La inducción diferencial de las células madre

meristemáticas de Catharanthus roseus y su

caracterización
 Así Hyun Luna ,
 Jelli Venkatesh ,
 Jae-Woong Yu ,
 Se Won Park,
Mostrar más
http://dx.doi.org/10.1016/j.crvi.2015.05.005
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Abstracto
La tecnología de cultivo de células vegetales se ha introducido para la producción
en masa de los muchos componentes útiles. Una variedad de compuestos
derivados de plantas está siendo utilizado en diversos campos, tales como
productos farmacéuticos, alimentos y cosméticos. Se cree cultivos de células
vegetales que se deriva del proceso de desdiferenciación. En el presente estudio,
una célula meristemática cambial indiferenciado (CMC) de Catharanthus se aísla
usando métodos histológicos y genéticos, y se compara con los cultivos de callos
derivados de desdiferenciación (CDD). Además, se establecieron las condiciones
de cultivo diferencial para ambas líneas celulares derivadas de los CMC y DDCs-
. También se estandarizó un medio adecuado para el aumento de la acumulación
de alcaloides indol terpenoides (AIT). En comparación con los PD, los CMC
mostró marcada acumulación de ataques isquémicos transitorios en líneas de
células cultivadas en medios con 1,5 mg · ml -1 de NAA y 0,5 mg · ml -1 de
kinetina. Cultivos de CMC-deriva Catharanthus , como una fuente de
medicamentos contra el cáncer clave (viblastine y vincristina), sería superar los
obstáculos por lo general asociados con la producción de metabolitos naturales
mediante el uso de los PD. Los sistemas de cultivo de células que se derivan de
los CMC también puede proporcionar una base rentable y ecológico para la
producción sostenible de una serie de productos naturales de plantas importantes.

Palabras clave
 callo ;
 Células meristemáticas del cambium ;
 Catharanthus roseus ;
 desdiferenciación ;
 Terpenoide biosíntesis de alcaloides indol

1. Introducción
Metabolitos secundarios de origen vegetal son una fuente importante de productos
farmacéuticos y se han expandido más allá de sus medios [1] . Metabolitos
secundarios derivados de plantas se han usado para varios otros propósitos, tales
como perfumes, pigmentos, compuestos aromáticos, pesticidas, reguladores del
crecimiento, vitaminas, especias, y enzimas. Muchos de los materiales derivados
de plantas se utilizan para el desarrollo de fármacos, y las investigaciones se
están llevando a cabo para identificar la relación entre la estructura química y la
actividad. Investigación para la producción en masa de tales compuestos está
progresando cada día [2] y [3] . En general, los metabolitos secundarios se
producen en muchas partes de la planta en respuesta al estrés externo. Cerca de
300.000 clases de metabolitos secundarios derivados de las plantas medicinales
se generan en todo el mundo cada año y se extraen y se aislaron a partir de 1.500
especies de plantas. Entre las especies de plantas, 300 especies se estiman para
producir materiales útiles en función de su actividad fisiológica [4] .
Los métodos convencionales de aislamiento de los compuestos de plantas útiles
se están limitados por varios factores. La calidad de los compuestos de plantas
útiles puede tender a variar de acuerdo con las condiciones del entorno y de la
cosecha [5] . Tasa de crecimiento lento y la síntesis de la sustancia
fisiológicamente activa producida en muy pequeñas cantidades [6] y [7] y se
limita a sólo en ciertos órganos como las raíces, hojas y flores limitan aún más el
aislamiento de sustancias útiles a partir de sistemas de la planta [8] y [ 9] . Por lo
tanto, es altamente deseable desarrollar nuevos procesos de desarrollo de
productos apropiados. Estos procesos pueden ser alcanzados por el desarrollo
de in vitro de sistemas de producción en masa, tales como tejido de la planta y las
técnicas de cultivo celular. La producción en masa de metabolitos secundarios es
fiable y casi no está sujeto a la influencia del medio ambiente, y la producción de
productos útiles puede ser posible en un corto período de tiempo [10] y [11] .
Catharanthus contiene alcaloides altamente bioactivos y funcionales, a partir de
los cuales se han aislado e identificado más de 130 [12] . En particular,
metabolitos secundarios farmacológicamente importantes, tales como vinblastina,
vindoline, vincristina, ajmalicina, y catarantina están siendo utilizados en el
tratamiento de la leucemia aguda, linfoma maligno, y la enfermedad de
Hodgkin. La extracción de compuestos bioactivos directamente de partes de la
planta plantean una carga económica debido a un crecimiento muy lento, y el
contenido de compuestos bioactivos están presentes en cantidades muy
pequeñas y sólo se limita a órganos específicos. Debido a su estructura química
compleja, su síntesis química es difícil de obtener. Metabolitos secundarios
importantes de Catharanthus , vinblastina y vincristina están presentes en
cantidades muy pequeñas en la planta (aproximadamente 0,0002% de peso
fresco) [13] . Con el fin de obtener 1 g de vincristina, más de 500 kg
de Catharanthus se requieren, que es comercialmente inviable y constituye una
carga económica. Para superar estos obstáculos, diversos sistemas de cultivo de
célula de planta se utilizan en los estudios de producción y de cultivo de tejidos de
alcaloides, como la cultura hairy root, cultivo en suspensión, y los estudios de
transfección de genes se han realizado [12] , [14] y [15] . La primera
éxito Catharanthus sistema de cultivo de tejidos se informó por Barun [16] ; los
cultivos de callos fueron reportados por Badcock y Carew en 1962 [17] ; y el
cultivo en suspensión fue estudiada por Harris et al. [18] . Sin embargo, tales
técnicas de cultivo de célula de planta, como un sistema de importancia
económica la producción de metabolitos secundarios en Catharanthus , no han
alcanzado el nivel de la producción en masa, sin embargo, y hay una necesidad
para el desarrollo de métodos de cultivo de tejidos sistemáticas para la producción
en masa de importancia económica metabolitos secundarios de Catharanthus .
Una de las desventajas de la utilización de callo o cultivo derivado de los PD es
que las células pueden perder su actividad mitótica después de un período de
cultivo prolongado [19] y [20] , y la producción de materiales comercialmente
importantes es muy variable debido a la inestabilidad genética. Con el fin de
superar estos problemas, mucho recientemente, se informó que el uso de tejidos
no diferenciadas de meristemo planta [21] . Tejidos meristemáticos son la fuente
de las células madre indiferenciadas y producen diversos tipos de células en
proliferación, lo que finalmente genera los diversos tipos de tejidos de las
plantas [22] . Recientemente, un aumento significativo en el conocimiento de los
mecanismos celulares y moleculares que implican meristemos funcionales se ha
visto [23] y [24] . Las células madre vegetales, que están incrustados en los
tejidos meristemáticos, ubicados en las puntas de las raíces, brotes, / o en el
sistema vascular, pueden multiplicarse y dar lugar a una variedad de células que
eventualmente se someten a un proceso de diferenciación y al mismo tiempo
producir nuevas células y madre [25] . El uso de estos tejidos meristemáticos en
las técnicas de cultivo de tejidos evita el proceso de desdiferenciación. Además,
se ha informado de estas células meristemáticas de tener la auto-organización,
mecanismo especial para la prevención de las mutaciones, además de la
capacidad de crecimiento multipotenciales proliferativa e
indeterminado [19] y [20] . Tomando ventaja de características de las células
meristemáticas, como el patrón de forma innata indiferenciada crecimiento, tasa
de crecimiento estable, y la retención de todas las características de la planta
madre sin la mutación, la producción en masa estable de materiales útiles se
puede conseguir fácilmente [21] .
En la presente investigación, el objetivo fue aislar y caracterizar los CMC
de Catharanthus tallo y establecer un cultivo celular estable a partir de CMC en
lugar de a partir de cultivos de tejido de callo convencionales, que se derivan como
consecuencia de desdiferenciación. Se identificaron las características de
crecimiento diferencial de los CMC y los PD y estandarizado el adecuado in
vitro condiciones para su prolongado período de cultivo, y también identificó
parcialmente las condiciones adecuadas para el aumento de la síntesis de los AIT.

2. Materiales y métodos
2.1. Material vegetal
Catharanthus semillas se esterilizaron superficialmente con alcohol etílico al 70%
durante 1 min, seguido de hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min, y se lavaron
5 a 10 veces con agua destilada esterilizada, y luego las semillas se secaron al
aire sobre papel de filtro limpio. Las semillas se cultivaron en medio de Murashige
Skoog (MS) medio con agar agar 0,65%; pH se ajustó a 5,8 antes de la
esterilización en autoclave. Después de la inoculación, los cultivos de semillas se
mantuvieron bajo condiciones de oscuridad de alrededor de 3 a 5 días para la
inducción de la germinación. Después de la germinación de semillas, cultivos se
mantuvieron bajo el período de luz de 16 horas y a una temperatura de 25 ° C.

2.2. Aislamiento de células madre meristemáticas

Se obtuvieron células meristemáticas de 30 días de edad in vitro plantas de
semillero de Catharanthus tallos. Disecamos suavemente
los Catharanthus segmentos madre obtenidas de los in vitro plántulas utilizando
pincette y cuchillas (Nº 11) esterilizado. Las muestras aisladas de tejidos
contenían tejidos de la epidermis, endodermis, floema, xilema, cambium, corteza y
médula. Xylem y el tejido de médula se eliminaron suavemente, y la ausencia de
los tejidos del xilema y la médula se confirmó mediante la tinción de los tejidos con
floroglucinol-HCl, donde la deposición de lignina fue detectado por el desarrollo de
un color rojo ( Fig. 1 A).

Higo. 1.
Comparación de las morfologías de las células del cambium meristemáticas (CMC) y
desdiferenciación derivados de callo (PD) en diferentes etapas de inducción y la
regeneración. A. Cruz y secciones longitudinales de Catharanthus de tallo teñidas con
colorante específico xilema y la médula, phlorogluciol-HCl se observa bajo el microscopio
oscuro presentada (Eclipse 80i, Nikon, Japón). B. Las células meristemáticas aislada
cambium cultivadas en medios de inducción. C. El crecimiento de los CMC después de 7
días de inducción. D. Crecimiento de CMC después de 10 días de inducción. E. Iniciación
de los PD después de 15 días de inducción (márgenes de color amarillo oscuro que se
indican con marcas de flecha). F. El crecimiento de los CMC (marca de flecha arriba) y PD
(marca de la flecha inferior) después de 30 días de inducción, donde los CMC y los PD
 eran claramente distinguibles. Se observaron los tejidos bajo un microscopio
estereoscópico (SZX12, Olympus, Japón). Para la interpretación de las referencias a color
en esta leyenda de la figura, se remite al lector a la versión en línea de este artículo.
Figura opciones

2.3. la inducción diferencial de CMC y los PD

Los tejidos aislados se transfirieron a medio de inducción diferencial que contiene
sales de Gamborg B5 y vitaminas (Duchefa, Países Bajos) (3,16 g · L -1 ), sacarosa
(30 g · L -1), agar agar (6,5 g · L -1 ), y diferentes combinaciones de NAA y cinetina
( Fig. 1 B, Tabla 1 ); el pH del medio se ajustó a 5,7. El medio se sometió a
autoclave a 121 ° C durante 15 min. Los cultivos se mantuvieron en condiciones
de oscuridad, y en intervalos regulares se observaron cultivos de inducciones
diferenciales de los CMC y los PD en diferentes medios de inducción. Después de
la inducción diferencial, CMC y DDC se separaron y se cultivaron en medios
adecuados. Los cultivos se mantuvieron a 25 ° C en condiciones de oscuridad y se
subcultivaron cada 2 semanas.
Tabla 1.
La combinación de NAA y cinetina utilizado (T1-T16) en las Catharanthus cultivos
celulares.
Kinetina (mg · L -1 )

NAA (mg · L -1 )
0,5 1 1.5 2
0,5 T1 T2 T3 T4
1 T5 T6 T7 T8
1.5 T9 T10 T11 T12
2 T13 T14 T15 T16
opciones de la tabla

2.4. La observación histológica

Las observaciones histológicas se realizaron utilizando la luz y microscopía
confocal. Para los estudios histológicos con el microscopio óptico, se utilizó la
sección de parafina. Los pasos de la técnica de bloque de parafina incluyen la
fijación, deshidratación, y la inclusión en parafina; tejidos 30 días de edad, de
CMC y DDC se fijaron con una solución que contiene formalina ácido-alcohol
acético (FAA), 10% de formalina, 5% de ácido acético glacial, y 50% de alcohol
etílico. Las muestras se incubaron durante 16 horas a 4 ° C, y después se lavaron
con alcohol etílico 95%. Para la deshidratación, los tejidos se trataron con una
serie de soluciones que contienen diferentes concentraciones de alcohol etílico y
de alcohol butílico terciario (TBA). Las muestras se incubaron durante 60 min en
una solución que contiene 50% de alcohol etílico (95%) y 10% de TBA, 60 min en
una solución que contiene 50% de alcohol etílico (95%) y 20% de TBA, 60 min en
una solución que contiene 50% de acetato de alcohol (95%) y 35% de TBA, dos
veces durante 60 min en una solución que contiene 50% de alcohol etílico (100%)
y 50% de TBA, y 60 min en una solución que contiene 25% de alcohol etílico
(100%) y 75% TBA . Finalmente, las muestras se deshidrataron completamente
por incubación en 100% TBA durante 60 minutos dos veces. Para la incrustación
de tejidos, las muestras de tejido en el TBA se cambiaron a un horno (60 ° C), y
luego se añadieron paraplast (instrumentos de Leica, Alemania) en una cantidad
igual a la de TBA. Después de la fusión de la paraplast, TBA se le permitió a
volatilizarse. Después de la volatilización de TBA, los tejidos se trataron con
disolvente de parafina fresco dos veces durante 1 h en 60 ° C. Los tejidos
embebidos en cera de parafina se seccionaron a continuación, con el micrótomo
rotatorio (instrumentos de Leica, Alemania) y se cortaron en 5 a 10 micras-
secciones delgadas. cintas de tejido fueron montados en portaobjetos de vidrio,
manteniéndolos en una diapositiva más caliente (a 45 ° C). Las placas de vidrio se
secaron y se almacenaron en una caja de portaobjetos.
Para las observaciones morfológicas generales por microscopía de luz, las
secciones fueron teñidas con floroglucinol-HCl y 0,1% de azul de toluidina para la
comparación de los CMC y los PD. La técnica de tinción incluido desparafinación,
rehidratación, las manchas y la deshidratación, y la limpieza. Los portaobjetos se
desparafinaron en xileno durante 10 min, y esto se repitió tres veces. Las
muestras se rehidrataron en serie de etanol (100% a 30%), y se tiñeron en azul de
toluidina al 0,1%, y floroglucinol con HCl 20% durante 1 h, y luego se lavan en
agua para eliminar el exceso de tinte. Las diapositivas fueron deshidratados en
etanol y se montaron con bálsamo de Canadá para su análisis.
Utilizamos los CMC frescas y los PD para el estudio de microscopía de
fluorescencia; las imágenes de fluorescencia de muestras de plantas fueron
capturadas con un microscopio confocal de barrido láser (Olympus Fluoview
FV1000 versión 2.0) y FV10-ASW 2.0 del software espectador. Se recogieron las
emisiones de fluorescencia usando un láser Ar-ion, la señal de fluorescencia verde
a 488 nm (30 mW) y un láser de He-Ne, la señal de fluorescencia amarilla a 543
nm (1 mW), y una señal de fluorescencia roja a 633 nm (10 mW) de iluminación. El
agujero de alfiler se utiliza en el sistema de formación de imágenes con un z modo
-scan para que las imágenes de las diferentes capas, y se recogieron las pilas de
imágenes cada 2 m a lo largo del z eje x.

2.5. Análisis de la expresión de la biosíntesis de los AIT y los genes regulados por
el desarrollo
2.5.1. aislamiento total de ARN y síntesis de ADNc
Catharanthus se recogieron las células meristemáticas de 10-días-, 30-días-, y 50
días de edad in vitro en cultivos desarrollados. Cuatro muestras de tejido se
obtuvieron de cada uno de la CMC y PD, que se mantuvieron en sus respectivos
medios de comunicación. El ARN total se aisló usando el kit de aislamiento de
ARN planta RBC siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y
pureza del ARN se midieron con un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000
(NanoDrop Technologies, EE.UU.). La integridad del ARN se comprobó mediante
electroforesis en gel de formaldehído. Seiscientos nanogramos de ARN total fue
utilizado para la transcripción inversa con un guión Rocket RT kit de premezcla
(Bioneer, Corea del Sur). Primera hebra de síntesis de ADNc se llevó a cabo en un
volumen final de mezcla de reacción de 20 l utilizando oligo-dT cebador (20 mer)
de acuerdo con el protocolo del fabricante. la síntesis de ADNc se realizó a 30 ° C
durante 1 min, a 60 ° C durante 1 h, y a 95 ° C durante 5 min. El cDNA se diluyó
dos veces con agua libre de nucleasa y se almacenó a -20 ° C hasta que la PCR
(qRT-PCR) cuantitativa experimento de transcripción inversa.

2.5.2. QRT-PCR análisis de los CMC y los PD

Para la determinación de patrones de expresión de floema intercalado con
xilema ( PXY ) y 4 relacionadas Homeobox Wuscehl ( WOX4 ) genes, que son
conocidos por estar involucrados en la proliferación de células madre procambial /
cambial, que se identificaron mediante búsquedas BLAST con Arabidopsis PXY (
NM_125541) y WOX4 (AY251396) los genes en contra de la Planta Medicinal
Genómica de recursos ( http://medicinalplantgenomics.msu.edu/ ). Para conocer la
actividad de los genes de la ruta de biosíntesis de AIT, tales como descarboxilasa
triptófano ( TDC ), geraniol 10-hidroxilasa ( G10H ), stritosidine
sintasa ( STR ), desacetoxyvindole 4-hidroxilasa ( D4H ), y acetil-CoA: 4-O-
deacetylvindoline ( DAT ) [26] y [27] , el análisis de QRT-PCR se llevó a cabo en
cultivos de Catharanthus células.
cebadores QRT-PCR para PXY , WOX4 , TDC , G10H , STR , D4H , y DAT genes
fueron diseñados utilizando el programa de software Primer 3
( http://frodo.wi.mit.edu/primer3/ ) con los parámetros por defecto. Los cebadores
utilizados en el presente estudio se enumeran en la Tabla 2 . Factor de
elongación-1-alfa ( EF1a ) se utilizó como control interno. Con el fin de comprobar
la especificidad cebadores, la PCR se llevó a cabo regularmente, y los productos
se analizaron por electroforesis en 1.5% geles de agarosa. Además, la
especificidad de los cebadores se verificó mediante un análisis de curva de
fusión. La reacción QRT-PCR se realizó en las siguientes condiciones; 2 min a 50
° C, 10 min a 95 ° C, y 40 ciclos de 15 s a 95 ° C y 1 min a 62 ° C en Bio-Rad CFX
96 sistema en tiempo real (Bio-Rad, EE.UU.). El volumen final para todas las
reacciones de QRT-PCR fue de 25 l, y cada mezcla de reacción incluyó 12,5 l de
2X estrella verde qPCR mezcla maestra (Bioneer, Corea del Sur), 2 l de mezcla de
imprimación (10 pm cada uno), 2 l de diluirse ADNc, y 8,5 l de agua DEPC.
Tabla 2.
QRT-PCR primers utilizados en la presente investigación.
El
Bas tamañ
nombre es o del
de de amplic
imprima dato ón
ción Adhesión s secuencia del cebador (pb)
EF1a-F EU007436 NCB TCAGGAGGCTCTTCCTGG 115
I TGA
EF1a-R AGCTCCCTTGGCAGGGTC
AT
PXY-F cra_locus_6307_iso_1_len_ MP TGATAAGCCAGGAGGGAA 161
3407_ver_3 GR T
PXY-R TCCCGCCTGATTTCAGAT
AC
 El
Bas tamañ
nombre es o del
de de amplic
imprima dato ón
ción Adhesión s secuencia del cebador (pb)
WOX4- cra_locus_8377_iso_1_len_ MP GGACTTTATGATTTAGTAC 122
F 1147_ver_3 GR ACGTCTC
WOX4- CCCTACAAGATCAATACA
R TATGCAAC
PMS-F M25151 NCB TCCGAAAACAAGCCCATC 126
I GT
TDC-R AAGGAGCGGTTTCGGGG
ATA
G10H-F AJ251269.1 NCB TAGCAGGGACGGACACA 304
I ACATCAA
G10H-R TCACGTCCAATTGCCCAA
GCATTC
STR-F X61932 NCB TGACAGTCCCGAAGGTGT 122
I GG
STR-R CGCCGGGAACATGTAGCT
CT
D4H-F U71605.1 NCB TACCCTGCATGCCCTCAA 121
I CC
D4H-R TTGAAGGCCGCCAATTTG
AT
DAT-F AF053307 NCB CTTCTTCTCATCACGTAC 172
I CAACTC
DAT-R ATACCAAACTCAACGGCC
TTAG
QRT: cuantitativa con transcripción inversa; NCBI: Centro Nacional de Información sobre
Biotecnología; MPGR: Medicinal de Recursos genómica de las plantas.

opciones de la tabla

2.6. El análisis de los AIT por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
El procedimiento de extracción se adoptó a partir de Tikhomiroff y
Jolicoeur [28] . Brevemente, las muestras CMC y DDCs a partir de cultivos 50 días
se liofilizaron durante la noche y a tierra en un mortero, seguido de extracción con
metanol durante 1 h en un baño de sonicación. Los extractos se centrifugaron a
15.000 g durante 5 min a temperatura ambiente, y el sobrenadante se filtró a
través de un filtro de 0,45 mm (Whatman, EE.UU.) y se recogió en un vial de
HPLC de vidrio para su análisis. Las soluciones madre de vindoline, vinblastina,
vincristina y catarantina se prepararon a una concentración de 5 mg · ml -1 en
DMSO, y se almacenaron a -20 ° C. Soluciones madre individuales se prepararon
en cantidades diferentes para la preparación de gráficos de calibración, lineal en el
rango de la concentración de trabajo (0,03 ~ 1,25 mg · ml -1 ). El análisis por HPLC,
tomada de Tikhomiroff y método Jolicoeur [28] con ciertas modificaciones, lleva a
cabo utilizando una serie Agilent 1100 (Agilent Technologies, EE.UU.), bomba
binaria modelo DE43618438 (Agilent Technologies, USA), detector UV modelo de
sistema DAD G1315B (Agilent Technologies, ESTADOS UNIDOS). Un Eclipse
XDB-C18-4.6 mm de diámetro x 250 mm (5 micras) (Agilent Technologies,
EE.UU.) -junto con una columna de guardia de seguridad (Phenomenex, EE.UU.)
se utilizó a una temperatura de columna de 35 ° C con detección UV a 256 nm y
una velocidad de flujo constante de 1 ml / min para todo el proceso de análisis. La
fase móvil consistió en 5 mM de Na 2 HPO 4 (pH ajustado a 6 con H 3 PO 4 )
(disolvente A) y acetonitrilo (disolvente B), de la que disolvente A se filtró con un
filtro de vacío de vidrio con un filtro de membrana de PVDF ( Merk Millipore,
EE.UU.). La relación en volumen (A: B) era 0-20 min, gradiente lineal de 65:35 a
20:80; 20 a 25 min, gradiente lineal de 20:80 a 0: 100; 25-35 min, elución
isocrática con 0: 100 (v / v) y 35 a 40 min, elución isocrática con 65:35 (v / v) para
el equilibrado.

3. resultados
3.1. Establecimiento de líneas de células meristemáticas cámbiales
Para el establecimiento de los CMC y PD, Catharanthus tejidos meristemáticos
cambium se hicieron crecer en medios que contienen diferentes combinaciones de
hormonas ( Tabla 1 ). La proliferación celular se observó con el tejido blanco y
transparente desde la superficie de los explantes después de 4 a 10 días de la
inoculación ( Fig. 1 C y D). Las características del tejido transparente y blanco
inducida de la superficie de la capa de células difieren ligeramente dependiendo
de la composición de las hormonas (con las excepciones de T12, T14, T15, y
T16). CMC fueron inducidos dentro de 4 a 7 días de cultivo en medios con
concentraciones iguales de la NAA y combinaciones de quinetina (T1, T6 y T11),
así como en los medios de comunicación con una menor concentración de NAA
que de kinetina (T2, T3, T4, T7 y T8). Después de 2 a 3 semanas de la
inoculación, la superficie de los explantes se cubrió completamente con los tejidos
blancos y transparentes (CMC), y de los márgenes del tejido blanco y
transparente, la luz PD de color amarillo fueron inducidos ( Fig. 1 E). Después de 4
semanas, los CMC y los PD podrían ser claramente distinguibles: las capas de
células blancas transparentes derivados de los CMC y células de color marrón-
amarillo-colores derivados de los CDD ( Fig. 1 F). Después de 30 días de cultivo,
los CMC se podía separar suavemente de los PD, que se supone que se deriva de
periciclo, floema, la corteza, y la epidermis tejidos [29] .
La influencia de las hormonas en el crecimiento de dos líneas celulares se
determina por su crecimiento diferencial en medios que contienen diferentes
combinaciones de NAA y cinetina. Después de la separación de dos tipos de
células, CMC y DDC se transfirieron a T1, T3, T9, T11 y medios de
comunicación. La característica de glóbulos blancos y transparente de los CMC se
mantuvo incluso después de varias rondas de subcultivo subcultivos (8-10) ( Fig.
2 A), mientras que el color de los CDD 'cambió de amarillo a marrón después de
dos subculturas ( Fig. 2 B). Curiosamente, también se observó inducción de raíces
de los CDD ( Fig. 2 C). El crecimiento inicial de las células en medios que
contienen una baja concentración de NAA de cinetina o igual concentración de
NAA y cinetina es relativamente más alta y rápida. Sin embargo, la tasa de
crecimiento de los CMC es alta en medios que contienen concentraciones más
altas de NAA que de kinetina, y la tasa de crecimiento de los PD es mayor en
medios que contienen concentraciones más bajas de NAA que de cinetina.

Higo. 2.
las células aisladas del cambium meristemáticas (CMC) y callos derivados de
desdiferenciación (DDC) cultivadas en medios de inducción específicos. A. CMC son de
color blanco / transparente, con una forma globular. B. PD son de color marrón, con una
naturaleza friable. C. La inducción de la raíz de los PD. Se observaron los tejidos bajo un
microscopio estereoscópico (SZX12, Olympus, Japón). Para la interpretación de las
referencias a color en esta leyenda de la figura, se remite al lector a la versión en línea de
este artículo.
Figura opciones

3.2. La observación histológica de los CMC y los PD

Tejidos xilema y médula se separaron del tejido cambial basado en su color rojo
oscuro en la tinción con lignina específica colorante floroglucinol-HCl ( Fig.
1 A). Las líneas celulares derivadas de los CMC y PD fueron claramente distintos
( Fig. 3 A y B). La línea celular derivada del cambium, la CMC no mostró ninguna
reacción al medio de floroglucinol-HCl ( Fig. 3 C), mientras que la línea celular
específica DDC micro-secciones teñidas de color rojo-violeta en el color ( Fig.
3 D). Por lo tanto, este resultado sugiere que los PD con la deposición de lignina
en las paredes celulares se derivaron del floema, la corteza, y la epidermis
tejidos. Además, las paredes celulares primarias se tiñeron de púrpura, y las
paredes celulares secundarias se tiñeron de color azul con azul de toluidina. En el
marco del estudio microscopio, los micro-secciones CMC se caracterizan por un
color púrpura ( Fig. 3 E), mientras que DDCs micro-secciones se caracterizan por
un color azul ( Fig. 3 F). Este resultado indica la CMC y con paredes celulares
primarias, y los PD con la pared celular secundaria. Por lo tanto, se confirmó la
principal diferencia en la morfología de la pared celular. Las características físicas
de los CMC son delgadas paredes celulares primarias y tamaño pequeño y
compacto celular. Los PD con paredes celulares secundarias son gruesas, y el
tamaño de la célula era un poco más grande en comparación con la de la
CMC. CMC y los CDD también podían distinguirse en base a sus características
de autofluorescencia determinado, bajo el microscopio láser confocal. CMC de
excitación y los PD a 543 y 633 nm dio lugar a una fuerte señal de
autofluorescencia sólo en los PD, mientras que la baja de fluorescencia se
observó en los CMC. Sin embargo, la fluorescencia era mucho más fuerte a 543
nm que a 633 ( Fig. 4 A-H).
Higo. 3.
(Color de línea.) Micrografías ópticas de las células del cambium meristemáticas (CMC) y
callos derivados de desdiferenciación (PD) con parafina micro-cortes teñidos con el
reactivo floroglucinol-HCl y azul de toluidina. A y B. CMC y los PD se observaron bajo un
microscopio estereoscópico, respectivamente. C y D. CMC y los PD tiñeron con
floroglucinol-HCl como un reactivo, se observa bajo un microscopio de campo oscuro
(Eclipse 80i, Nikon, Japón), respectivamente, a las 20 ×. E y F. CMC y DDC se tiñeron con
azul de toluidina se observa bajo un microscopio de campo oscuro (Eclipse 80i, Nikon,
Japón), respectivamente, a las 20 ×. La barra de escala es igual a 50 micras.
Figura opciones
 Higo. 4.
(Color de línea.) La microscopía confocal láser de barrido de células frescas cambial
meristemáticas (CMC) y desdiferenciación derivados de callo (DDC) muestras. CMC
expuestas a 488 nm (A), 543 nm (B), y 633-nm (C) láseres, respectivamente; micrografía
óptica de CMC (D); PD expuestos a 488 nm (E), 543-nm (F), y 633 nm (G) láseres,
respectivamente; micrografía óptica de los PD (H). La barra de escala es igual a 50 micras.
Figura opciones

3.3. QRT-PCR análisis de los PD y los CMC

Los análisis genéticos mostraron que PXY y WOX4 los genes juegan un papel
importante en la promoción de la proliferación de las células del cambium
procambial / madre [30] . Con el fin de comprobar sus patrones de expresión de
los CMC y los PD, se realizó un análisis de QRT-PCR. Análisis de expresión se
llevaron a cabo en tres intervalos de tiempo diferentes; 10 días después de la
inducción (CMC), 30 días después de la inducción (CMC y los CDD), y 50 días
después de la inducción (CMC) y los PD. Después de 10 días de cultivo, los CMC
fueron inducidos y mostró la máxima expresión de WOX4 crecido en T9, mientras
que PXY mostró la máxima expresión en T1. La expresión de menos PXY se
observó en T9 ( Fig. 5 A). En 30 días de edad, los CMC, WOX4 mostró expresión
similar en todos los tratamientos, excepto en T11. En contraste, los niveles de
expresión variaron ligeramente en los PD, aunque los niveles de expresión fueron
significativamente menor en comparación con los CMC. Los niveles de expresión
máximos de PYX se observaron en los CMC y cultivadas en los PD T1. La menor
expresión de PXY se observó en los CMC cultivadas en T11 ( Fig. 5 B). En 50 días
de edad, CMC, WOX4 mostró una expresión máxima en T9 con la menor
expresión en T3. PD mostró la máxima expresión de WOX4 en T1 y la menor
expresión en T3 y T9. Los niveles de expresión fueron relativamente menos en los
PD cuando se compara con los CMC ( Fig. 5 C). Los niveles de expresión
máximos de PYX se observaron en los CMC y cultivadas en los PD T1 y T3,
respectivamente. La menor expresión de PXY se observó en los PD cultivadas en
T11. Los niveles de expresión fueron relativamente menos en los PD cuando se
compara con los CMC con una excepción en el tratamiento T3.
 Higo. 5.
(Color de línea.) Análisis cuantitativo de transcripción inversa-PCR de los relacionados
Wuscehl Homeobox 4 ( WOX4 ) y floema intercala con xilema ( PXY genes) en las células
meristemáticas del cambium y callos derivados de desdiferenciación cultivadas bajo
diferentes combinaciones de hormonas. Perfiles de expresión de WOX4 y PXY genes en
(A) muestras de 10 días de edad; (B) muestras de 30 días de edad; y (C) muestras de 50
días de edad. El factor 1-alfa de elongación gen se utilizó como control interno. Veces los
cambios de expresión de los genes se muestran en términos de log2 veces. Las barras de
error indican ± SD.
Figura opciones
Para obtener una mejor comprensión de los niveles de expresión de genes de la
ruta de biosíntesis de TIA, como TDC , G10H , STR , D4H , y DAT ( Fig. 6 ),
perfiles de expresión génica se analizaron en los CMC y los PD por QRT-PCR. En
10 días de edad, los CMC, Todos los AIT genes de la ruta biosintética con la
excepción de la G10H gen mostraron máximos niveles de expresión en
T1. G10H mostró la máxima expresión de T11, y menos expresión en T1. Casi se
observaron niveles de expresión similares en ambos casos; TDC y STR ,
y D4H y DAT genes ( Fig. 7 A). En 30 días de edad, los CMC, TDC , STR , D4H ,
y DAT genes mostró la máxima expresión en T1 y la menor expresión en
T11. También se observaron tendencias similares en el caso de los PD, pero con
niveles más bajos de expresión. D4H mostró niveles de expresión casi similares
en los PD cultivadas en cualquier medio de comunicación. G10H mostró la
máxima expresión en los CMC en comparación con los PD cultivadas en cualquier
medio ( Fig. 7 B). En 50 días de edad, los CMC, G10H mostró la máxima
expresión en T3 y la menor expresión en T9. Un nivel relativamente mayor de
expresión de G10H se observó en los PD cultivadas en cualquier medio con
excepción de T9. TDC mostró la máxima expresión en T1, y se observaron niveles
ligeramente más bajos de expresión en otros tratamientos. En los PD, TDC mostró
la máxima expresión de la T3, y se observaron niveles similares de expresión PD
cultiva en otros tratamientos. En los CMC, STR mostró la máxima expresión en T1
y T3 y la expresión más baja en T11 ( Fig. 7 C), mientras que se observaron
significativamente menores niveles de expresión en los PD. En los PD, STR
mostraron niveles casi expresiones similares en las células cultivadas en cualquier
medio de comunicación. En los CMC, D4H mostró la máxima expresión en T9 y la
menor expresión en T11, mientras que en los PD se observaron los niveles de
expresión máximos de D4H en los PD cultivadas en T1 y niveles ligeramente
inferiores en los demás. En los CMC, DAT mostró expresiones similares en todos
los tratamientos. Sin embargo, en el caso de los PD, se observó la máxima
expresión en T3 y la menor expresión en T9.
Higo. 6.
(Color de línea.) Ruta biosintética de los alcaloides de indol terpenoides
en Catharanthus . Los genes utilizados en los estudios cuantitativos de transcripción
inversa-PCR se resaltan.
Figura opciones
Higo. 7.
(Color de línea.) Análisis cuantitativo de transcripción inversa-PCR de los alcaloides de
indol terpenoides (AIT) genes de la ruta biosintética ( TDC , G10H , STR , D4H , y DAT ) en
cambial células meristemáticas y callo desdiferenciación derivados cultivado bajo
diferentes combinaciones de hormonas. Perfil de expresión de genes de la ruta de
biosíntesis de TIA en 10 días de edad, las muestras (A); (B) muestras de 30 días de
edad; Muestras (C) 50 días de edad. El factor 1-alfa de elongación gen se utilizó como
control interno. Veces los cambios de expresión de los genes se muestran en términos de
log2 veces. Las barras de error indican ± SD.
 Figura opciones

3.4. Análisis de contenido en alcaloides CMC y los PD

La determinación del contenido en alcaloides de CMC y PD se realizó mediante
HPLC invertida. Se inyectaron las muestras para evaluar la eficacia de separación
de los alcaloides a base de una mezcla estándar de los cuatro alcaloides. Tabla
3 muestra que los CMC mejora la biosíntesis de alcaloides en el cultivo,
especialmente vindoline, vinblastina, vincristina y catarantina. Vindoline fue sólo
detectable en cultivos desarrollados en T1, T3, T9 de CMC (0,036 mg 0,051 a la ·
g -1 DW), mientras que no se detectó en los CMC cultivadas en T11 y los PD
cultiva en cualquiera de los medios de comunicación. La vinblastina mostró una
detección máxima en CMC cultivadas en T9 (0,794 mg · g -1 DW) y el mínimo, la
detección en los PD crecido en T11 (0,479 mg · g -1DW), mientras que en los CMC
cultivadas en T11, el contenido de la vincristina alcanzó un máximo (0,279 mg · g -
1 DW) y el mínimo, la detección fue en los PD cultiva en T3 (0,183 mg · g -1 DW). El

contenido catarantina se observó a ser máxima en los CMC cultivadas en T9, que
fue alrededor de cinco veces mayor que el mínimo, la detección de los PD crecido
en T11 y mínimo en los CMC y los PD crecido en T11.
Tabla 3.
Efecto de NAA y cinetina en la acumulación de alcaloides de indol en Catharanthus CMC y
los PD.
Medios de
Tejido comunicación vindoline vinblastina vincristina catarantina
mg · g -1 peso seco

CMC T1 0,051 ± 0,613 ± 0,230 ± 13,77 ±

0,009 una 0,007 c 0,004 d 0,99 c
T3 0,041 ± 0,740 ± 0,268 ± 10,33 ±
0,009 una 0,025 b 0,004 b 0,21 d
T9 0,036 ± 0,794 ± 0.243 ± 19.40 ±
0,005 b 0,025 una 0.004 c 0.19 una
T11 nd c 0,613 ± 0,279 ± 3,98 ± 0,04 f
0,006 c 0,006 una
PD T1 nd c 0,582 ± 0,231 ± 14,81 ±
0,005 d 0,001 d 0,37 b
T3 nd c 0,574 ± 0,183 ± 7,82 ±
0,024 d 0,002 f 0,74 d, e
T9 nd c 0.489 ± 0,194 ± 10,65 ±
0.002 e 0,002 electrónico 0,53 d
T11 nd c 0,479 ± 0,199 ± 3,88 ± 0,29 f
0,006 electrónico 0,003 electrónico

CMC: células meristemáticas del cambium; PD: desdiferenciación-deriva de callo. Los

valores se expresan como medias ± SD ( n = 3). Dentro de cada columna, la misma letra
indica que no hay diferencias significativas entre tratamientos ( P > 0,05). Nd se refiere a
no detectables alcaloides.
opciones de la tabla
4. Discusión
Células meristemáticas situados en las regiones apicales de los brotes y las raíces
o situados en el interior del sistema vascular son capaces de dividirse y generar
células que finalmente se someten a la especialización o diferenciación, mientras
que al mismo tiempo dando lugar a nuevas células madre [25] . Estas células se
consideran inmortales debido a su capacidad de dividir un número ilimitado de
veces. Se cree que los cultivos en suspensión de células a proliferar por el
proceso de desdiferenciación [31] . Sin embargo, estudios recientes sugieren que
la formación de callos podría no implicar un simple reprogramación de retroceso
del proceso de desdiferenciación [29] . Independientemente del mecanismo
implicado, resultados de la formación de callo en la generación de diversos tipos
de tipos de células especializadas [32] . Los cultivos de células derivadas de tales
mezclas celulares a menudo muestran un crecimiento limitado con rendimientos
bajos e ineficiente de la síntesis de productos naturales [11] debido a los cambios
epigenéticos / genéticos perjudiciales que se producen durante la formación de
callo [32] y [33] . En el presente estudio, se aisló una línea celular cambial innata
indiferenciado de Catharanthus tallos, que es distinto de los PD.
CMC y DDC son claramente distinguibles sobre la base de características
morfológicas y los patrones de expresión génica de células específicas. Medios de
cultivo con una variada combinación de hormonas se utilizaron para comparar las
propiedades de crecimiento de los PD y los CMC aislados
del Catharanthus tallo. PD mostraron un crecimiento lento y muestran un color
parduzco en 30 días (después de dos subculturas), mientras que los CMC
mostraron un crecimiento rápido incluso después de 3 meses de subcultivo. CMC
con paredes celulares primarias y tejido DDCs con paredes celulares secundarias
fueron confirmados por la observación de deposición de lignina marcada en las
paredes celulares de los PD-derivado de la periciclo, floema, la corteza, y la
epidermis tejidos. Las características físicas de la CMC son la delgada pared
celular primaria y tamaño de células pequeñas y compactas, mientras que las
características físicas de los CDD son gruesas paredes celulares secundarias y
tamaño de celda más grande. CMC y los CDD también podían distinguirse en
base a sus características de autofluorescencia determinado, bajo el microscopio
láser confocal. PD mostraron fuertes señales de autofluorescencia cuando se
excita a 543 y 633 nm, mientras que significativamente baja fluorescencia se
observó en los CMC. En general, nuestros resultados mostraron que estas líneas
celulares muestran propiedades de células madre de acuerdo con la identidad
conocida CMC [21] . En la presente investigación, se observó el desarrollo de
estructuras como raíces de los PD posiblemente derivadas de tejidos pericycle-
como [29] . Recientemente, se ha informado de que la formación de callos a partir
de tejidos, tales como cotiledones, raíces, y los pétalos se ve obstaculizada en los
mutantes, que no son capaces de la formación de raíces laterales [29] . Se sugiere
que una activación ectópica de formación de la raíz lateral es un mecanismo
común asociado con la formación de callos a partir de múltiples órganos, y callo no
es el resultado del proceso de desdiferenciación hacia atrás a un estado
indiferenciado, sino más bien una organización formada a partir de células
pericycle-como raíz [29 ] . El PXY gen que codifica para una proteína LRR-RLK se
informó que se expresó diferencialmente en las células CMC y los
PD [34] y [35] . El análisis de los resultados de QRT-PCR estableció que la
expresión de PXY gen se reguló de manera significativa en los CMC en
comparación con los PD. WOX4 gen, que pertenece a la familia subclade WUS en
WOX, se requiere para la promoción de la proliferación de células madre
cambium. WOX4 había sido previamente demostrado para promover la división
celular vascular [30] y es necesario para mantener la actividad de proliferación
celular de las células madre vasculares [36] . De acuerdo con estos resultados, el
análisis de la expresión estableció que la expresión de WOX4 se upregulated
significativamente en los CMC que en los PD.
El Catharanthus planta es conocida por producir más de 130 compuestos
diferentes AIT, incluyendo los poderosos fármacos citotóxicos vinblastina y
vincristina [27] . Catharanthus alcaloides compartir la síntesis de muchos pasos
biosintéticos comunes. Primeros pasos críticos en la biosíntesis de los AIT
incluyen el TDC y STR reacción mediada. Los primeros pasos comprometidos de
la biosíntesis de TIA en las ramas de precursor de indol y terpenoides son
catalizadas por TDC y G10H, respectivamente. STR implica la condensación de
triptamina y secologanina, lo que resulta en la formación de strictosidine, que es
una estructura de esqueleto general de las AIT [27] y [37] . A citosólica 2-
oxoglutarato dioxigenasa dependiente de la enzima conocida como D4H está
implicado en la 4-hidroxilación de desacetoxyvindoline [38] . La final de O-
acetilación de deacetylvindolineis es catalizada por la enzima citosólica DAT para
producir vindoline [39] y [40] . Casi todas las etapas de los CMC mostró la
máxima expresión de genes de biosíntesis de TIA en las células cultivadas en un
medio que contiene 0,5 mg · ml -1 de NAA y 0,5 mg · ml -1 de kinetina (T1). El
análisis de HPLC reveló que se observó una acumulación relativamente más alta
de compuestos de TIA en los CMC que en los PD. Sin embargo, el observado una
mayor expresión de genes de biosíntesis de TIA vía en CMC cultivadas en medios
T1 no se correlaciona con la mayor acumulación de compuestos TIA. Las células
cultivadas en medios T9 que contienen 1,5 mg · ml -1 de NAA y 0,5 mg · ml -1 de
kinetina mostraron máxima acumulación de compuestos TIA. Por lo tanto, sería T9
medio adecuado para cultivos en suspensión de CMC-derivados del aumento de
la producción de Catharanthus AIT, mientras que, los medios de comunicación T1
sería un más adecuado para la proliferación de los CMC.
En conclusión, hemos aislado CMC indiferenciadas en Catharanthus y los
caracterizaron en base a sus análisis fisiológicos y moleculares. Por último, hemos
establecido las condiciones de cultivo óptimas para la inducción diferencial de
CMC y una mayor acumulación de AIT. Los cultivos de células y de órganos
de Catharanthus se utilizan como un medio de producir AIT importantes. El uso de
CMC pueden ser una estrategia importante para aumentar la producción de
alcaloides de cultivos de células vegetales, evitando el limitado crecimiento de un
cultivo en suspensión derivada de los PD.

Expresiones de gratitud
Esta investigación fue apoyada por el KU 2014 Cerebro de la Universidad de
Konkuk piscina.