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MUTACIONES (MURRAY 8ª EDICION)

Replicación exacta del ADN es importante para la supervivencia de las bacterias

Aunque éstas tienen sistemas eficientes de reparación de ADN, igualmente ocurren


mutaciones y alteraciones en el ADN.

Mutaciones mayoritariamente con poco efecto sobre la bacteria

Algunas pueden proporcionar una ventaja selectiva para la supervivencia de la bacteria, el


huésped o la terapia con antibióticos.

Mutaciones y sus consecuencias

Mutación: Cualquier cambio en la secuencia de bases del ADN.


Una sola base se puede convertir en una purina o una pirimidina.

Transversión: Una purina es reemplazada por una pirimidina y viceversa

Mutación silenciosa: Cambio en el nivel de ADN que no da como resultado ningún cambio
de aminoácido en la proteína codificada.
Puede codificar para un aminoácido.

Mutación sin sentido: Inserción de un aminoácido diferente en la proteína


Puede ser una mutación conservativa si el nuevo aminoácido tiene propiedades similares
(por ejemplo, valina reemplazando a la alanina).

Mutación sin sentido en el codón que codifica un aminoácido de cambio para un codón de
término (por ejemplo, TAG [timidina-adenina-guanina]).

El ARNm se libera del ribosoma y el extremo proteína prematuramente.

Mutaciones condicionales: Asociadas a mutación conservativa que cambia la estructura o


función de una proteína importante a temperaturas elevadas.
Mutaciones sensibles a la temperatura

A mayor número de bases involucradas, los cambios son más drásticos.

Pequeña eliminación o inserción que no está en múltiplos de tres produce una mutación
de cambio de marco de lectura
Generalmente conduce a un péptido inútil y al truncamiento prematuro de la proteína.

Mutaciones nulas, que destruye completamente la función, donde hay una inserción
extensa, eliminación o reajuste grueso de la estructura del cromosoma. La inserción de
largas secuencias de ADN por recombinación, por transposición o durante la ingeniería
genética puede producir mutaciones nulas al separar las partes de un gen e inactivar el
gen.

Muchas mutaciones ocurren de manera espontánea en la naturaleza (p. Ej., Por errores de
la polimerasa); sin embargo, agentes físicos o químicos también puede inducir
mutaciones.

Agentes físicos inductores de mutaciones:


Calor: desaminación de nucleótidos
Radiación ultravioleta: Dimerización de pirimidina
Radiación ionizante (rayos X): Producen radicales hidroxilo muy reactivos que pueden ser
responsables de la apertura de un anillo de roturas de cadena simple o bicatenarias en el
ADN.

Mutágenos químicos: 3 clases.

Los análogos de base de nucleótidos conducen a errores de replicación de DNA y errores


de asociación. Por ejemplo, la incorporación de 5-bromouracilo en el ADN en lugar de
timidina permite el emparejamiento de bases con guanina en lugar de adenina,
cambiando a T-A par de bases a un par de bases G-C. Los mutágenos de cambio de
marcos, como las moléculas planas policíclicas como el bromuro de etidio o los derivados
de acridina, se insertan (o intercalan) entre las bases en la doble hélice. El aumento en el
espaciamiento de los pares de bases sucesivos provoca o elimina una única base y
conduce a errores frecuentes durante la replicación del ADN. Los químicos reactivos al
ADN actúan directamente sobre el ADN para cambiar la estructura química de la base.
Estos incluyen ácido nitroso (HNO2) y agentes alquilantes, que incluyen nitrosoguanidina y
metano sulfonato de etilo, que se sabe que agregan grupos metilo o etilo a los anillos de
las bases de ADN. Las bases modificadas no pueden usarse en absoluto.

El daño también se puede eliminar de la columna vertebral del ADN.

Mecanismos de reparación de ADN

Varios mecanismos de reparación han evolucionado en bacterias.

Estos tipos de mecanismos se pueden dividir en los siguientes cinco grupos:

1. La reparación directa del ADN es la eliminación enzimática del daño, como los dímeros
de pirimidina y las bases alquiladas.

2. La reparación por escisión es la eliminación de un segmento de ADN que contiene el


daño, seguido de la síntesis de una nueva cadena de ADN. Existen dos tipos de
mecanismos de reparación de escisión, generalizados y especializados.
3. La reparación recombinante o posterior a la replicación reemplaza o falta una sección
de ADN con secuencias iguales o similares que pueden estar presentes durante la
replicación o en ADN extracromosómico.

4. La respuesta SOS es la inducción de muchos genes (≈15) después del daño del ADN o la
interrupción de la replicación del ADN para promover la recombinación o la reparación
propensa a errores.

5. La reparación propensa a errores es el último recurso de una célula bacteriana antes de


que muera. Se utiliza para llenar un espacio cuando una plantilla de ADN no está
disponible para dirigir una reparación precisa.

Intercambio de genes en células procariotas

Muchas bacterias, especialmente muchas especies bacterianas patógenas, son promiscuas


con su ADN. El intercambio de ADN entre células y células, lo que produce nuevas cepas
de bacterias. este
el intercambio puede ser ventajoso para el receptor, especialmente si el ADN
intercambiado codifica resistencia a los antibióticos. La presente invención se puede
integrar en el cromosoma o como un elemento extracromosómico (plásmido) o un virus
bacteriano (bacteriófago) y una unidad que se replica autónomamente.

Los plásmidos son pequeños elementos genéticos que se replican independientemente


del cromosoma bacteriano. La mayoría de los plásmidos son moléculas circulares de ADN
bicatenario que varían de 1500 a 400,000 pares de bases. Sin embargo, Borrelia
burgdorferi, el agente causante de la enfermedad de Lyme, y la Borrelia relacionada
hermsii son únicos entre todas las eubacterias porque poseen genomas lineales y
plásmidos. Al igual que el ADN cromosómico bacteriano, los plásmidos pueden replicarse
de forma autónoma y, como tales, se denominan replicones. Algunos plásmidos, como el
plásmido F de E. coli, son episomas, lo que significa que pueden integrarse en el huésped
cromosómico.

Los plásmidos llevan información genética que puede no ser esencial.

Por ejemplo, plásmidos pueden codifica la generación de mecanismos de resistencia a


antibióticos, las bacteriocinas, toxinas, determinantes de virulencia, y otros genes que
pueden proporcionar las bacterias con una sola ventaja de crecimiento sobre otros
microbios oro dans le anfitrión (Figura 13-10). El número de copias del plásmido
producido por plásmido. El número de copia es la relación de copias del plásmido al
número de copias del cromosoma. Este plásmido puede ser tan pequeño como 50 o más
plásmidos.
Los plásmidos grandes (de 20 a 120 kb), como el factor de fertilidad encontrado en E. coli
o el factor de transferencia de resistencia (80 kb), a menudo pueden mediar su propia
transferencia de una célula a otra mediante un proceso llamado conjugación (ver la
sección lo conjugaremos más adelante en este capítulo). Estos plásmidos conjugativos
codifican todos los factores necesarios para su transferencia. Otros plásmidos se pueden
transferir a una célula bacteriana por medios distintos a la conjugación, como
transformación o transducción. Estos términos también se discuten más adelante en el
capítulo.

Los bacteriófagos son virus bacterianos con un genoma de ADN o ARN generalmente
protegidos por una membrana o capa proteica.

Estos elementos genéticos extracromosómicos pueden sobrevivir fuera de una célula. Los
bacteriófagos infectan las células bacterianas y para replicar Cualquiera de los números de
ancho y hace que la célula de lisar oro (infección lítica), en algunos casos, integrarse en el
genoma del huésped sin matar al host (el estado lisogénico), tales como la E. coli
bacteriófago lambda. Algunos bacteriófagos lisogénicos portan genes de toxinas (por
ejemplo, Corynephage beta lleva el gen para la toxina diftérica). El bacteriófago lambda
permanece lisogénico siempre que se sintetice una proteína represora e impida que el
genoma del fago se desintegre con el fin de replicarse y salir de la célula. El daño a la
célula anfitriona es una proteína que es una señal de que la célula anfitriona no es
saludable y ya no es un buen lugar para la "carga libre".

Los transposones (saltando genes) son elementos genéticos móviles (Figura 13-11) que
puede transferir ADN dentro de una célula, de una posición a otra críticas en el genoma,
diferentes moléculas Entre de oro de ADN (por ejemplo, plásmido de plásmido o plásmido
en el cromosoma). Los transposones están presentes en procariotas y eucariotas. Los
transposones más simples se denominan secuencias de inserción expirado y gama de
longitud 150-1500 base de pares, con repeticiones invertidas de 15 a 40 pares base en sus
extremos y la información genética mínima necesario para su propia transferencia (es
decir, el gen que codifica la transposasa) .

Los transposones complejos llevan otros genes, como los genes que proporcionan
resistencia contra los antibióticos. Los transposones algunas veces se insertan en genes e
inactivan esos genes. Si la inserción y la inactivación ocurren en una proteína esencial
codificada, la célula muere.

Algunas bacterias patógenas usan un mecanismo similar al transposón para coordinar la


expresión de un sistema de factores de virulencia. Los genes para la actividad se pueden
agrupar en una patogenicidad o virulencia mediante elementos móviles similares a
transposones, lo que les permite moverse al cromosoma y a otras bacterias. Toda la
unidad genética puede ser activada por un estímulo ambiental (por ejemplo, pH, calor,
contacto con la superficie de la célula huésped) como una forma de coordinar la expresión
de un proceso complejo. Por ejemplo, la isla SPI-1 de Salmonella es activado por señales
ambientales (por ejemplo, pH) para expresar los 25 genes para un dispositivo de secreción
de tipo III que permite a las bacterias entren en las células no fagocíticas.

Mecanismos de transferencia genética entre células

Figura 13-12: (1) Transformación, que es una absorción activa e incorporación de ADN
exógeno o extraño, (2) conjugación, que es el oro de apareamiento -sexual cuasi
intercambio de información genética de una bacteria (el donante) a Comentarios otra
bacteria (el recipiente), oro (3) transducción, qui es la transferencia de la información
genética de una bacteria a Another por un bacteriófago. Una vez dentro de una célula, un
transposón puede saltar entre diferentes moléculas de ADN (por ejemplo, plásmido a
plásmido o plásmido a cromosoma). Varios de estos mecanismos contribuyeron a la
generación de Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina (figura 13-13 y cuadro
13-2).

transformación

La transformación es el proceso por el cual las bacterias toman fragmentos de ADN


desnudo y los incorporan en sus genomas. La transformación fue el primer mecanismo de
transferencia genética que se descubrió en las bacterias. En 1928, Griffith observó que la
virulencia neumocócica estaba relacionada con la presencia de una cápsula de
polisacárido y que los extractos de bacterias encapsuladas de transmisión Producir
colonias lisas Podría esta relacionarse con bacterias encapsuladas, de apariencia normal
como colonias rugosas. Los estudios de Griffith llevaron a la identificación de Avery,
MacLeod y McCarty del ADN como la transformación de unos 15 años después.

Algunas especies son naturalmente capaces de absorber ADN exógeno, incluyendo


Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Bacillus spp. Y Neisseria spp. La
competencia se desarrolla hacia el final del crecimiento logarítmico. El uso de pulsos de
alto voltaje para facilitar la absorción del plásmido y otro ADN.

conjugación

La conjugación da como resultado una transferencia de ADN de una célula donante (o


macho) a una célula receptora (o femenina) a través del pilus sexual. La conjugación
ocurre con la mayoría, si no con todas las eubacterias, generalmente entre miembros de
la misma especie o especies relacionadas, pero se ha demostrado que ocurre entre células
procariotas y de plantas, animales y hongos.

El tipo de apareamiento (sexo) de la célula depende de la presencia o ausencia de un


conjugado de plásmido, como el plásmido F de E. coli. El plásmido F se define como
conjugativo porque transporta todos los genes necesarios para su propia transferencia,
incluida la capacidad para establecer relaciones sexuales y para iniciar la síntesis de ADN
en el origen de transferencia (oriT) del plásmido.
El pilus sexual es un dispositivo especializado de secreción tipo IV. Tras la transferencia del
plásmido, los receptores se convierten en células masculinas F +.

El plásmido es un plásmido del ADN cromosómico.

Cuando se transfiere al contenedor, lleva consigo y lo convierte en un hombre. La


secuencia del plásmido se integra en el cromosoma bacteriano, la célula se designa a la
célula Hfr (recombinación de alta frecuencia).

El ADN está conjugado por una doble hélice pero una molécula monocatenaria. La
movilización comienza cuando una proteína codificada por un plásmido realiza una
escisión con hebra única específica de sitio en el oriT. El nick inicia la replicación del círculo
rodante, y el filamento lineal desplazado se dirige a la célula receptora. El ADN
monocatenario transferido se recirculariza y su cadena complementaria se sintetiza.

La conjugación resulta de la secuencia del plásmido y de una parte del ADN cromosómico
bacteriano. Debido a la conexión frágil entre los compañeros de apareamiento, la
transferencia generalmente se aborta antes de completarse, de modo que solo se
transfieren las secuencias cromosómicas adyacentes a la F integrada. La disrupción
artificial de un apareamiento entre un HFR y un par F ha sido útil en la construcción de
una secuencia de ADN cromosómico de E. coli. En dichos mapas, la posición de cada gen
se da en minutos (en base a 100 minutos para la transferencia completa a 37 ° C), de
acuerdo con su tiempo de entrada a un contenedor.

transducción

La transferencia genética por transducción está mediada por virus bacterianos


(bacteriófagos) que recogen fragmentos de ADN y bacteriófagos. El ADN se entrega a las
células infectadas y se incorpora a los genomas bacterianos. La transducción se puede
clasificar como especializado si la cuestión de transferencia en fagos genes particulares
(por lo general adyacente a Aquellos Su sitio de integración en el genoma) o generalizarse
si la incorporación de secuencias de ADN es aleatorio Debido embalaje accidental de ADN
huésped en la cápside del fago. Por ejemplo, una nucleasa del fago P1 degrada el anfitrión
ADN cromosómico de E. coli, y los fragmentos de ADN revisa algunas de las se
empaquetan en partículas de fago. El ADN encapsulado, en lugar del fago de ADN, se
inyecta en una nueva célula huésped, donde puede recombinarse con el ADN del huésped
homólogo. Las partículas transductoras generalizadas son valiosas en el mapeo genético
de los cromosomas bacterianos. Es más probable que los dos genes cromosómicos se co-
transduzcan en el mismo fragmento de ADN.

recombinación
La incorporación de ADN extracromosómico (extraño) en el cromosoma se produce por
recombinación. Hay dos tipos de recombinación: homóloga y no homóloga.

La recombinación homóloga (legítima) ocurre entre secuencias de ADN estrechamente


relacionadas y generalmente una secuencia para otra. El proceso requiere un conjunto de
enzimas producidas (en E. coli) por los genes.

La recombinación no homóloga (ilegítima) ocurre entre ADN diferente


secuencias e inserciones o eliminaciones de productos o ambas. Este proceso típicamente
requiere enzimas de recombinación especializadas (a veces específicas del sitio), tales
como las producidas por muchos transposones y bacteriófagos lisogénicos.

Ingeniería genética

La ingeniería genética, también conocido como tecnología de ADN recombinante, utiliza la


tecnología y herramientas desarrolladas por los genetistas bacterianas para purificar,
amplificar, modificar y expresar las secuencias de genes específicos. El uso de la ingeniería
genética y la "clonación" ha revolucionado la biología y la medicina. Los componentes
básicos de ingeniería genética están (1) Clonación y expresión vectores, de ser qui peut
usar para suministrar las secuencias de ADN en bacterias receptivas y amplificar la
secuencia deseada, (2) la secuencia de ADN a ser amplificado y, (3) enzimas expresadas,
tales como enzimas de restricción, qui se utilizan para escindir el ADN de forma
reproducible en secuencias definidas (Tabla 13-1), y (4) de ligasa de ADN, la enzima que
une el fragmento al vector de clonación.

Los vectores de clonación y expresión pueden usarse en un huésped bacteriano o


eucariótico. Muchos tipos de vectores se usan actualmente. Los vectores plasmídicos,
tales como pUC, pBR322 y pGEM (figura 13-14), se usan para fragmentos de ADN de hasta
20 kb. Bacteriófago, lambda tal como, se utilizan para los fragmentos más grandes de
hasta 25 kb, y vectores de cósmido-haber combinado revisa algunas de las ventajas de
plásmidos y fagos para los fragmentos de hasta 45 kb.

La mayoría de los vectores han de clonación sido "ingeniería" para tener un sitio web para
la inserción de ADN extraño, tiene moyen de selección de las bacterias que-han
incorporado Cualquier plásmido (por ejemplo, resistencia a antibióticos), y tiene moyen
de distinguir las bacterias que-han incorporado Esos plásmidos Eso contener ADN
insertado Los vectores de expresión tienen secuencias de ADN para facilitar su replicación
en bacterias y células eucariotas y la transcripción del gen en ARNm.

El ADN para ser clonado puede obtenerse por purificación de ADN cromosómico a partir
de células, virus, u otros plásmidos o por amplificación selectiva de secuencias de ADN por
un técnico conocido como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (PCR más Top se
explica en el capítulo 5). Tanto el vector como el ADN extraño se escinden con enzimas de
restricción (véase la figura 13-14).
Las enzimas de restricción reconoce una secuencia palindrómica específica y haga un corte
escalonado que genera extremos cohesivos corte embotado oro que genera extremos
romos (véase la Tabla 13-1).

La mayoría de los vectores de clonación tienen una secuencia llamada sitio de clonación
múltiple que puede escindirse por muchas enzimas de restricción.

Ligación del vector con la molécula de ADN recombinante de ADN general, que es capaz
de replicar la secuencia insertada. El número total de vectores recombinantes obtenidos
cuando se clonan todos los fragmentos que resultan de la escisión del ADN cromosómico
es una biblioteca genómica. Alternativa Un enfoque para la clonación del gen de una
proteína es usar una enzima de retrovirus llamada transcriptasa inversa caducado (RNA-
polimerasa dependiente de ADN) para convertir el ARNm en la célula en un ADN
complementario (ADNc). Una biblioteca de ADNc representa los genes que se expresan
como ARNm en una célula particular.

El ADN recombinante se transforma después en un huésped bacteriano, habitualmente E.


coli, y las bacterias que contienen el plásmido se seleccionan para la resistencia a los
antibióticos (por ejemplo, resistencia a la ampicilina).

La biblioteca puede explorarse luego para encontrar un clon de E. coli que posee el
fragmento de ADN deseado. Se pueden usar diversas técnicas de detección para
identificar las bacterias con el ADN recombinante apropiado. La clonación múltiple
el sitio usado para insertar el ADN extraño a menudo es parte del gen lacZ del operón lac.
La inserción del ADN extraño en el gen lacZ inactiva el gen (que actúa casi como un
transposón) y evita la síntesis plásmido dirigida de β-galactosidasa en la célula receptora,
los resultados qui en blanco colonias bacterianas en vez de colonias de color azul si ß-
galactosidasa se producido y capaz de dividir un cromóforo apropiado.

La ingeniería genética ha-ha utilizado para aislar y expresar los genes de las proteínas
útiles, tales como la insulina, interferón, hormona del crecimiento, interleucina y en
bacterias, levaduras, células de insecto o impar. De forma similar, se pueden preparar
grandes cantidades de inmunógeno puro para una vacuna sin la necesidad de trabajar con
los organismos patógenos intactos.

La vacuna contra el virus de la hepatitis B representa el primer uso exitoso de la tecnología


de ADN recombinante para hacer una vacuna aprobada para uso humano por la
Administración de Drogas y Alimentos de EE. UU. El antígeno de superficie de la hepatitis
B es producido por la levadura Saccharomyces cerevisiae.

Alternativamente, el ADN plasmídico capaz de promover la expresión del inmunógeno


deseado (vacuna de ADN) se puede inyectar en un individuo y expresa el inmunógeno y la
respuesta inmune general. La tecnología del ADN recombinante también se ha vuelto
esencial para el diagnóstico de laboratorio, la ciencia forense, la agricultura y muchas
otras disciplinas.

MUTACIONES (BROCK)

Todos los organismos contienen una secuencia específica de bases de nucleótidos en su genoma,
su modelo genético. Una mutación es un cambio hereditario en la secuencia de bases de ese
genoma, que es un cambio que pasa de la célula madre a las células de la progenie. Las
mutaciones pueden conducir a cambios, algunos buenos, otros malos, pero principalmente
neutros, en las propiedades de un organismo. Aunque la tasa de mutación espontánea es baja
(Sección 10.3), la velocidad a la que muchos procariotas se dividen y su crecimiento exponencial
asegura que las mutaciones se acumulen sorprendentemente rápido. Una mutación en una
mutación genética. Tomados en conjunto, la mutación y la recombinación alimentan el proceso
evolutivo.

Comenzamos considerando el mecanismo molecular de la mutación y las propiedades de los


microorganismos mutantes.

10.1 Mutaciones y mutantes


En todas las células, el genoma consiste en ADN bicatenario.
En los virus, por el contrario, el genoma puede consistir en ADN o ARN monocatenario o
bicatenario. Una cepa de cualquier célula o virus que lleva un cambio en la secuencia de
nucleótidos se denomina mutante. Un mutante por definición de su cepa parental en su genotipo,
la secuencia de nucleótidos del genoma. Además, las propiedades observables del fenotipo de
mutante también se pueden alterar en relación con su progenitor. Este fenotipo alterado se llama
fenotipo mutante. Es una cepa común de una cepa salvaje. El término "tipo salvaje" se puede usar
para referirse a un organismo particular o al estado de un gen particular que se está investigando.
Los derivados mutantes pueden obtenerse de cepas de tipo salvaje u otras cepas derivadas del
tipo salvaje, por ejemplo, otro mutante.

Genotipo versus Fenotipo

Dependiendo de la mutación, una cepa mutante puede diferir o no en fenotipo de su progenitor.


Por convención en genética bacteriana, el genotipo de un organismo se designa con tres letras
minúsculas seguidas de una letra (todas en cursiva) que indican un gen particular. Por ejemplo, el
gen de Escherichia coli codifica una proteína llamada HisC que funciona en la biosíntesis del
aminoácido histidina. Mutaciones en HisC1, hisC2, y así sucesivamente, los números que se
refieren al aislamiento de las cepas mutantes. Cada mutación hisC sería diferente, y cada mutación
hisC podría afectar la proteína HisC de diferentes maneras.

El fenotipo de un organismo se designa con una letra mayúscula seguida de dos letras minúsculas,
con un superíndice más o menos para indicar la presencia o ausencia de esa propiedad.
Por ejemplo, su cepa de E. coli es capaz de producir su propia histidina, mientras que una cepa no
lo es. La cepa His- requeriría un suplemento de histidina para el crecimiento. Una mutación en el
gen conducirá a un fenotipo si elimina la función de la proteína HisC.
Aislamiento de mutantes: cribado frente a selección

Prácticamente cualquier característica de un organismo puede cambiarse por mutación. Algunas


mutaciones son seleccionables, a pesar de que pueden conducir a un cambio en el fenotipo de un
organismo. Una mutación seleccionable confiere una clara ventaja sobre la cepa mutante bajo
ciertas condiciones ambientales, por lo que la progenie de la célula mutante puede superar y
reemplazar al progenitor. Un buen ejemplo de una mutación seleccionable es la resistencia a los
medicamentos: un mutante resistente a los antibióticos puede crecer en presencia de un
antibiótico que inhibe o mata al progenitor (Figura 10.1a) y, por lo tanto, se selecciona en estas
condiciones. Es relativamente fácil detectar y aislar mutantes seleccionables mediante la elección
de las condiciones ambientales apropiadas. La selección es, por lo tanto, una herramienta
genética extremadamente poderosa que permite el aislamiento de un solo mutante de una
población que contiene millones o incluso miles de millones de células parentales.

Un ejemplo de una mutación no seleccionable es una pérdida de color en un organismo


pigmentado (Figura 10.1b, c). Las células no pigmentadas generalmente tienen una ventaja sobre
las células parentales pigmentadas cuando se cultivan en placas de agar. Podemos detectar tales
mutaciones solo examinando grandes cantidades de colonias y buscando las "diferentes", un
proceso llamado cribado o tamizaje.

Aislamiento de Auxotrophs Nutricionales

Estos métodos están disponibles para detectar grandes cantidades de colonias para ciertos tipos
de mutaciones. Por ejemplo, los mutantes nutricionalmente defectuosos pueden detectarse
mediante la técnica de replicado de placas (Figura 10.2). Una colonia de un asa estéril, un palillo de
dientes o un brazo robótico. Las colonias de los padres crecerán normalmente, mientras que las
del mutante no crecerán. Por lo tanto, la incapacidad de una colonia para crecer es una falta de
señales de nutrientes que es un mutante. La colonia en la placa maestra correspondiente a la
mancha vacante se puede recoger, purificar y caracterizar.

Un mutante con un requerimiento nutricional para s'intitule crecimiento año auxótrofo, y la qui
relativa Fue derivado de s'intitule tiene prototroph. (A prototroph puede o no puede ser el de tipo
salvaje. Un auxótrofo se pueden derivar de la de tipo salvaje o mutante de un derivado de la de
tipo salvaje.) Por ejemplo, los mutantes de E. coli con un His-fenotipo son auxótrofos de histidina.
Ejemplos de clases comunes de mutantes y sus medios por los que se detectan en la Tabla 10.1.

10.2 Base molecular de la mutación

Las mutaciones pueden ser espontáneas o inducidas. Se producen mutaciones inducidas en el


ambiente y mutaciones hechas deliberadamente por humanos. Pueden ser el resultado de la
exposición a la radiación natural (rayos cósmicos, etc.) que altera la estructura de las bases en el
ADN. Además, una variedad de sustancias químicas, incluidos los radicales de oxígeno (Sección
5.16), pueden modificar químicamente el ADN. Por ejemplo, los radicales de oxígeno pueden
convertir la guanina en 8-hidroxiguanina, y esto causa mutaciones.

Las mutaciones espontáneas son aquellas que ocurren sin intervención externa. El grueso de las
mutaciones espontáneas es el resultado de la ADN polimerasa durante la replicación del ADN.
Las mutaciones que cambian solo un par de bases se llaman mutaciones puntuales. Las
mutaciones puntuales son causadas por sustituciones de pares de bases en el ADN o por la
pérdida o ganancia de un solo par de bases. La mayoría de las mutaciones puntuales en realidad
no causan ningún cambio fenotípico, como se explica a continuación. Sin embargo, como ocurre
con todas las mutaciones, se produce cualquier cambio fenotípico que resulte de una mutación
que depende de la mutación y del tipo de cambio de nucleótidos.

Sustituciones de par base

Si una mutación está dentro de la región de codificación de un polipéptido, es muy probable que
cualquier cambio en el fenotipo del polipéptido resulte de un cambio en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido.

El error en el ADN se transcribe en ARNm, y el ARNm se traduce en un polipéptido. La figura 10.3


muestra las consecuencias de varias sustituciones de pares de bases.

Al interpretar los resultados de una mutación, primero debemos recordar que el código genético
es degenerado (Sección 4.11 y Tabla 4.5).

Por lo tanto, no todas las mutaciones en la secuencia de bases que codifica un polipéptido
cambiarán el polipéptido. Esto se ilustra en la figura 10.3, que muestra varios resultados posibles
cuando el ADN codifica un codón de tirosina único en un polipéptido mutado. Primero, un cambio
en el ARN de UAC a UAU no tendría efecto aparente porque la UAU también es un codón de
tirosina. Aunque no afectan la secuencia del polipéptido codificado, tales cambios en el ADN se
consideran un tipo de mutación silenciosa; es decir, una mutación que no afecta el fenotipo de la
célula. Tenga en cuenta que las mutaciones silenciosas en las regiones de codificación casi siempre
están en la tercera base del codón (la arginina y la leucina también pueden tener mutaciones
silentes en la primera posición).

En la primera o segunda base del codón, más a menudo conduce a cambios significativos en la
secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, un UAC a AAC (Figura 10.3) da como
resultado un cambio de aminoácido dentro del polipéptido de tirosina a asparagina en un sitio
específico.

Esto se llama mutación sin sentido debido al "sentido" informativo (secuencia precisa de
aminoácidos) en el polipéptido que ha cambiado. Si el cambio se produce en una ubicación crítica
en la cadena polipeptídica, la proteína podría estar inactiva o tener actividad reducida. Sin
embargo, no todas las mutaciones sin sentido conducen necesariamente a proteínas no
funcionales. El resultado depende de la sustitución en la cadena polipeptídica. Por ejemplo, las
mutaciones en el sitio activo de una enzima tienen más probabilidades de destruir la actividad que
las mutaciones en otras regiones de la proteína.

Otro resultado posible de una sustitución de un par de bases es la formación de un codón sin
sentido (detener). Esto da como resultado una finalización prematura de la traducción, lo que
conduce a un polipéptido incompleto (figura 10.3). Las mutaciones de este tipo se denominan
mutaciones sin sentido porque el cambio es un codón de sentido (codificación) a un codón sin
sentido (Tabla 4.5). A menos que la mutación esté muy cerca del extremo del gen, el producto se
considera truncado o incompleto. Las proteínas truncadas son completamente inactivas o, al
menos, carecen de actividad normal.

Otros términos son comunes en genética microbiana para describir el tipo de sustitución de bases
en un punto de mutación. Las transiciones son mutaciones en las que una base de purina (A o G)
se sustituye por otra purina, o una base de pirimidina (C o T) se sustituye por otra pirimidina. Las
transversions son mutaciones puntuales en las cuales una base de purina es sustituida por una
base de pirimidina, o viceversa.

Cambios de trama y otras eliminaciones de inserciones de oro

Debido a que el código genético es uno de los componentes más importantes de los codones,
cualquier eliminación o inserción de un solo par de bases da como resultado un cambio en el
marco de lectura. Estas mutaciones del marco de lectura a menudo tienen serias consecuencias.

Las inserciones o deleciones de una única base cambian la secuencia primaria del polipéptido
codificado, típicamente de una manera importante (figura 10.4). Dichas microinserciones o
microdeleciones pueden ser el resultado de errores de replicación. La inserción o eliminación de
dos pares de bases también causa un cambio de marco; sin embargo, insertar o eliminar tres pares
de bases agrega o elimina un codón completo. Esto da como resultado la adición de un único
aminoácido en la secuencia polipeptídica. Sin embargo, a menudo no es algo malo para el cambio
de marco, que codifica toda la secuencia polipeptídica después del punto de mutación.

Las inserciones o eliminaciones también pueden generar ganancias o pérdidas. Dichos cambios
inevitablemente resultan en una pérdida completa de la función del gen. Algunas eliminaciones
son tan amplias que pueden incluir varios genes. Si alguno de los genes eliminados es esencial, la
mutación será letal. Tales deleciones no se pueden restaurar a través de mutaciones adicionales,
sino solo a través de la recombinación genética. Las inserciones y deleciones más grandes pueden
surgir como resultado de la recombinación genética. Además, muchas mutaciones de inserción
amplias se deben a la inserción de secuencias de ADN identificables específicas llamadas
elementos transponibles (Sección 10.11). El efecto de los elementos transponibles sobre la
evolución de los genomas bacterianos se analiza con más detalle en la Sección 6.12.

10.3 Reversiones y tasas de mutación

Los diferentes tipos de mutaciones ocurren. Algunos tipos de mutaciones ocurren raramente por
lo que casi no es posible detectar Son, mientras que otros se producen con frecuencia a fin de que
las dificultades de este experimento año intentan tratar de mantener un constante genéticamente
cultivo de reserva. A veces, una segunda mutación puede revertir el efecto de una mutación
inicial. Además, todos los organismos poseen una variedad de sistemas para la reparación del
ADN. En consecuencia, la tasa de mutación observada no sólo depende de la frecuencia del
intercambio de ADN objetivo aussi en la eficiencia de reparación del ADN.

Reversiones mutaciones (cambios Volver) Point son reversibles Por lo general, un proceso
conocido como la reversión. Una reversión es una cepa en el qui fenotipo original que se cambió
en el mutante es restaurado por una segunda mutación.

Los reversores pueden ser de dos tipos, el mismo sitio o el segundo sitio. En revertientes samesite,
la mutación restaura Esa actividad se encuentra en la página web saami como la mutación original.
Si la mutación no es solo de regreso en el sitio tiene como objetivo aussi Sami restaura la
secuencia original, es cierto de reversión s'intitule.

En los reversores del segundo sitio, la mutación se encuentra en un sitio diferente en el


DNA. Las mutaciones del segundo sitio pueden restaurar un fenotipo de tipo salvaje
si funcionan como mutaciones supresoras, mutaciones que compensan
por el efecto de la mutación original. Se conocen varias clases de mutaciones supresoras. Estos
incluyen (1) una mutación en otro lugar en el mismo que restaura enzima función de genes, tal
como una segunda mutación de desplazamiento de marco cerca de la primera que restaura el
marco de lectura original; (2) una mutación en el gen another que restaura la función original del
gen mutado; y (3) una mutación en el gen another que resulta en la generación de una enzima que
puede sustituir a la mutado uno.

Una clase interesante de mutaciones supresoras son aquellas que resultan en cambios de
secuencia de bases en ARNt. Las mutaciones sin sentido se pueden suprimir cambiando la
secuencia del anticodón de una molécula de ARNt de manera que ahora reconozca un codón de
terminación (figura 10.5). Tal ARNt alterado se denomina ARNt supresor e insertará el aminoácido
en el codón de parada que ahora lee. Las mutaciones del ARNt supresor serían letales a menos
que un ARNt para un codón particular. Un ARNt puede ser mutado en un supresor, mientras que el
otro realiza la función original.

La mayoría de las células tienen múltiples ARNt y las mutaciones suprimidas son comunes, al
menos en microorganismos. A veces, el aminoácido insertado por el supresor es idéntico al
aminoácido original y la proteína está completamente restaurada. En otros casos, se inserta un
aminoácido diferente y se puede producir una proteína parcialmente activada.

La prueba de Ames

La prueba de Ames (llamada así por el bioquímico Bruce Ames que desarrolló la prueba) hace uso
de la detección de revertantes en grandes poblaciones de bacterias mutantes para probar la
mutagenicidad de sustancias químicas peligrosas. Ames es una prueba para un aumento de
mutaciones en cepas auxotróficas de bacterias (figura 10.6). La prueba Ames prueba mutaciones
en la espalda en lugar de mutaciones (generando auxótrofos del tipo salvaje) porque los
reversores pueden seleccionarse más fácilmente.

Es importante que la cepa auxotrófica utilizada en la prueba de Ames tenga un punto de mutación
para que la tasa de reversión sea medible.

Tales nutrientes (p. Ej., Un aminoácido), e incluso poblaciones de células muy grandes, pueden
extenderse en la placa sin formación de colonias visibles. Sin embargo, si hay reversores (mutantes
de vuelta), esas células forman colonias. Por lo tanto, si se extienden sobre la superficie de una
sola placa, incluso entre 10 y 20 colonias pueden ser detectadas por las 10-20 colonias que forman
(Figura 10.6, foto de la izquierda). Sin embargo, si la tasa de reversión aumenta por la presencia de
un mutágeno químico, el número de colonias revertidas es aún mayor. Después de la incubación
durante la noche, la mutagenicidad del compuesto puede detectarse en el papel (figura 10.6).

Se ha sometido a la prueba Ames una amplia variedad de sustancias químicas, y se ha convertido


en una de las pantallas más útiles para determinar la mutagenicidad potencial de un compuesto.
Dado que algunos mutágenos pueden causar cáncer en animales, la prueba de Ames también sirve
como una forma de detectar posibles carcinógenos.

Tasas de mutación

Para la mayoría de los microorganismos, los errores en la replicación del ADN ocurren a una
frecuencia de 10-6 a 10-7 por mil bases durante una única ronda de replicación. Un gen típico
tiene alrededor de 1000 pares de bases.

Por lo tanto, la frecuencia de una mutación en un gen también está en el rango de 10-6 a 10-7 por
ronda de replicación. Por ejemplo, en un cultivo bacteriano que tiene 108 células / ml, hay varios
mutantes diferentes para cualquier gen dado en cada mililitro de cultivo. Los eucariotas con
genomas muy grandes tienden a tener
Los virus de ADN, especialmente aquellos con genomas muy pequeños, pueden tener de 100 a
1000 veces más que los de los organismos celulares. Los virus de ARN tienen tasas de error aún
mayores debido a una menor corrección de pruebas (Sección 4.6) y la falta de mecanismos de
reparación de ARN.

Los errores únicos de mutación durante la replicación del ADN tienen más probabilidades de
producir mutaciones sin sentido que mutaciones sin sentido porque la mayoría de las
sustituciones individuales producen codones que codifican otros aminoácidos (Tabla 4.5). El tipo
más frecuente de cambios de codones provocado por un cambio de base única conduce a una
mutación silenciosa.

Esto se debe a los codones más diferentes para un aminoácido diferente en la tercera posición
"silenciosa". Un codón dado se puede cambiar a cualquier otro codón por una única sustitución de
base, y en promedio, aproximadamente dos de estos serán mutaciones silenciosas,
aproximadamente uno tiene mutación sin sentido, y el resto serán mutaciones sin sentido.
También hay algunas secuencias de ADN, típicamente secuencias que contienen repeticiones
cortas, que son puntos calientes para las mutaciones debido a que la frecuencia de error de la
ADN polimerasa es relativamente alta allí. La tasa de error de los puntos calientes se ve afectada
por la secuencia de bases en la vecindad.

A menos que sea una mutación, es difícil de medir e incrementa la capacidad del genetista
microbiano para aumentar la eficiencia de la detección de mutaciones. Esto se puede hacer
aumentando el conjunto de mutaciones. Como vemos en la siguiente sección, es posible aumentar
en gran medida la tasa de mutación por tratamiento con agentes mutagénicos. Además, la tasa de
mutación puede cambiar en ciertas situaciones, como en condiciones de alto estrés.

10.4 Mutagénesis

La tasa de mutación espontánea es muy baja, la variedad objetivo de químicos, físicos, y los
agentes biológicos pueden aumentar la tasa de mutación y son, por tanto, para inducir dichas
mutaciones. Estos agentes se denominan mutágenos caducados. Nos Chat revisa algunas de las
principales categorías de mutágenos y sus actividades aquí.

Mutagens químicos
Un resumen de las revisiones algunos de los principales mutágenos químicos y sus modos de
acción se dan en la Tabla 10.2. Existen varias clases de mutágenos químicos. Los análogos de bases
de nucleótidos son moléculas que se asemeja a las bases de purina y pirimidina del ADN en la
estructura todavía mostrar propiedades de apareamiento defectuosos (figura 10.7). Si un análogo
de base se incorpora en el ADN en lugar de la base natural, el ADN puede replicar normalmente la
mayor parte del tiempo. Sin embargo, los errores de replicación de ADN se producen a Superior
tesis frecuencias en el sitio debido a apareamiento de bases incorrecto. El resultado es la
incorporación de una base no coincidentes en la nueva cadena de ADN y por lo tanto la
introducción de una mutación.

Durante la posterior segregación de esta hebra en la división celular, la mutación se revela.

Otros mutágenos químicos inducir modificaciones químicas en una base o Otra, resultante y en el
apareamiento de bases defectuoso o intercambio relacionado (Tabla 10.2). Por ejemplo, agentes
alquilantes (Eso productos químicos reaccionan con amino, carboxilo, y grupos hidroxilo
sustituyendo em con grupos alquilo) tales como nitrosoguanidina son de gran alcance y
mutágenos Generalmente inducir mutaciones en frecuencia más alta que los análogos de base. A
diferencia de los análogos de base, qui-tiene un efecto Sólo cuando se incorpora Durante la
replicación del ADN, agentes alquilantes pueden intercambiar Introducir Incluso En no replicantes
de ADN. Ambos análogos de bases y agentes alquilantes tiende a inducir sustituciones de pares de
bases (Sección 10.2).

Otro grupo de mutágenos químicos, las acridinas, son moléculas planas que funcionan como
agentes de intercalación. Estos mutágenos Hazte Entre insertan dos pares de bases de ADN y
empujan aparte. Durante la replicación, esto puede conducir a la conformación anormal
inserciones de una sola base o deleciones en el ADN que contiene acridina. Por lo tanto, acridinas
Típicamente inducir mutaciones del marco de lectura (Sección 10.2).

El bromuro de etidio, que a menudo se usa para detectar ADN en la electroforesis en gel, también
es un agente intercalante y, por lo tanto, un mutágeno.

radiación

Varias formas de radiación son altamente mutagénicas. Podemos dividir la radiación


electromagnética mutagénica en dos categorías principales, no ionizante e ionizante (Figura 10.8).
Aunque estos tipos de radiación se usan para generar mutaciones, la radiación no ionizante como
la radiación ultravioleta (UV) tiene el uso más amplio.

Las bases de purina y pirimidina de los ácidos nucleicos absorben fuertemente la radiación UV y la
absorción máxima para el ADN y el ARN es a 260 nm. La muerte de las células por radiación UV se
debe principalmente a su efecto sobre el ADN. Aunque se conocen varios efectos, un efecto bien
establecido es la generación de dímeros de pirimidina, qui en dos bases de pirimidina adyacentes
(citosina o timina) en la hebra de Sami de ADN unido covalentemente a convertirse en uno
Another. Esta es una actividad de la ADN polimerasa muy mejorada o aumenta en gran medida la
probabilidad de que la ADN polimerasa malinterprete la secuencia en este punto.

Rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma (figura 10.8). Estos rayos provocan que el agua y otras
sustancias se ionicen, lo que da como resultado la formación de radicales libres tales como
hidroxilo radical, OH · (Sección 5.16). Radicales libres con macromoléculas en la célula, incluido el
ADN. Esto provoca roturas bicatenarias y monocatenarias que pueden provocar reordenamientos
o grandes eliminaciones. A dosis bajas de radiación ionizante, solo se producen unos pocos
"golpes" en el ADN, pero a dosis más altas, los impactos múltiples causan la fragmentación del
ADN que a veces no se puede reparar y por lo tanto conduce a la muerte de la célula.
Reparación de ADN y el Sistema SOS

Por definición, una mutación es un cambio hereditario en el material genético. Por lo tanto, si el
ADN dañado se puede corregir antes de que la célula se divida, no se producirá ninguna mutación.
Las células tienen una variedad de procesos de reparación de ADN diferentes.

Si bien la mayoría de estos sistemas de reparación de ADN están virtualmente libres de errores,
algunos son propensos a errores y el proceso de reparación en sí introduce la mutación. Algunos
tipos de daño en el ADN, especialmente el daño a gran escala de químicos altamente mutagénicos
o grandes dosis de radiación, pueden causar las lesiones que interfieren con la replicación. Si tales
lesiones no se eliminan antes de que ocurra la replicación, la replicación del ADN se detendrá y se
producirán roturas letales en el cromosoma.

La replicación estancada y otros tipos de daños en el ADN activan el sistema de reparación SOS. El
sistema SOS inicia una serie de procesos de reparación de ADN, algunos de los cuales están libres
de errores.

Sin embargo, el sistema SOS también permite que la reparación del ADN ocurra sin una plantilla,
que es, con incorporación aleatoria de dNTP. Como podría esperarse, esto da como resultado
muchos errores y, por lo tanto, muchas mutaciones. Sin embargo, las mutaciones se pueden
detectar en el cromosoma, ya que las mutaciones a menudo se pueden corregir, mientras que las
rupturas cromosómicas generalmente no se pueden corregir.

En Escherichia coli, el sistema de reparación SOS regula la transcripción de aproximadamente 40


genes ubicados en todo el cromosoma que participan en la tolerancia al daño del ADN y la
reparación del ADN. En cuanto a la tolerancia al daño en el ADN, las lesiones de ADN permanecen
en el ADN, pero son superadas por ADN polimerasas especializadas.

Incluso si no hay una plantilla disponible para permitir la inserción de las bases correctas, es
peligroso mantenerla viva. En consecuencia, la síntesis de translesión genera muchos errores. En
E. coli, qui en el proceso de mutagénesis ha-sido estudiado con gran detalle, las dos polimerasas
de reparación propensos a errores son la ADN polimerasa V, una enzima codificada por los genes
umuCD (figura 10.9), y la DNA polimerasa IV, codificada por DinB . Ambos son inducidos como
parte del sistema de reparación SOS.

El sistema SOS está regulado por dos proteínas, LexA y RecA. LexA es un represor que
normalmente impide la expresión del sistema SOS. La proteína RecA, que normalmente funciona
en la recombinación genética (Sección 10.5), se activa por la presencia de daño en el ADN, en
particular por el ADN monocatenario que se replica cuando se detiene la replicación (Figura 10.9).
La forma activada de RecA estimula a LexA a inactivarse mediante la autoescisión. Esto conduce a
la desrepresión del sistema SOS y da como resultado la identificación de varias proteínas que
participan en la reparación del ADN. Debido a que algunos de los mecanismos de reparación del
ADN son intrínsecamente propensos a errores, surgen muchas mutaciones. Una vez que el daño
original del ADN ha sido reparado, el SOS regula es reprimido y cesa la mutagénesis.

Cambios en la tasa de mutaciones y su consecuencia evolutiva

La alta fidelidad (baja frecuencia de error) en la replicación del ADN es esencial para que los
organismos permanezcan genéticamente estables. Por otro lado, la fidelidad perfecta es
contraproducente porque evitaría la evolución. El hecho de que organismos tan filogenéticamente
distantes como Archaea y Bacteria tengan la misma tasa de mutación puede sugerir mutaciones.
Sin embargo, esto no es así. Por ejemplo, los mutantes de algunos organismos que son
hiperactivos en la replicación y reparación del ADN han sido seleccionados en el laboratorio.

Sin embargo, en estas cepas, los mecanismos mejorados de corrección y reparación resultan en un
crecimiento más lento; por lo tanto, la hipercifración mutante podría ser una desventaja en el
entorno natural.

A diferencia de la hiperactividad, algunas agencias se benefician de una mayor tasa de mutación.


Los sistemas de reparación de ADN están genéticamente codificados y, por lo tanto, están sujetos
a mutación. Por ejemplo, la subunidad de proteína de la ADN polimerasa III requerida para la
corrección de pruebas (Sección 4.6) está codificada por dnaQ. Algunas mutaciones en dnaQ
conducen a mutantes que aún son viables, pero que tienen una mayor tasa de mutación. Estas se
conocen como cepas mutantes o mutantes. Se conocen mutaciones que conducen a un fenotipo
de mutador. El fenotipo del mutador se selecciona aparentemente en el entorno complejo y
cambiante porque estas cepas de bacterias con fenotipos mutantes parecen ser más abundantes
en estas condiciones. Presumiblemente, cualquier desventaja es un aumento en la tasa de cambio.
Estas mutaciones aumentan la evolución de la población y hacen que el organismo tenga más
éxito en su nicho ecológico.

Como se indicó anteriormente, un fenotipo de mutador puede ser inducido en cepas de tipo
salvaje por situaciones estresantes. Por ejemplo, el sistema de reparación SOS incluye reparación
propensa a errores. Por lo tanto, cuando se activa el sistema de reparación SOS, la tasa de
mutación aumenta. En algunos casos, esto es simplemente un subproducto inevitable de la
reparación del ADN, pero en otros casos, el aumento de la tasa de cambio puede ser de valor
selectivo para el organismo con fines de supervivencia.

Transferencia génica en bacterias

Los análisis genómicos comparativos de microorganismos estrechamente relacionados que


exhiben diferentes fenotipos han revelado diferencias de genoma distintas. A menudo, estas
diferencias idiosincrásicas resultan de la transferencia horizontal de genes, el movimiento de
genes entre células que no son descendientes directas entre sí (Sección 6.12).

La transferencia horizontal de genes permite a las células adquirir rápidamente nuevas


características e impulsa la diversidad metabólica.

Se conocen tres mecanismos de intercambio genético en procariotas: (1) transformación, en la


que el ADN libre liberado de una célula es absorbido por otra (Sección 10.6); (2) transducción, en
la que la transferencia de ADN está mediada por un virus (Sección 10.7); y (3) conjugación, en la
que la transferencia de ADN requiere contacto de célula a célula
y un plásmido conjugativo en la célula donadora (Secciones 10.8 y 10.9). Estos procesos se
contrastan en la figura 10.10, y debe tenerse en cuenta que la transferencia de ADN ocurre
típicamente en una sola dirección, de donante a receptor.

Antes de discutir los mecanismos de transferencia, consideramos el destino del ADN transferido.
Ya sea que se transfiera por transformación, transducción o conjugación, el ADN que ingresa a la
célula mediante la transferencia horizontal de genes enfrenta tres posibles destinos: (1) Puede ser
degradado por enzimas de restricción; (2) puede replicarse por sí mismo (pero solo si posee su
propio origen de replicación, como un plásmido o genoma de fago); o (3) puede recombinarse con
el cromosoma del huésped.

10.5 Recombinación genética


La recombinación es el intercambio físico de ADN entre elementos genéticos (estructuras que
llevan información genética). En esta sección nos centramos en la recombinación homóloga, un
proceso que da como resultado el intercambio genético entre secuencias de ADN homólogas de
dos fuentes diferentes. Las secuencias de ADN homólogas son aquellas que tienen casi la misma
secuencia; por lo tanto, las bases pueden emparejarse en una longitud extendida de las dos
moléculas de ADN. Este tipo de recombinación impulsa el proceso de "cruzar" en la genética
clásica.
Eventos moleculares en la recombinación homóloga
La proteína RecA, mencionada anteriormente con respecto al sistema de reparación SOS (Sección
10.4 y Figura 10.9), es la clave para la recombinación homóloga. RecA es esencial en casi todas las
vías de recombinación homóloga. Las proteínas similares a RecA se han identificado en todas las
bacterias examinadas, así como en las Archaea y la mayoría de Eukarya.
En la figura 10.11 se muestra un mecanismo molecular para la recombinación homóloga entre dos
moléculas de ADN. Una enzima que corta el ADN en el medio de una cadena, llamada
endonucleasa, comienza el proceso al mellar una cadena de la molécula de ADN del donante. Esta
cadena mellada se separa de la otra cadena por proteínas con actividad helicasa (Sección 4.5). El
segmento monocatenario resultante se une a la proteína de unión monocatenaria (Sección 4.5) y
luego a RecA. Esto da como resultado un complejo que promueve el emparejamiento de bases con
la secuencia complementaria en la molécula de ADN receptora. Este apareamiento de bases a su
vez desplaza a la otra cadena de la molécula de ADN receptora (Figura 10.11) y se denomina
apropiadamente invasión de cadena.
El emparejamiento de bases de una cadena de cada una de las dos moléculas de ADN en tramos
largos genera intermedios de recombinación que contienen regiones heterodúplex largas, donde
cada cadena se ha originado a partir de un cromosoma diferente. Finalmente, las moléculas
ligadas se separan (resuelven) mediante enzimas resolvasa que cortan y vuelven a unirse a las
hebras previamente intactas de ambas moléculas de ADN originales. Dependiendo de la
orientación de la unión durante la resolución, se forman dos tipos de productos, denominados
"parches" o "empalmes", que difieren en la conformación de las regiones heterodúplex restantes
después de la resolución (figura 10.11).
Efecto de la recombinación homóloga sobre el genotipo

Para que la recombinación homóloga genere nuevos genotipos, las dos secuencias homólogas
deben estar relacionadas, pero genéticamente distintas. Este es obviamente el caso en una célula
diploide eucariótica, que tiene dos conjuntos de cromosomas, uno de cada padre. En
las procariotas, moléculas de ADN genéticamente distintas pero homólogas se unen de diferentes
maneras. La recombinación genética en procariotas ocurre después de que los fragmentos de ADN
homólogo de un cromosoma donante se transfieren a una célula receptora mediante
transformación, transducción o conjugación. Solo después del evento de transferencia, cuando el
fragmento de ADN del donante está en la célula receptora, se produce la recombinación
homóloga. En procariotas, solo se transfiere parte de un cromosoma; por lo tanto, si no se
produce la recombinación, el fragmento de ADN se perderá porque no puede replicarse
independientemente. Por lo tanto, en procariotas, la transferencia es solo el primer paso en la
generación de organismos recombinantes.

Para detectar el intercambio físico de segmentos de ADN, las células resultantes de la


recombinación deben ser fenotípicamente diferentes de ambos padres (Figura 10.12). Los cruces
genéticos en bacterias generalmente dependen del uso de cepas receptoras que carecen de algún
carácter seleccionable que los recombinantes obtendrán. Por ejemplo, el destinatario puede ser
incapaz de crecer en un medio particular, y se pueden seleccionar recombinantes genéticos que sí
lo hacen. Varios tipos de marcadores seleccionables, como la resistencia a los medicamentos y los
requisitos nutricionales, se discutieron en la Sección 10.1. La sensibilidad extremadamente grande
del proceso de selección permite detectar incluso algunas células recombinantes en una gran
población de células no recombinantes y, por lo tanto, la selección es una herramienta importante
para el genetista microbiano.

Complementación

En los tres métodos de transferencia génica bacteriana, solo una porción del cromosoma del
donante ingresa a la célula receptora. Por lo tanto, a menos que la recombinación tenga lugar con
el cromosoma receptor, el ADN del donante se perderá porque no puede replicarse
independientemente en el receptor. No obstante, es posible mantener establemente un estado de
diploidia parcial para su uso en el análisis genético bacteriano.

Una cepa bacteriana que porta dos copias de un segmento cromosómico en particular se conoce
como diploide parcial o merodiploide.

En general, una copia está presente en el cromosoma mismo y la segunda copia en otro elemento
genético, como un plásmido o un bacteriófago.

En consecuencia, si la copia cromosómica de un gen es defectuosa debido a una mutación, es


posible suministrar una copia funcional (de tipo salvaje) del gen en un plásmido o fago. Por
ejemplo, si uno de los genes para la biosíntesis del aminoácido triptófano tiene una mutación que
da como resultado una enzima no funcional, esto dará un fenotipo Trp. Es decir, la cepa mutante
será un auxótrofo de triptófano y requerirá triptófano para el crecimiento. Sin embargo, si se
introduce una copia del gen de tipo salvaje en la misma célula en un plásmido o genoma viral, este
gen codificará la proteína necesaria y restaurará el fenotipo de tipo salvaje. Este proceso se llama
complementación porque se dice que el gen de tipo salvaje complementa la mutación, en este
caso convirtiendo la célula Trp en Trp + (Figura 10.12).
10.6 Transformación
La transformación es un proceso de transferencia genética por el cual el ADN libre se incorpora a
una célula receptora y produce un cambio genético.
Varios procariotas son naturalmente transformables, incluidas ciertas especies de Bacterias gram-
negativas y Gram-positivas y también algunas especies de Archaea (Sección 10.10). Debido a que
el ADN de los procariotas está presente en la célula como una sola molécula grande, cuando una
célula se lisa suavemente, su ADN se derrama. Los cromosomas bacterianos se rompen fácilmente
debido a su longitud extrema (1700 μm en Bacillus subtilis, por ejemplo). Incluso después de una
extracción suave, el cromosoma B. subtilis de 4,2 pares de megabases se convierte en fragmentos
de aproximadamente 10 pares de kilobases cada uno. Debido a que el ADN que corresponde a un
gen promedio es de aproximadamente 1000 nucleótidos, cada uno de los fragmentos del ADN de
B. subtilis contiene aproximadamente diez genes. Este es un tamaño transformable típico. Una
sola célula generalmente incorpora solo uno o algunos fragmentos de ADN, por lo que solo una
pequeña proporción de los genes de una célula puede transferirse a otra en un solo evento de
transformación.

Competencia en Transformación

Se dice que una célula que puede absorber ADN y transformarse es competente, y esta capacidad
está determinada genéticamente. La competencia en la mayoría de las bacterias naturalmente
transformables está regulada, y las proteínas especiales desempeñan un papel en la captación y el
procesamiento del ADN. Estas proteínas específicas de competencia incluyen una proteína de
unión a ADN asociada a membrana, una autolisina de pared celular y varias nucleasas. Una vía de
competencia natural en B. subtilis -una especie fácilmente transformable- está regulada por la
detección de quórum, un sistema regulador que responde a la densidad celular (Sección 7.9).

Las células producen y excretan un pequeño péptido durante el crecimiento, y la acumulación de


este péptido a altas concentraciones induce a las células a ser competentes. Pero no todas las
células se vuelven competentes.

En Bacillus, aproximadamente el 20% de las células en un cultivo se vuelven competentes y


permanecen así durante varias horas. Sin embargo, en Streptococcus, el 100% de las células
pueden llegar a ser competentes, pero solo durante un breve período durante el ciclo de
crecimiento.

La transformación natural de alta eficiencia es rara entre las bacterias.


Por ejemplo, Acinetobacter, Bacillus, Streptococcus, Haemophilus, Neisseria y Thermus son
naturalmente competentes y fáciles de transformar.

Por el contrario, muchas bacterias se transforman mal, si es que lo hacen, en condiciones


naturales. Por ejemplo, Escherichia coli y muchas otras bacterias gramnegativas entran en esta
categoría. Sin embargo, si las células de E. coli se tratan con altas concentraciones de Ca2 + y
luego enfriados, se vuelven adecuadamente competentes. Las células tratadas de esta manera
absorben ADN bicatenario y, por lo tanto, la transformación de E. coli por ADN plasmídico puede
ser relativamente eficaz.

Esto es importante porque el ADN en E. coli -el caballo de batalla de la ingeniería genética- es
crítico para la biotecnología, como veremos en el Capítulo 11.
La electroporación es una técnica física que se utiliza para llevar el ADN a organismos que son
difíciles de transformar, especialmente aquellos con paredes celulares gruesas. En la
electroporación, las células se mezclan con ADN y luego se exponen a breves pulsos eléctricos de
alto voltaje. Esto hace que la envoltura celular sea permeable y permite la entrada del ADN.

La electroporación es un proceso rápido y funciona para la mayoría de los tipos de células,


incluidas E. coli, la mayoría de las otras bacterias, algunos miembros de Archaea e incluso
levaduras y ciertas células vegetales.

Captación de ADN en transformación

Durante la transformación natural, las bacterias competentes se unen de forma reversible al ADN.
Pronto, sin embargo, la unión se vuelve irreversible.

Las células competentes unen mucho más ADN que las células no competentes, tanto como 1000
veces más. Como se señaló anteriormente, los tamaños de los fragmentos transformantes son
mucho menores que los del genoma completo, y los fragmentos se degradan aún más durante el
proceso de captación. En Streptococcus pneumoniae, cada célula puede unir solo unas diez
moléculas de ADN bicatenario de 10-15 kbp cada una. Sin embargo, a medida que estos
fragmentos se incorporan, se convierten en piezas monocatenarias de aproximadamente 8 kb,
degradando la cadena complementaria. Los fragmentos de ADN en la mezcla compiten entre sí
por la captación y, por lo tanto, disminuye la probabilidad de que un transformante tome ADN que
confiere una ventaja o un marcador seleccionable.

Curiosamente, la transformación en Haemophilus influenzae requiere que el fragmento de ADN


tenga una secuencia particular de 11 pb para que se produzca la unión y captación irreversible.
Esta secuencia se encuentra a una frecuencia inesperadamente alta en el genoma de
Haemophilus. Pruebas como esta, y el hecho de que ciertas bacterias se vuelven competentes en
su entorno natural, sugiere que la transformación no es un artefacto de laboratorio, sino que
juega un papel importante en la transferencia horizontal de genes en la naturaleza. Al promover
nuevas combinaciones de genes, las bacterias naturalmente transformables aumentan la
diversidad y la aptitud de la comunidad microbiana como un todo.
Integración de ADN transformante
Durante la transformación, el ADN transformante se une a la superficie de la célula mediante una
proteína de unión al ADN (Figura 10.13). A continuación, se toma todo el fragmento bicatenario, o
una nucleasa degrada una cadena y la cadena restante se absorbe, dependiendo del organismo.
Después de la absorción, el ADN está unido a una proteína específica de la competencia. Esto
protege al ADN del ataque de la nucleasa hasta que alcanza el cromosoma, donde la RecAproteína
toma el control. El ADN se integra en el genoma del receptor por recombinación (Figuras 10.13 y
10.11). Si se integra ADN de cadena simple, se forma un ADN heterodúplex.
Durante la siguiente ronda de replicación cromosómica, se generan una molécula de ADN parental
y una recombinante. En la segregación en la división celular, la molécula recombinante está
presente en la célula transformada, que ahora está genéticamente alterada en comparación con
su padre. Lo anterior se aplica solo a pequeñas piezas de ADN lineal. Muchas bacterias
naturalmente transformables se transforman solo deficientemente por ADN de plásmido porque
el plásmido debe permanecer bicatenario y circular para poder replicarse.
10.7 Transducción

En la transducción, un virus bacteriano (bacteriófago) transfiere ADN de una célula a otra. Los
virus pueden transferir genes del hospedador de dos maneras. En la primera, llamada
transducción generalizada, el ADN se deriva de la presencia del virus en el genoma. En el segundo,
llamado transducción especializada, el ADN de una región específica del cromosoma se integra
directamente en el genoma del virus, generalmente reemplazando algunos de los genes del virus.
Esto ocurre solo con ciertos virus templados como el fago lambda (Sección 8.8).
En la transducción generalizada, los genes del donante bacteriano no pueden replicarse de forma
independiente y no son parte de un genoma viral.

Por lo tanto, a menos que los genes donantes se recombinen con el cromosoma bacteriano
receptor, se perderán. En la transducción especializada, la recombinación homóloga también
puede ocurrir. Sin embargo, dado que el ADN bacteriano del donante es en realidad una parte del
genoma del fago, puede integrarse en el cromosoma del huésped durante la lisogenia (Sección
8.8).

Transducción se produce en una variedad de bacterias, incluyendo los géneros Desulfovibrio,


Escherichia, Pseudomonas, Rhodococcus, Rhodobacter, Salmonella, Staphylococcus, y
Xanthobacter, así como thermautotrophicus Methanothermobacter, una especie de Archaea. No
todos los fagos pueden transducir, y no todas las bacterias son transducibles, apuntar con
abundancia bacteriófago estimado a superar en número a las células procariotas por 10 veces en
la naturaleza del fenómeno juega un papel significativo en la transferencia de genes años en el
medio ambiente.

Ejemplos de genes transferidos por transducción de bacteriófagos incluyen múltiples genes de


resistencia a antibióticos entre las cepas de Salmonella enterica serovar Typhimurium, genes de la
toxina Shiga-como en Escherichia coli, Vibrio cholerae factores de virulencia en, y los genes que
codifican proteínas en cianobacterias fotosintéticas.
Mientras que la transducción juega un papel en la transferencia horizontal de ADN en la
naturaleza, los genetistas microbianas utilizan y Specialized Tanto generalizarse fagos
transductores para suministrar ADN a las células diana bacterianas. La transducción puede usarse
para suministrar ADN a cepas en las que la transformación y la conjugación no son eficaces. Los
bacteriófagos también se pueden usar para administrar grandes pedazos de ADN a las células
hospedadoras. Un fago de cola típico que contiene ADN bicatenario puede empaquetar hasta 40
pares de kilobases de ADN. Los bacteriófagos utilizados para la transducción en el laboratorio
suelen ser no líticos porque tienen todos los genes virales necesarios. Para seleccionar un evento
de transducción, el fago transductor debe ser un marcador seleccionable.

Transducción Generalizada

En la transducción generalizada, el cromosoma puede transferirse al receptor, formando un


transductor.

La transducción generalizada se investigó por primera vez y se estudió ampliamente en la bacteria


Salmonella enterica con el fago P22 y se ha estudiado con el fago P1 en Escherichia coli. Un
ejemplo de cómo se forman las partículas transductoras Figura 10.14.
Cuando una célula bacteriana está infectada con un fago, el ciclo lítico puede ocurrir.

Sin embargo, durante la infección lítica, la enzima responsable del empaquetamiento del ADN viral
en el bacteriófago El resultado se llama partícula transductora.

Estos no pueden conducir a una infección viral porque no contienen ADN viral y se dice que son
defectuosos. Una de la lisis celular, las partículas de transducción se liberan junto con viriones
normales que contienen el genoma del virus.
Por lo tanto, el lisado contiene una mezcla de viriones normales y partículas transductoras.

Cuando se utiliza este lisado para infectar una población de células receptoras, la mayoría de las
células están infectadas con el virus de la normalidad. Sin embargo, una pequeña proporción de la
población recibe la transducción de partículas inyecta el ADN que envasan de la bacteria huésped
anterior.

Aunque esto no puede replicar el ADN, puede recombinarse con el ADN (Sección 10.5) del nuevo
huésped. Debido a que sólo una pequeña proporción de las partículas en el lisado son
defectuosos, y cada uno de estos contiene sólo un pequeño fragmento de ADN del donante, la
probabilidad de una partícula de transducción dada que contiene un gen particular es bastante
bajo. Típicamente, solo se transduce aproximadamente 1 célula de 106 a 108 para un gen dado.

Lisogenia y transducción especializada

transducción generalizada permite la transferencia de cualquier gen de una bacteria a otra


Críticas, baja frecuencia a la meta. En contraste, la transducción especializada Permite la
transferencia extremadamente eficiente, las transferencias objetivo es selectivo y sólo una
pequeña zona del cromosoma bacteriano.

En el primer cuadro de la transducción especializada para ser descubierto, genes galactosa para el
catabolismo fueron transducidas por el fago lambda templado de E. coli.

Cuando lambda lysogenizes una célula huésped, el genoma del fago se integra en el cromosoma
de E. coli en un sitio web específico (Sección 8.8). Este sitio está al lado del grupo de genes que
codifican las enzimas para la utilización de galactosa. Después de la inserción, la replicación del
ADN viral está bajo el control del cromosoma bacteriano del huésped.

Tras la inducción, el ADN viral se separa del ADN huésped en un proceso que es el inverso de la
integración (Figura 10.15). Por lo general, el ADN lambda se escinde exactamente, bebió de vez en
cuando el genoma del fago se escinde incorrectamente. Algunos de los genes bacterianos
adyacentes a un lado de la profago (por ejemplo, el operón galactosa) se cortan junto con el ADN
del fago. Al mismo tiempo, algunos genes de fagos quedan atrás (Figura 10.15b). Esta partícula
transductora puede transferirse posteriormente a galactosa. Esta transferencia sólo se puede
detectar si una cepa galactosa negativo (Gal) está infectado con Tal partícula de transducción y Gal
+ se seleccionan transductantes.

Para una lambda sea virión infeccioso, existe un límite a la cantidad de ADN de fago que puede ser
reemplazado con ADN del huésped. ADN de fago suficiente deben ser retenidos para codificar la
proteína de cubierta de fago y otras proteínas necesarias para la lisis del fago y lysogeny. Sin
embargo, si un fago auxiliar se utiliza junto con un fago defectuoso en una infección mixta,
entonces ahora se necesitan menos genes de fagos específicos en el fago defectuoso. Sólo el área
att (fijación), el sitio cos (extremos cohesivos, para el envasado), y el origen de replicación del
genoma de lambda (Figura 8.17a) son considera.

Conversión de fagos

La alteración del fenotipo de una célula huésped por lisogenización se llama conversión de fagos.
Cuando un fago de fago normal (es decir, no defectuoso) se lisogeniza a una célula y se convierte
en profago, la célula se vuelve inmune a una infección posterior por el mismo tipo de fago.

Dicha inmunidad se puede considerar como un cambio en el fenotipo. Sin embargo, a menudo se
observan otros cambios fenotípicos no relacionados con la inmunidad del fago en la conversión
del fago de las células lisogenizadas.

Dos cajas de conversión de fagos han sido especialmente bien estudiadas. Uno da como resultado
una estructura de un polisacárido en la superficie celular de Salmonella enterica serovar Anatum
en la lisogenización con bacteriófago ε15. El segundo resultado en la conversión de las cepas no
productoras de toxinas de Corynebacterium difteria (la bacteria que causa la difteria enfermedad)
a las cepas productoras de toxinas (patógenos) Siguiendo lysogeny con β bacteriófago (Sección
29.3). En ambos casos, los genes responsables de los cambios son una parte integral del genoma
del fago y, por lo tanto, se transmiten a la célula por fagos y lisogenización.

La lisogenia no se puede evitar debido a su alta susceptibilidad a la infección. La conversión de


fagos también puede tener una importancia evolutiva considerable porque da como resultado la
alteración genética de las células huésped.

Muchas bacterias aisladas de la naturaleza son lisógenos naturales y, por lo tanto, es probable que
la lisogenia sea esencial para la supervivencia de muchas especies en la naturaleza.

CRISPR
10.12 Conservando la Integridad del Genoma:
Interferencia CRISPR

Bacteria y Archaea no solo producen endonucleasas de restricción (Secciones 8.6 y 11.1) que
funcionan para destruir el ADN extraño que ingresa, también tienen un programa de defensa
basado en ARN para destruir el ADN invasor de la infección viral y algunas veces la conjugación.

Este tipo de "sistema inmune" procariótico ayuda a preservar la estabilidad del genoma y se llama
sistema CRISPR, que significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regulares e
interespaciadas.
La región CRISPR en el cromosoma bacteriano es esencialmente un banco de memoria de
secuencias de ácido nucleico entrantes usadas para vigilancia contra ADN extraño. Consiste en
muchos segmentos diferentes de ADN extraño llamados espaciadores que se alternan con
secuencias idénticas repetidas (figura 10.28). Las secuencias espaciadoras corresponden a
fragmentos de ADN extraño que previamente han invadido la célula. Una vez que los espaciadores
se recombinan en la región CRISPR, el sistema proporciona resistencia a cualquier ADN entrante (y
a veces ARN) que contiene las mismas secuencias o muy estrechamente relacionadas con regiones
espaciadoras individuales. Las proteínas del sistema CRISPR llevan a cabo funciones esenciales de
esta "inmunidad" basada en ARN.

Las proteínas del sistema CRISPR (proteínas asociadas a CRISPR o proteínas Cas) desempeñan dos
funciones. Algunos participan en la obtención y almacenamiento de segmentos de ADN extraño
como espaciadores mediante el reconocimiento de secuencias de nucleótidos específicas
asociadas con los espaciadores. Otros usan la información almacenada de la secuencia para
reconocer el ADN intruso y destruirlo. Las propias proteínas Cas están codificadas por genes que
se encuentran aguas arriba de las secuencias de ADN de CRISPR (figura 10.28).

La región CRISPR se transcribe como un todo en una molécula larga de ARN que luego se escinde
en el medio de cada una de las secuencias repetidas mediante la actividad nucleasa de las
proteínas Cas. Esto convierte la molécula larga de ARN en segmentos espaciadores de pequeños
ARN llamados ARN CRISPR (ARNcr). Si uno de estos pares de bases de los ARNcr con ácido nucleico
invasor, el ADN o ARN extraño es destruido por la actividad nucleasa de otras proteínas Cas.

El sistema CRISPR está ampliamente distribuido tanto en Archaea como en Bacteria.


Aproximadamente el 90% de los genomas secuenciados de Archaea y el 70% de los de Bacteria
poseen el sistema CRISPR.

La utilidad del sistema se demostró por primera vez en la industria láctea, donde los cultivos
iniciadores utilizados para la fermentación de la leche son susceptibles a la infección desenfrenada
de bacteriófagos. Sin embargo, se encontró que una cepa de Streptococcus thermophilus era
resistente a un bacteriófago virulento. La diferencia entre esta cepa de S. thermophilus y aquellos
susceptibles a la infección viral fue sus espaciadores dentro de la región CRISPR. Si bien se
desconoce por qué algunos virus no son atacados por el sistema CRISPR, los experimentos de
laboratorio han demostrado que los bacteriófagos pueden superar el reconocimiento por las
proteínas Cas y los ARNcr modificando su genoma a través de la mutación.

La tecnología CRISPR es una reciente herramienta de edición del genoma que actúa como unas
tijeras moleculares capaces de cortar cualquier secuencia de ADN del genoma de forma específica
y permitir la inserción de cambios en la misma.
Los años setenta marcaron el inicio de la Era de la Ingeniería Genética, en la que importantes
hitos, como la producción de insulina a partir de Escherichia coli o la utilización de ratones
transgénicos en el estudio de enfermedades humanas, cambiaron el curso de la medicina. Sin
embargo, los métodos utilizados no dejaban de ser imprecisos y difíciles de aplicar a gran escala,
resultando en experimentos complicados y costosos.
En el transcurso de las últimas décadas, los investigadores se han centrado en superar dichas
limitaciones con el objetivo de desarrollar un mecanismo de edición genómica capaz de generar
numerosos cambios en el genoma de una célula de forma coordinada y precisa. A día de hoy, las
estrategias empleadas en los laboratorios para manipular, de forma específica y directa,
secuencias del genoma de organismos vivos son dispares. Entre las herramientas actuales,
destacan las nucleasas de dedos de zinc (ZFN), las nucleasas tipo activadores de transcripción
(TALEN) y las revolucionarias nucleasas de secuencias palindrómicas repetidas inversas (CRISPR-
Cas). Las dos primeras están basadas en proteínas constituidas por una región de catalítica de
escisión del ADN y una región guía de reconocimiento del gen diana que se quiere manipular. Las
TALENs son más fáciles de diseñar que las ZFN. No obstante, ambas resultan difíciles de
administrar en las células debido a su tamaño, complicando la capacidad de generar múltiples
cambios genéticos simultáneos. Por lo contrario, CRISPR-Cas ofrece a los científicos la posibilidad
de cambiar una secuencia de ADN de una forma más fácil, rápida y precisa en diferentes puntos
concretos del genoma dentro de un organismo vivo.
El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo de defensa empleado por algunas bacterias para eliminar
virus o plásmidos invasivos. Dicho sistema consta de un componente proteico Cas9 con actividad
de nucleasa, que corta el ADN, y un ARN, conocido como ARN guía, que dirige al anterior dominio
catalítico hacia la secuencia de ADN que se quiere editar.
El proceso de edición genómica con CRISPR-Cas9 incluye dos pasos. En una primera etapa, el ARN
guía, complementario a la región del ADN que se quiere modificar y sintetizado previamente, se
asocia con la enzima Cas9. Además, gracias a las reglas de complementariedad de nucleótidos, el
ARN hibrida con la secuencia de interés presente en el genoma, dirigiendo a la endonucleasa Cas9
a cortar el ADN en la región concreta. En la segunda etapa se activan los mecanismos naturales de
reparación del ADN fragmentado. Esta reparación resulta en algunos casos, en la aparición de
mutaciones de inserción o deleción, que si están localizadas dentro de un gen pueden dar lugar a
la pérdida de producción de la proteína que codifica. Así, una posible aplicación es la de inhabilitar
genes.
Si se proporciona a la célula una molécula de ADN que sirva como molde durante la reparación, a
la que se ha añadido un cambio, la célula lo copiará y el cambio quedará incorporado en el ADN.
Esta otra aplicación, la introducción de cambios específicos en posiciones concretas supone uno de
los aspectos más prometedores de la técnica, ya que permitiría corregir errores en los genes
responsables de causar enfermedades.
Además, el sistema también puede ser utilizado para regular la expresión génica, o incluso para
introducir modificaciones epigenéticas, inactivando la actividad nucleasa de Cas9 e incorporándole
un módulos que interaccionen con elementos reguladores de la expresión génica o capaces de
llevar a cabo cambios en metilación o modificaciones de las histonas.
El desarrollo de la tecnología CRISPR-Cas ha inaugurado una nueva era para la ingeniería genética
en la que se puede editar, corregir y alterar el genoma de cualquier célula de una manera fácil,
rápida, barata y altamente precisa.
RESUMEN BROCK

Mutación: Cambio hereditario en la secuencia de ADN; puede conducir a un cambio en el fenotipo.


Mutaciones seleccionables: Aquellas que le dan al mutante una ventaja de crecimiento bajo
ciertas condiciones ambientales y son particularmente útiles en la investigación genética.
Si la selección no es posible, los mutantes se deben identificar mediante cribado.

Mutaciones espontáneas o inducidas, se encuentran en la secuencia de bases del ácido nucleico


en un genoma.
Mutación puntual: Único cambio de pares de bases.
Mutación sin sentido: Codón se convierte en un codón de parada y se produce un polipéptido
incompleto.
Deleciones e inserciones: causan cambios más drásticos en el ADN, incluidas las mutaciones del
marco de lectura que a menudo resultan en la pérdida completa de la función del gen.

Diferentes tipos de mutaciones a diferentes frecuencias. Para una bacteria típica, se observan
tasas de mutación de 10-6 a 10-7 por kilobase. Aunque las polimerasas de ARN y ADN constituyen
la misma velocidad, los genomas de ARN generalmente acumulan mutaciones a frecuencias
mucho más altas que los genomas de ADN.

Mutágenos: Agentes químicos, físicos o biológicos que aumentan la tasa de mutación. Los
mutágenos pueden alterar el ADN de muchas maneras diferentes. Sin embargo, las alteraciones en
el ADN no son mutaciones a menos que se hereden. Algunos daños en el ADN pueden repararse y
existen sistemas de reparación de ADN propensos a errores y de alta fidelidad.

Recombinación homóloga ocurre cuando secuencias de ADN estrechamente relacionadas se


separan en un solo elemento. La recombinación es un proceso evolutivo importante, y las células
tienen mecanismos específicos para garantizar que tenga lugar la recombinación.

10.6 • Ciertos procariotas de competencia, un estado en el cual las células pueden ser liberadas
por otras bacterias. Incorporación del ADN del donante en un receptor de proteína de unión
monocatenaria, proteína RecA y varias otras enzimas. Solo las células competentes son
transformables.

10.7 La transducción es la transferencia de genes del huésped de una bacteria a otra por un virus
bacteriano. En la transducción generalizada, los virus defectuosos son fragmentos incorporados al
azar de la célula de ADN cromosómico, pero la eficacia de transducción es baja. En la transducción
especializada, el ADN de un virus templado elimina de manera incorrecta y lleva consigo genes
hospedadores adyacentes; la eficiencia de transducción aquí puede ser muy alta.

10.8 • La conjugación es un mecanismo de transferencia de ADN en procariotas que requiere


contacto de célula a célula. La conjugación está controlada por genes por ciertos plásmidos (como
el plásmido) y requiere la transferencia del plásmido de una célula donante a una célula receptora.
La transferencia de ADN plásmido requiere replicación usando el mecanismo de círculo rodante.

10.9 • El cromosoma de la célula del donante se puede movilizar para una célula receptora. Esto
requiere que un plásmido se integre en el cromosoma para formar el fenotipo. Debido a que el
cromosoma raramente está completo, las células receptoras rara vez se vuelven F +. Los plásmidos
han integrado previamente plásmidos que han sido extirpados y capturados por algunos genes
cromosómicos.

10.10 • La investigación arqueológica va a la zaga de la investigación bacteriana en el desarrollo de


sistemas para la transferencia de genes. Muchos antibióticos son ineficaces contra Archaea, lo que
dificulta la selección efectiva de recombinantes. Las inusuales condiciones de crecimiento que
necesitan muchas Archaea también dificultan la experimentación genética. Sin embargo, los
sistemas de transferencia genética de transformación, transducción y conjugación de bacterias son
conocidos en Archaea.

10.11 • Los transposones y las secuencias de inserción son elementos genéticos que pueden
moverse de un lugar a otro por transposición. La transposición puede ser oro replicativo o
conservador. Los transposones a menudo portan genes que codifican resistencia a antibióticos y
pueden usarse como mutágenos biológicos.

10.12 El sistema CRISPR es un mecanismo basado en ARN para proteger el genoma procariota del
ADN invasor resultante de la infección y la conjugación. Si las secuencias de ARN pequeñas
resultantes de las regiones de región CRISPR de la región, la proteína descompone el dúplex de
ácido nucleico.

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