CRECIMIENTO MICROBIANO DE LA MICROALGA Chlorella vulgaris

1 2
Rueda Pabon Sebastian - 1.121.920.424 , Peralta Galán Edwin – 1.116.790.036 , Piñeros Alemán Juan -
3 4 5
1.121.936.399 , Restrepo Marín Omar – 1.121.916.355 , Bernal Gómez Edwin – 1.121.920.292 ,
Rodríguez Guevara Jessica– 1.121.949.8676, Beltrán Camargo Laura – 1.121.9395717.
Universidad De Los Llanos, Facultad De Ciencias Agropecuarias Y Recursos Naturales, programa de
ingeniería agroindustrial, Curso: biotecnología agroindustrial, Fecha:30/11/2017, email:
yoban.rueda@unillanos.edu.co, Edwin.peralta@unillanos.edu.co

Resumen: Esta especie Chlorella Vulgaris al estar sometido a estrés presenta mayor producción de biomas
en corto plazo debido a las condiciones a las que se somete como la presencia de luz y el movimiento del
agua por medio de burbujeo, con este trabajo se pretende determinar el crecimiento con el propósito de
calcular la velocidad de crecimiento de cultivo, donde la velocidad máxima de crecimiento con el propósito
de calcular la velocidad de crecimiento, dónde la velocidad máxima de crecimiento que obtuvo las
microalgas fue de 0,4044 células por litro respectivamente según el recuento en la cámara de neubauer y
una concentración celular 0,1631 de absorbancia

Palabras Clave: Microorganismos, turbidimetría, conteo de células, Chlorella vulgaris

Introducción
Las micro algas son microorganismos
fotosintéticos procariotas y eucariotas, La Chlorella sp, es un alga verde de forma
capaces de utilizar nutrientes como el esférica alrededor de 2 a 10 micras de
dióxido de carbono (CO2), agua y energía diámetro, la cual crece en forma de células
solar para producir biomasa y se simples perteneciente a la división
consideran interesantes en este contexto Chlorophyta y a la clase de las
ya que poseen un elevado contenido en Chlorophyceae. Hoy en día esta alga se ha
aceites hasta un 60% en peso. 1Además, cultivado de forma intensiva con fines de
pueden crecer alimentación y obtención de metabolitos.
El sistema por lote es el más utilizado a
Extremadamente rápido, entre 10 y 200 gran escala por su bajo riesgo de
veces más rápido que los cultivos contaminación y fácil implementación2
terrestres como la soya viven en
condiciones no muy favorables y se
localizan en hábitats diversos como agua
de mar, agua dulce, agua salobre, aguas
residuales o en el suelo, bajo un amplio
intervalo de temperaturas, pH y
disponibilidad

de nutrientes, debido a su estructura

unicelular o multicelular simple. Tienen
una alta productividad, pues con pequeñas
áreas de cultivo se pudiera abastecer
grandes demandas energéticas.
1RODRIGUEZ, P. Obtención de biomasa de
micro alga chlorella vulgaricus en un banco de
prueba de foto biorreactores de columna de
burbujeo. La Habana-Cuba. 2015. Vol. 73. Pp.
126
2 INFANTE, C; ANGULO, E; ZARATE, A;
FLORES, J; BARRIOS, F; ZAPATA, C.
Propagación de la microalga chlorella sp. en
cultivo por lote: cinética del crecimiento
celular. Revista: Avances en Ciencias e
Ingeniería. vol. 3, núm. 2, abril-junio, 2012, pp.
159-164
1
Turbidimetría
La turbidez producida por el crecimiento
microbiano de microorganismos
unicelulares puede ser medida de acuerdo
con la capacidad de absorber la luz, las
muestras a determinar son generalmente
translúcidas cuando no presentan
crecimiento microbiano.
Esto con el fin de producir biomasa a
partir del crecimiento de esta microalga y
poder aprovecharla como energía que
puede ser utilizada para obtener energía
muchos más limpio y renovable, barata
segura y eficiente.
Dada su mayor producción lipídica y de
biomasa respecto a otras especies,
Chlorella vulgaris resulta idónea para su
explotación como fuente de ácidos grasos
para la producción de biodiesel, 3con una
composición lipídica promedio de 27,8%.
Esta especie es fácilmente adaptable a
diferentes condiciones de cultivo y
sustratos, característica deseable para
cultivos a gran escala, y presenta un corto
ciclo de crecimiento, disminuyendo los
riesgos de contaminación con especies no
deseadas.
La electroforesis es el medio para poder
determinar o aislar biomoléculas que estén
sometidas a una carga eléctrica, Se trata
de una técnica fundamentalmente
analítica, aunque también se puede
realizar con fines preparativos.
Cada molécula se desplaza por efecto del
campo, alcanzando rápidamente una
velocidad constante al equilibrarse la
fuerza impulsora (fuerza del campo
eléctrico) con la resistencia al avance
(fuerza de fricción o rozamiento) impuesta
por el medio en el que se desplaza. Esta
técnica permite separar bastante bien
biomoléculas, donde la cromatografía
líquida se muestra menos eficaz, y
3Montero, Y., Araíz , M. A., Gómez, L. M.,
Hormaza, J. V., Gómez, J., Romero, Cultivo
de micro algas para la producción de
biodiesel, La Habana. 2012
compuestos de pequeña masa molecular,
difíciles de estudiar por los
procedimientos clásicos de electro
migración en soporte.
Por otro lado la forma en la cual se cultivó
el medio fue usando el agar wuxal ya que
con este tipo de agar se han desarrollado
diferentes medios para el cultivo de
microalgas, 4que van desde las fórmulas
para enriquecer el agua de mar natural,
hasta el uso de medios artificiales como
este que permitan resultados constantes en
contraste con los resultados tan variables
que brinda el uso del agua de mar natural
que entre otros factores depende del lugar
donde se colecta ésta, y el tiempo de
almacenamiento de la misma.
Los medios artificiales se usan
principalmente para fines experimentales,
ya que como se ha mencionado, brinda
resultados constantes, aunque existen
algunas especies que no crecen en medios
artificiales por factores desconocidos que
afectan su crecimiento.
MATERIALES Y MÈTODOS
Preparación de materiales
Para la obtención de la biomasa de
Chlorella sp. Se comenzó por obtener una
muestra de 100 ml del cultivo de Chlorella
vulgaris, seguidamente se agregó 900 ml
de agua destilada en un Erlenmeyer, se
puso a esterilizar en autoclave, luego se
adiciono el agar wuxal el cual tenía una
concentración de 2.5 ml por L de H20, por
ultimo se monto en shaker para estimular
el crecimiento de las microalgas.
Preparación cultivo para cinética
celular
Cada recipiente se inoculó con 100ml de
microalgas de una suspensión de un
cultivo puro de la cepa de Chlorella sp con
densidad óptica (D.O) y posteriormente se
incubó a 28ºC en agitación constante en el
4 Deposito de documentos de la FAO
2
shaker a baja velocidad con luz indirecta.
Se midió la absorbancia del cultivo a
560nm identificando la porción de luz que
atraviesa la muestra, utilizando como RECUENTO
blanco un medio estéril para calibrar el EN
DILUCIÓ CAMARA(UC ABSORBANC
espectrofotómetro. La muestra se analizó
N F) IA (nm)
durante 10 días por un periodo de 24 horas
10-1 21 0,0921
con aireación y presencia de luz para
10-2 28 0,0683
favorecer el crecimiento del
10-3 35 0,0584
microrganismo tomando 1 ml y midiendo
su turbidez a 560nm. 10-4 43 0,0421
Tabla2. Datos de la muestra del blanco para curva
patrón
Se representó en una gráfica los valores de
densidad óptica (D.O) obtenidos a lo largo
del tiempo. La curva obtenida fue la curva Tabla3. Datos de absorbancia para curva de
de crecimiento del cultivo. ABSORBANCIA
MEDICIÓN ABSORBANCIA
MUESTRA 1
Preparación de la curva patrón (Dias) BLANCO (nm)
(nm)
Se realizó una recta patrón usando la 1 0,2893 0,1685
cámara de recuento y suspensiones 2 0,2816 0,1791
celulares de D.O. conocida. Utilizando
3 0,2984 0,1845
esta curva patrón, se calculó por
extrapolación del nº de células que 4 0,3116 0,204
corresponden a los valores de 5 0,3481 0,2079
Desmodesmus opoliensis obtenidos en las 6 0,3599 0,2115
lecturas del espectrofotómetro y se graficó 7 0,4004 0,2179
el nº de células en función del tiempo. 8 0,3708 0,2363
9 0,3684 0,2405
Se realizo 4 diluciones seriadas tomando 1 10 0,3588 0,2475
ml de muestra aforarando a 10 ml con crecimiento
agua destilada, añadiendo 1 ml de cada
una de las diluciones y posteriormente se
hicieron mediciones de DO (560nm)
correspondientes para obtener la curva
patrón.

DATOS EXPERIMENTALES. RESULTADOS:

Tabla1. Datos muestra 1 para curva patrón Grafica1. Absorbancia patrón de la muestra 1

RECUENTO
EN ABSORBANCIA
DILU CAMARA(U ABSORBANCI
0.08
CIÓN CF) A (nm) y = 3E-08x + 0.0443
0.06
10-1 19 0,0652 0.04
0.02
10-2 25 0,0512
0
0 200000 400000 600000 800000
10-3 32 0,0457

10-4 40 0,0382

3
Grafica2. Absorbancia patrón de la muestra del blanco Tabla6. Concentración celular muestra 1
Medición Concentración Absorbancia
(día) celular (x) (y) (nm)
ABSORBANCIA (celula/mililitro)
0.1
y = 6E-08x + 0.0548 1 0.3781 0.0245
0.08 2 0.4047 0.2373
0.06
3 0.4068 0.2541
4 0.4084 0.2673
0.04 5 0.4129 0.3038
6 0.4144 0.3156
0.02
7 0.4195 0.3561
0 8 0.4158 0.3265
0 200000 400000 600000 800000 9 0.4155 0.3241
10 0.4143 0.3145
Tabla4. Factor de correlación de muestra 1

Recuento Absorbancia Factor de Grafico3. Densidad óptima muestra 1

(a) corrección
(a-0,0443) DENSIDAD OPTIMA
1 0,2893 0.0245
2 0,2816 0.2373 0.44
3 0,2984 0.2541 0.42
4 0,3116 0.2673 0.4
5 0,3481 0.3038 0.38
6 0,3599 0.3156 0.36
7 0,4004 0.3561 0.34
8 0,3708 0.3265 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
9 0,3684 0.3241
10 0,3588 0.3145

Tabla5. Factor de correlación muestra del blanco Tabla7. Concentración celular de muestra del blanco

Medición Concentración Absorbancia

Recuento Absorbancia Factor de (día) celular (x) (y) (nm)
(a) corrección (celulas/
(a-0,0548) mililitro)
1 0.1685 0.1137
2 0.1791 0.1243 1 0.7642 0.1137
3 0.1845 0.1297 2 0.7655 0.1243
4 0.2040 0.1492 3 0.7662 0.1297
5 0.2079 0.1531 4 0.7686 0.1492
6 0.2115 0.1567 5 0.7691 0.1531
7 0.2179 0.1631 6 0.7696 0.1567
8 0.2363 0.1815 7 0.7703 0.1631
9 0.2405 0.1857 8 0.7727 0.1815
10 0.2475 0.1927 6 9 0.7732 0.1857
10 0.7741 0.1927

Grafico 5. Curva crecimiento muestra vs blanco
CURVA DE CRECIMIENTO.
0.5
ABSORBANCIA
MUESTRA
ABSORBANCIA
0
BLANCO
0 5 10 15
ANÁLISIS DE RESULTADOS:
Imagen1. Microalga observada en el microscopio
La microalga observada en el microscopio
corresponde con las características de la Chlorella
Vulgaris, Infante et al5, presenta coloración verde
de forma esférica y crece en forma de células
simples.
la figura 1 y 2 representa la recta patrón de la
muestra la cual fue sometida a una agitación
constante y exposición a luz solar, de la muestra
que se tenía de blanco fue sometida a luz solar
constante sin agitación. Esta microalga al
momento de la incubación presentaba una
concentración de 624 células/ml y al final de las
mediciones se encontró una producción de 2423
células/ml de la muestra 1 y 1671 células/ml en
nuestro blanco.
En el grafico3 se especifica el crecimiento de la
concentración celular de la microalga Chlorella
Vulgaris con respecto al tiempo a partir de los
resultados de la tabla6. . Donde se consideraría
que la microalga ejerce un crecimiento
exponencial rápido del día uno al día dos fue
rápido el resto de mediciones presentó
5INFANTE, ANGULO, ZARATE, FLOREZ, BARRIOS
y ZAPATA. Op. Cit. p. 159-164
crecimiento tardío y su máximo pico fue el día
siete en el cual tuvo una concentración celular
de 0,4195 y desde ese día se evidenció un
descenso de la concentración celular ya sea
por motivo a la utilización de utensilios
contaminados, mala manipulación, el
sobrenadante presenta unan sedimentación de
color café clara(Imagen3)en la que se puede
deducir por la gráfica 3 que empezó la etapa de
muerte celular tal vez por la presencia de otra
especie de microalga en el mismo medio de
cultivo caracterizándose por tener mayor
tendencia de consumo del sustrato y con esto
mayor crecimiento en el medio.
En el gráfico 4 se observa el crecimiento celular
en su fácil exponencial de forma lenta pero
constante ya que esta muestra estuvo siempre en
contacto con luz solar lo cual permitía un estrés
óptimo para una producción de está
microalga(Imagen2), solo que se produce una
menor cantidad en comparación con la muestra.
En el grafico5. Se muestra la comparación de la
curva de crecimiento de la muestra vs el blanco en
la que se observa es que luego de un determinado
tiempo (7 días) llegó al punto máximo de su fase
exponencial luego ocurre muerte por
contaminación en la que se observó una
sedimentación de color marrón en el fondo del
recipiente. Se observó que al estar en constante
agitación y en contacto con luz solar la producción
de biomasa será mayor y en más corto tiempo que
en el blanco en el cual no contaba con agitación
solo con luz solar directa en la cual mostro un
crecimiento menor pero constante.
Imagen2. Crecimiento microalga blanco
6
 Apéndice:

 Conteo en cámara de……

𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑙 𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

# 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑎𝑑𝑎𝑠
= ( ) 𝑥 𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
𝑓𝑎𝑐𝑡𝑜𝑟 𝑑𝑒 𝑣𝑜𝑙𝑢𝑚𝑒𝑛

Imagen3. Crecimiento microalga muestra 𝐶𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑝𝑜𝑟 𝑚𝑙 𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎

40
= ( ) 𝑥 10−1
6.25𝑥10−6
CONCLUSIONES = 640000
Se diseñó y utilizó un tipo de fotobiorreactor que
permita observar el crecimiento de las microalgas  Coeficiente de corrección:
debido a que estas expulsan una gran cantidad de
partes de nitrógeno y esta concentración de 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑖ó𝑛
nitrógeno ayuda a mejorar la productividad de las = 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎
microalga, así como la de los oligoelementos. El − 0,0443
banco de prueba empleado en exteriores para la 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 1
obtención de biomasa de microalgas de la especie = 0,2893 − 0,0443 = 0,245
Chlorella Vulgaris en el medio puede llegar a ser 𝑐𝑜𝑒𝑓𝑖𝑐𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑐𝑖ó𝑛 𝑒𝑛 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 =
efectivo en su funcionamiento si se toman valores 0,1685 − 0,0548 = 0,1137
de prevención para no contaminar las muestras en  Concentración celular
su proceso de incubación y así mismo se pueden
llegar a obtener valores de densidades celulares 𝑌 = 𝑚𝑥 + 𝑏
similares a las reportadas en la literatura. 𝑦+𝑏
𝑋= 𝑚
𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑒𝑛 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 1
BIBLIOGRAFÍA
0,0245 + 3
= = 0,378
RODRIGUEZ, P. Obtención de biomasa de 08
microalga Chorella Vulgaricus en un banco de
prueba de foto biorreactores de columna de
burbujeo. La Habana-Cuna. Vol. 73. p. 126

INFANTE, C; ANGULO, E; ZARATE, A;

FLORES, J; BARRIOS, F; ZAPATA, C.
Propagación de la microalga chlorella sp. en
cultivo por lote: cinética del crecimiento celular.
Revista: Avances en Ciencias e Ingeniería. vol. 3,
núm. 2, abril-junio, 2012, pp. 159-164

Montero, Y., Araíz , M. A., Gómez, L. M.,

Hormaza, J. V., Gómez, J., Romero, Cultivo de
micro algas para la producción de biodiesel, La
Habana. 2012

6
6