM189A1 y CSNK1G2 y así
mejorar la anotación funcional de los genomas de mamíferos.

Ir:

Conclusión
Hemos demostrado que la disponibilidad de grandes bases de datos en el ganado, combinados con la estructura
típica de las poblaciones de ganado facilitar la rápida detección y caracterización funcional de novo mutaciones
deletéreas. El estudio de las mutaciones subyacentes síndromes esporádicos en el ganado, que también se
producen en los seres humanos, ofrece una alternativa interesante para los animales de laboratorio para confirmar
la etiología genética de los informes de casos clínicos aislados y la obtención de conocimientos sobre los
mecanismos moleculares implicados. Además, el estudio de mutaciones que afectan a los genes mal caracterizado
aumenta el atractivo de ganado y otros animales de granja para anotar sus funciones y convertirse en modelos
para la investigación básica. Finalmente, con el aumento de la secuenciación de los toros jóvenes de élite, la
detección de novo mutaciones deletéreas en sus genomas permitirá la gestión de defectos recesivos en las
poblaciones de ganado antes de que un gran número de terneros afectados emergen.

Ir:
Métodos
Declaración de Ética

Biopsias de la sangre y del oído se recogieron por veterinarios o por técnicos agrícolas autorizados por los
establecimientos de cría departamentales franceses (Etablissements Departamentales de l'Elevage (EDE)) durante
el etiquetado rutinario del oído, el muestreo para la profilaxis anual, pruebas de paternidad y genotipado de los
defectos genéticos o la selección genómica . El semen fue proporcionada por las organizaciones de cría. Todos
los procedimientos invasivos se realizaron post-mortemya sea en animales que habían muerto por causas
naturales, o después de la eutanasia o la masacre de la producción de carne, se requiere por lo tanto hay una
evaluación ética. Todos los animales utilizados en este estudio se mantuvieron de acuerdo con las leyes suizas y
europeas para la producción bovina, y los experimentos reportados en este trabajo cumplen con las normas éticas
del Instituto Nacional de Investigación Agronómica (INRA) y sus socios de investigación participantes en el
presente estudio. Todas las muestras y datos analizados se obtuvieron con el permiso de los criadores, la cría de
organizaciones y contribuyendo grupos de investigación.

Animales, toma de muestras y fenotipificación (todos los estudios)

Los detalles sobre los animales, fenotipos y la recogida de muestras para cada condición y cada análisis se
presentan en la Nota complementaria 1 y en la Tabla Suplementaria 1 .

extracción de ADN (todos los estudios)

ADN genómico fue extraído de sangre, tejidos o esperma utilizando protocolos de extracción estándar. Para la
cuantificación de la dosis alélica en blanco y negro muestras de piel de animales GEA revertientes utilizando la
pirosecuenciación, el ADN genómico fue extraído de cryocuts de biopsias de oreja (sin pelo o cartílago) con el
kit de ADN genómico de tejido Nucleospin (Macherey-Nagel).

Whole Genome Sequencing, lectura de mapas, variante llamada y filtración para las
mutaciones deletéreas privadas heterocigóticos (todos los estudios)

Bibliotecas de gama emparejado con un 250-bp (por BD1, DR, GEA y NC) o un 400-bp (por BD2, OI, y el trío
BD3) insertar tamaño se generaron utilizando la Prep Kit muestra de ADN TruSeq (Illumina; para DR y GEA) o
la NEXTflex PCR-Free Kit de Secuenciación de ADN (Biooscientific; para BD1, BD2, NC, OI, y el trío BD3).
Las bibliotecas se secuenciaron en un carril de Illumina HiSeq. 2000, 2500 o 3000 instrumentos cada uno usando
2 × 101 pb (para BD1, DR, GEA y NC) o 2 × 150 bp-extremo emparejado lee (por BD2, OI, y el trío BD3). Las
lecturas fueron asignadas en la secuencia bovina UMD3.1 conjunto usando BWA-MEM 59 . Lee con se eliminaron
múltiples alineaciones. Duplicados de PCR se filtraron y variantes fueron llamados usando SAMtools rmdup y
PILEUP opciones 5. Sólo variantes con una puntuación de calidad (QUAL) de> = 30 y una calidad de mapeo
(MQ) La puntuación de> = 30 fueron considerados con la excepción de BD2 para los que (QUAL> = 15) se
aplicó un umbral de calidad menos estrictos debido a la cobertura inferior genoma (9 x) en comparación con los
otros defectos. Para cada defecto genético asumimos la mutación causante es dominante y se produjo de novo .
Por lo tanto, sólo conservó polimorfismos heterocigotos que estaban ausentes de los datos de secuenciación del
genoma completo análoga a partir de 1230 animales de control (Tabla 1). Análisis de información de pedigrí,
demostró que ninguno de los animales de control 1230 se desciende de cualquiera de los primeros animales
mutantes para las diferentes condiciones estudiadas. Dentro del genoma de cada animal afectado, variantes
privadas heterocigotos soportados por un solo lectura en cada hebra se eliminaron para evitar posibles artefactos
creados mediante la lectura de dos veces un error presente en un fragmento que muestra un tamaño de inserto que
era demasiado pequeño. SNP y Indeles fueron entonces anotados utilizando Ensembl VEP 6 . Sólo mutaciones
frameshift privadas, en marco inserciones o deleciones, dejan de ganancia o pérdida variantes, se retuvieron los
polimorfismos que afectan donante de empalme o sitios aceptores de corte y empalme, y los polimorfismos de
cambio de sentido deletéreos. La fiabilidad de la anotación se verificó en el genoma navegador UCSC (
http://genome.ucsc.edu/; 10/05/2016 visitada) usando los “genes RefSeq”, “no-vaca RefSeq genes”, “mRNAs
vaca de GenBank” y “ESTs de la vaca que se han empalmado” pistas. Los polimorfismos se predice que afectan
una transcripción que no fue apoyada por la alineación de los ARNm de las especies bovina o genes ortólogos se
consideraron como variantes no codificantes. Por último, para predecir las consecuencias fenotípicas de las
variantes restantes, se realizó una búsqueda de los genes correspondientes en la línea de herencia mendeliana en
el hombre (OMIM; www.omim.org ) y el genoma del ratón Informática (MGI; www.informatics.jax.org ) bases
de datos.

El mismo enfoque se utilizó para detectar mutaciones deletéreas privadas heterocigóticos en los genomas de los
toros de IA saludables para anticipar la aparición de nuevos trastornos recesivos. Para este estudio piloto se
seleccionaron 43 toros utilizados en Francia (para beneficiarse de la red del Observatorio Nacional de Anomalías
de la especie bovina para las verificaciones posteriores francesa; http://www.onab.fr/) Y nacido de una a cuatro
generaciones antes de que los animales actualmente en uso (ya que el apareamiento entre consanguíneos entre
los descendientes de un ancestro común son más probable que ocurra después de la quinta generación). Estos 43
animales consistieron en 24 Holstein, Montbéliarde 11 y cinco toros Normando nacidos en 1996 o después, y tres
toros Charolais nacidos en 1993 o después. Dos generaciones de 6,5 o 7 años y dos generaciones subsiguientes
de 2,5 o 3,5 años fueron considerados para razas lecheras y de carne de vacuno, respectivamente, para dar cuenta
de la reducción del intervalo de generación permitido recientemente por la selección genómica. En un primer
paso, se seleccionaron las variantes deletéreos heterocigotos que se encontraron sólo en uno de los 43 genomas
y no en los otros genomas de control (Tabla 1). Estas variantes deletéreos privadas consiste ya sea (i) en las
mutaciones recientes que se produjeron en los haplotipos que se observan también en su forma original (es decir,
sin estas mutaciones) en otros genomas en el conjunto de datos o (ii) en polimorfismos raros (y
predominantemente antiguos) situado en haplotipos realizadas por un solo animal en el conjunto de datos. Para
discriminar estos dos grupos de variantes, y para reducir lo más posible la proporción de resultados falsos
positivos en nuestra proyección para deletérea de novomutaciones, se calculó el número de mutaciones
particulares en un intervalo de +/- 2,5 Mb alrededor de cada mutación deletérea privado en el genoma de cada
animal portador. Se consideraron arbitrariamente que las variantes deletéreas privados observados en los animales
que tienen 10 mutaciones particulares o menos en los intervalos investigados fueron posibles mutaciones
recientes que se produjeron en los haplotipos no raras. Por lo tanto, sólo conservó estas mutaciones para estudios
posteriores.

Debido a la falta de grandes bases de datos para variaciones estructurales impedido su filtrado eficiente, que no
investigó sistemáticamente estos polimorfismos (que se espera para representar sólo el 1% de la variación
genómica total). Sin embargo, hemos utilizado Pindel 7 , DELLY 8 y IGV 9 para identificar variantes estructurales
en el trío BD3 y en los intervalos de mapeo GEA, DR y NC (ver abajo).

Mapeo de los defectos DR, GEA y NC

Los animales fueron muestreados específicamente de acuerdo a su fenotipo u origen, o se extrajeron de la gran
base de datos nacional francés de genotipos para la selección genómica. Los animales fueron genotipados con el
BovineSNP50 Illumina o EuroG10K BeadChips (detalles en la Tabla Suplementaria 1 ). El EuroG10K BeadChip
es una versión personalizada de la BeadChip v2.0 BovineLD ( https://support.illumina.com/downloads/bovineld-
v2-0-product-files.html ) que comprende el mismo conjunto marcador de núcleo de 7,931 SNP y fluctuante
conjuntos de marcadores adicionales. Todos estos genotipos fueron incluidos en el procedimiento de selección
genómica 60 y se eliminaron y imputado con el software FImpute 61teniendo en cuenta las grandes poblaciones
de referencia de la especie bovina (231.115 Holstein y 99,044 animales Montbéliarde). Para DR, toda la base de
datos francesa Holstein fue investigado para encontrar descendientes de la hembra fundadora Surinam Sheik
Rosabel-RED (HOLCAN000003541221). Los animales homocigotos para el recesivo MC1R e fueron excluidos
alelo rojo. Los genotipos en el locus MC1R se prevé en la evaluación genómica de rutina de acuerdo con la
información basada en haplotipo (Capitan et al , no publicado;. Complementario el cuadro 12 ). Finalmente, la
información fenotípica se pudo recuperar de las empresas de cría francesas para DR 31 y 36 negros descendientes
de Rosabel.

Para cada defecto, se consideraron 43801 marcadores autosómicos que pasaron control de calidad para el
procedimiento actual selección genómica francés. segregaciones fenotípica en las diferentes genealogías se
analizaron y, para cada caso, sólo el haplotipo (materno o paterno) supone que llevar la mutación causal se
conservó. Del mismo modo, para el control, sólo el haplotipo supone que llevar el tipo salvaje fue retenido alelo.
La mutación causante fue asignada mediante la búsqueda de un haplotipo compartido por todos los casos y
ausente o a una baja frecuencia en el grupo de control. Haplotipos se forman por teniendo en cuenta una ventana
de 10 marcadores consecutivos (~ 500 kb) se deslizan sobre todo el genoma.
La detección de variantes candidatos posicionales en los intervalos de mapeo DR, GEA y NC

Se consideraron todas las variantes heterocigóticos privadas que se encuentran en los animales afectados en cada
uno de los intervalos asociados. Además, dado que por razones técnicas variantes estructurales no han sido
investigados en el conjunto completo de datos de secuencias de todo el genoma, se realizó la detección de este
tipo de polimorfismos en los intervalos de asignación DR, GEA y NC para asegurar que no se pierda ninguna
mutación candidato. Se analizaron los genomas de un caso y 20 animales de control por intervalo usando Pindel
7
, DELLY 8 , y el examen visual de las secuencias de todo el genoma con IGV 9Los animales de control fueron
seleccionados en base a sus genotipos para el SNP y pequeñas indeles detectado anteriormente, de acuerdo con
el número de alelos raros compartidos con el caso. El objetivo de esta selección era representar ambos haplotipos
de los animales afectados en el intervalo de mapeo.

Verificación de la de novo naturaleza de las variantes particulares heterocigóticos (todos los

estudios)

Para BD3, la de novo naturaleza de las mutaciones candidatos se confirmó usando conjunto de datos de
secuenciación del genoma de los padres del animal afectado, y la secuenciación PCR y Sanger. Los detalles sobre
los animales y cebadores de PCR usados se presentan en los cuadros suplementarios 1 y 11 respectivamente. Las
reacciones de PCR se realizaron con el Go-Taq Flexi (Promega) según las instrucciones del fabricante en un pro
termociclador Mastercycler (Eppendorf). Los amplicones resultantes se purificaron y secuenciaron
bidireccionalmente por Eurofins MWG (Alemania) usando secuenciación de Sanger convencional.
Polimorfismos fueron detectados con el software NovoSNP 62 .

Para BD1, BD2 y OI, la de novo naturaleza de las mutaciones candidatos se confirmó utilizando PCR y Sanger
de secuenciación en un panel de animales afectados y no afectados, y muestras de ADN extraído de las semen
(por BD2 y OI) y / o la sangre ( para BD1, BD2 y OI) del mosaico sires.For todo otro candidato de novo variantes,
un panel de animales, incluyendo los casos y controles relacionados tanto con los datos de haplotipos Illumina
BovineSNP50 BeadChip ADN y disponible en el banco de ADN genómico de selección francés y base de datos
se genotipo por PCR y secuenciación Sanger. En una primera etapa, la segregación de la putativo de novoalelos
y haplotipos de 100 marcadores (5 Mb) que rodean estas mutaciones se estudiaron entre los descendientes de
putativo primeros animales mutantes. Se identificaron haplotipos que lleva estas mutaciones y, en un segundo
paso, se seleccionaron antepasados de los putativos primo-mutantes. Identificación de los portadores de los
mismos haplotipos idénticos por descendencia pero no de los alelos mutantes se interpretó como una
confirmación de la de novola naturaleza de la mutación. Para DR, ya que estaba disponible en nuestro conjunto
de datos sin antepasado de la primera vaca mutante, que minó la base de datos francesa Selección Genómica para
identificar toros de IA que (i) comparten el mismo haplotipo como animales DR largo de todo el intervalo de DR,
pero que (ii) eran fenotípicamente negro. Entre ellos, JOCKO Besné (HOLFRAM005694028588), que presentó
el haplotipo más largo (intervalo de Chr3: 7,928,589-30,728,145) en común con un animal de DR
(HOLCHEM120093681213), se seleccionó como un control que lleva el mismo haplotipo IBD pero sin la
mutación DR.

Genotipado del pedigrí AED

Siete terneros afectados, así como diez presas y cuatro toros de los terneros afectados fueron genotipo con el
Illumina BovineSNP50 BeadChip. Fases de haplotipos se infiere como se describe anteriormente, utilizando un
conjunto de referencia de 8179 animales Charolais. Un enfoque de mapeo homocigosis 63 , 64 se aplicó para
verificar que los siete casos eran homocigóticos para un segmento de la EII compartida única en sus genomas
que abarca la EDAR mutación del marco. Además, la base de datos Charolais se proyectó para la identificación
de animales sanos que (i) también eran homocigóticos para el mismo segmento de 26 Mb IBD y (ii) descienden
de Invincible en sólo un lado de su pedigrí y de su padre en el otro lado ( el padre de invencible lleva el mismo
haplotipo pero sin la EDARmutacion con desplazamiento de la pauta de lectura). ADN de tres de estos animales,
así como los terneros afectados y sus padres fueron finalmente genotipo para la mutación de desplazamiento de
marco por PCR y secuenciación de Sanger como se describe anteriormente.

Cartografía de loci modificador para síndrome CHARGE bovina (estudio NC)

Debido a la rápida muerte de los animales más gravemente afectados, hemos sido capaces de obtener muestras
de ADN de sólo 7 de ellos. Este bajo número no es lo suficientemente alto como para el mapeo, pero puede
utilizarse para la confirmación. Para mapear loci modificador, hemos utilizado 89 animales no portadores y 49
animales levemente afectados que todavía estaban vivos a la edad de 6 meses. Todos los animales eran
descendientes de la sire NC y de una población presa Montbéliarde pura raza homogénea. Teniendo en cuenta
que la mitad de la progenie de 1.058 este toro lleva la mutación y que determinó su fenotipo y genotipo de la
mayor parte de la progenie todavía vivo en el momento del estudio, estos 49 animales levemente afectados
corresponden aproximadamente con el 10% menos afectado entre los portadores. El método de asignación se
basó en una comparación de las frecuencias de haplotipos entre ambos grupos (levemente afectados vsno
afectados) para ventanas correderas de 10 marcadores consecutivos en todo el genoma. Para el cromosoma 14,
que contiene la mutación del marco de CHD7, sólo se consideraron los haplotipos maternos. Se utilizó la prueba
exacta de Fisher y 10 000 permutaciones se calcularon para determinar los valores de p empíricos de ancho de
cromosomas en todo el genoma y.

Análisis de apareamientos al riesgo y la estimación del número de DEA afectado terneros por
año

El número esperado de los animales afectados se determinó mediante el análisis del pedigrí completa francesa
Charolais (27 millones de animales) usando el software PEDIG 65 . En un primer paso, se identificaron todos los
descendientes del toro “Invincible” y su contribución a sus bancos de genes calculados. A continuación, se
identificaron los terneros nacidos de apareamientos consanguíneos y su riesgo de ser homocigotos para la EDAR
mutación del marco (que se ha producido de novo en Invincible) se calculó como c toro * c presa / 4 (con c toro y c
presasiendo la contribución de Invencible a la reserva genética del padre y la madre de los terneros endogámicas).
Por último, el número de casos afectados por año se estimó mediante la suma de las probabilidades de riesgo para
todos los terneros nacidos endogámicas durante el mismo período.

Los análisis histológicos (estudios de AED, BD3, DR y GEA)

Para los análisis de microscopía óptica, de biopsia de piel, sección del hueso y de los ojos muestras fueron fijadas
en 10% formalina tamponada neutra durante 24 horas y se embebieron en cera de parafina. Secciones (4 m) se
tiñeron con hematoxilina y eosina (HE) o con hematoxilina, eosina y Safran (HES). Pelos muestras de dos toros,
uno rojo dominante (MC1R D / D & DR DR / + ) y uno rojo recesivo (MC1R E / E & DR + / + ), se colocaron en una
gota de lactofenol en un portaobjetos de microscopio y se cubrieron con una hoja de cubierta antes del examen.
Se evaluó el número y la forma (con o sin cola) de los parches de eumelanina en aumento de x 400 en un total de
diez pelos por animal de la muestra en el flanco (n = 5) y en la parte posterior (n = 5). Las fotografías fueron
tomadas con un dispositivo de cámara Nikon.

Para el análisis inmunohistoquímico,, secciones de piel embebidos en parafina fijados con formalina (4 m) de
dominante negro, (MC1R D / D & DR + / +), Los animales, rojo, rojo y dominantes recesivos se montaron en el
mismo portaobjetos y deparaffinised. La recuperación del antígeno se llevó a cabo durante 1 hora en 10 mM de
citrato de sodio pH 6 tampón utilizando una cámara de destape. sitios de unión no específicos se bloquearon por
incubación con 2,5% de suero de caballo (kit ImmPRESS, Vector Laboratories). Las secciones fueron incubadas
con 4 mg / ml de anticuerpo primario durante la noche a 4 ° C (policlonal de conejo anti-NFI (H300), la referencia
sc-5567 Santa Cruz Biotechnology). Después de aclarar con PBS 1 mM (pH 7,5) + 0,05% de Tween 20, los
portaobjetos se incubaron con el anticuerpo secundario (HRP anti-IgG de conejo, kit ImmPRESS, Vector
Laboratories), durante 30 min a temperatura ambiente. La señal se reveló utilizando HRP-Green kit (sistemas
Zytomed), y las diapositivas fueron teñidas con hematoxilina contador.

Para los análisis de microscopía electrónica, las muestras se fijaron con 2% de glutaraldehído, en tampón de
cacodilato de sodio 0,1 M (pH 7,2) durante 4 horas a temperatura ambiente. A continuación, se fijaron
posteriormente con 1% de tetróxido de osmio que contiene 1,5% cyanoferrate potasio, poco a poco se
deshidrataron en etanol (30-100%) y se incluyeron en Epon. Semi-secciones delgadas (500 m) y secciones
delgadas (70 nm) se cortaron con un microtomo. Las secciones finas se recogieron en malla 200 rejillas cooper-
Paladium. Las secciones fueron teñidas con citrato de plomo. Las muestras se examinaron con un microscopio
electrónico Hitachi HT7700 operado a 80 kV. Microfotografías fueron adquiridas con una cámara de dispositivo
de carga acoplada AMT.
El ADN genómico, la extracción total de ARN y preparación de ADNc a partir de biopsias de
piel (estudios DR y GEA)

Tejidos muestras se almacenaron a -80 ° C y cryocuts sin pelo o cartílago se utilizaron para extraer el ADN
genómico y ARN total de biopsias de la piel del oído. El ADN genómico fue purificado utilizando el “ADN
genómico a partir de tejido Nucleospin kit” (Macherey Nagel), después de la homogeneización de 10 mg de
cryocuts en tampón de lisis. Extracción de ARN se realizó con el RNeasy mini kit (Qiagen) para las series de
muestra GEA o con el kit NucleoSpin (Macherey-Nagel) para la serie dominante Red, y control de calidad
comprobado en un Bionanalyzer. Sólo las muestras con un RIN> 6,8 se consideraron. Teniendo en cuenta la
estructura de una sola exón del gen MC1R, un tratamiento de ADNasa con el ADN libre de TMDNA kit de
eliminación (Life Technologies) se realizó en las muestras de la serie VR. muestras de ADNc se prepararon
usando el primer sistema de Superscript III Strand cDNA Synthesis (Life Technologies), con 100 ng a 1 g RNA
total como material de partida, y una mezcla equimolar de oligodT y hexámeros cebadores aleatorios. Finalmente
la concentración de cDNA se midió utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Fischer
Scientific).

Análisis de la expresión génica por (estudios DR y GEA) qRT-PCR

En un volumen final de 20! L, 5 ng de ADNc se mezclaron con 10 l de SYBR Green® Mastermix (Applied
Biosystems) y 300 nM de cebadores directo e inverso. La reacción se programarse en una QuantStudio TM 12 K
Flex sistema de PCR en tiempo real (Life Technologies) como sigue: 50 ° C durante 2 min, 95 ° C 5 min, seguido
de 40 ciclos (95 ° C durante 15 seg y 60 ° C durante 1 min). Las secuencias de cebadores se indican en la Tabla
suplementaria 11 . Para asegurar una cuantificación fiable de las transcripciones en piel bovina, la estabilidad de
tres genes ( RPL32 , GAPDH y β2 - microglobulina) Fue probado en un conjunto de 11 muestras (de dos negro
dominante, recesivo dos rojo y siete animales Holstein rojos dominantes). Su estabilidad de la expresión se
calculó utilizando el software ExpressionSuite (Life Technologies), y RPL32 se consideró como el gen variable
de menos (puntuación de 0,474) en comparación con GAPDH (puntuación de 0,497) y β2 - microglobulina
(puntuación de 0,643). Los transcritos diana fueron cuantificados usando RPL32 como un gen de referencia. La
cuantificación relativa de cada transcrito se calculó con el método ΔΔCt del Software ExpressionSuite (Life
Technologies). Los niveles de expresión del transcrito de transcripciones en uno negro individuo Holstein se
establecen en un valor de 1, y los otros valores de expresión se calcularon en relación a esta referencia.

La cuantificación de la dosis alélica usando pirosecuenciación (estudios BD2 y GEA)

Los cebadores se diseñaron usando el software de diseño de ensayo PyroMark 2,0 (detalles en la Tabla
Suplementaria 11 ). Muestras de PCR fueron producidos usando Kit PyroMark PCR (Qiagen). Se ejecuta fueron
analizados por instrumento PyroMark Q24 (Qiagen). Para GEA, se utilizó una gama de conjuntos de ADN como
una escala con las siguientes proporciones: 0, 25, 33, 50, 66, 75, 90 y 100% del alelo mutante. Estas piscinas se
obtuvieron mediante la mezcla de diferentes cantidades de plásmidos purificados que contienen bien una de tipo
salvaje o un fragmento R217del de MITF.

analiza enriquecimiento conjunto de genes en los datos de secuenciación de ARN (estudio DR)

Los datos de secuenciación de ARN consideradas en nuestros análisis se obtuvieron de Dorshorst et al . 41 y están
disponibles en la siguiente: 10.1371 / journal.pone.0128969.s004 . Brevemente, el ARN fue extraído de muestras
de piel de tres rojo dominante y tres animales negras dominantes. bibliotecas de cDNA se generaron y se
secuenciaron como de extremo emparejado 50 pares de bases lee en una Illumina HiSeq. 2000 instrumento.
Expresión diferencial análisis se realizaron utilizando DESeq. 2 paquete. Para más detalles ver Dorshorst et al .
41
. En este estudio, se utilizó un umbral de FDR <0,05 para evaluar significativos cambios de expresión entre
muestras de piel negro rojos y dominantes dominantes (de datos 1). Anotación taquigráfica se actualiza usando
liberación Ensembl 88 y la información de la UCSC Genome Browser ( http://genome.ucsc.edu/ ; visitada
04/01/2017). Utilizamos los “genes no RefSeq vaca”, “vaca ARNm de GenBank EST” y “vaca que han sido
empalmados” pistas para recuperar el nombre de genes que codifican proteínas que se predice que el código
“proteína desconocida”, según Ensembl. Gene conjunto de enriquecimiento de análisis se llevaron a cabo con dos
paquetes de software que utilizan diferentes métodos y fuentes de información. Para proporcionar una primera
visión de conjunto de los grupos de más de una representación de genes, hemos realizado dos análisis con Enrichr
( http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/ ) 46 , 47utilizando la lista de genes que están regulados por incremento
significativamente (FDR <0,05, doble cambio> 1) y downregulated (FDR <0,05, veces el cambio <1). Nos
centramos en la ontología mamíferos Fenotipo del genoma del ratón Informática (MGI mamíferos Fenotipo Nivel
3 y 4) para obtener información sobre las posibles consecuencias fenotípicas asociadas con la modificación de la
expresión génica en rojo dominante frente a los animales negros dominantes. A continuación realizó dos análisis
con Ingenuity Pathway Analysis ( http://www.ingenuity.com/products/ipa/ ) utilizando dos lista de genes (FDR
<0,05 y doble cambio> 2 o <0,5, respectivamente) para identificar las vías canónicas que son marcadamente
upregulated o downregulated. Los resultados de los análisis de enriquecimiento conjunto de genes se presentan
en los cuadros suplementarios 8 y 9 .

Disponibilidad de datos

Los datos de WGS de 1146 de los 1230 individuos utilizados para el filtrado son parte de los 1000 Bull Genomes
Run 4.0 (Bouwman et al ., Presentado). Los genomas de control restantes se depositaron en el Archivo de
Nucleótidos Europeo (ENA) ( http://www.ebi.ac.uk/ena ) con los números de acceso: PRJEB11962,
PRJEB11963, PRJEB12092, PRJEB12093, PRJEB12094, PRJEB12095, PRJEB14604, PRJEB5435,
PRJEB5965, PRJEB7527, PRJEB7528, PRJEB7707, PRJEB8226 y PRJEB18113. Las secuencias del genoma
de los animales afectados y de Invencible (CHAFRAM001893105503, portador de una mutación de novo en
EDAR) también se depositaron en ENA. Los números de muestra de acceso son: SAMEA104055783 para BD1,
SAMEA3869562 para la DR bull MORSAN AFTERBURN (HOLCANM000009626893), SAMEA3869561
para GEA, SAMEA3869559 para NC y SAMEA3869563 para Invencible en el proyecto PRJEB12703;
SAMEA3706814 para BD3, SAMEA3706815 para el padre y SAMEA3706816 para la presa en el proyecto
PRJEB12092; SAMEA3723253 para OI en el proyecto PRJEB12324; y SAMEA3723308 para BD2 en el
proyecto PRJEB12325.