Professional Documents
Culture Documents
Mutación silenciosa: Cambio en el nivel de ADN que no da como resultado ningún cambio
de aminoácido en la proteína codificada.
Puede codificar para un aminoácido.
Mutación sin sentido en el codón que codifica un aminoácido de cambio para un codón de
término (por ejemplo, TAG [timidina-adenina-guanina]).
Pequeña eliminación o inserción que no está en múltiplos de tres produce una mutación
de cambio de marco de lectura
Generalmente conduce a un péptido inútil y al truncamiento prematuro de la proteína.
Mutaciones nulas, que destruye completamente la función, donde hay una inserción
extensa, eliminación o reajuste grueso de la estructura del cromosoma. La inserción de
largas secuencias de ADN por recombinación, por transposición o durante la ingeniería
genética puede producir mutaciones nulas al separar las partes de un gen e inactivar el
gen.
Muchas mutaciones ocurren de manera espontánea en la naturaleza (p. Ej., Por errores de
la polimerasa); sin embargo, agentes físicos o químicos también puede inducir
mutaciones.
1. La reparación directa del ADN es la eliminación enzimática del daño, como los dímeros
de pirimidina y las bases alquiladas.
4. La respuesta SOS es la inducción de muchos genes (≈15) después del daño del ADN o la
interrupción de la replicación del ADN para promover la recombinación o la reparación
propensa a errores.
Los bacteriófagos son virus bacterianos con un genoma de ADN o ARN generalmente
protegidos por una membrana o capa proteica.
Estos elementos genéticos extracromosómicos pueden sobrevivir fuera de una célula. Los
bacteriófagos infectan las células bacterianas y para replicar Cualquiera de los números de
ancho y hace que la célula de lisar oro (infección lítica), en algunos casos, integrarse en el
genoma del huésped sin matar al host (el estado lisogénico), tales como la E. coli
bacteriófago lambda. Algunos bacteriófagos lisogénicos portan genes de toxinas (por
ejemplo, Corynephage beta lleva el gen para la toxina diftérica). El bacteriófago lambda
permanece lisogénico siempre que se sintetice una proteína represora e impida que el
genoma del fago se desintegre con el fin de replicarse y salir de la célula. El daño a la
célula anfitriona es una proteína que es una señal de que la célula anfitriona no es
saludable y ya no es un buen lugar para la "carga libre".
Los transposones (saltando genes) son elementos genéticos móviles (Figura 13-11) que
puede transferir ADN dentro de una célula, de una posición a otra críticas en el genoma,
diferentes moléculas Entre de oro de ADN (por ejemplo, plásmido de plásmido o plásmido
en el cromosoma). Los transposones están presentes en procariotas y eucariotas. Los
transposones más simples se denominan secuencias de inserción expirado y gama de
longitud 150-1500 base de pares, con repeticiones invertidas de 15 a 40 pares base en sus
extremos y la información genética mínima necesario para su propia transferencia (es
decir, el gen que codifica la transposasa) .
Los transposones complejos llevan otros genes, como los genes que proporcionan
resistencia contra los antibióticos. Los transposones algunas veces se insertan en genes e
inactivan esos genes. Si la inserción y la inactivación ocurren en una proteína esencial
codificada, la célula muere.
Figura 13-12: (1) Transformación, que es una absorción activa e incorporación de ADN
exógeno o extraño, (2) conjugación, que es el oro de apareamiento -sexual cuasi
intercambio de información genética de una bacteria (el donante) a Comentarios otra
bacteria (el recipiente), oro (3) transducción, qui es la transferencia de la información
genética de una bacteria a Another por un bacteriófago. Una vez dentro de una célula, un
transposón puede saltar entre diferentes moléculas de ADN (por ejemplo, plásmido a
plásmido o plásmido a cromosoma). Varios de estos mecanismos contribuyeron a la
generación de Staphylococcus aureus resistente a la vancomicina (figura 13-13 y cuadro
13-2).
transformación
conjugación
El ADN está conjugado por una doble hélice pero una molécula monocatenaria. La
movilización comienza cuando una proteína codificada por un plásmido realiza una
escisión con hebra única específica de sitio en el oriT. El nick inicia la replicación del círculo
rodante, y el filamento lineal desplazado se dirige a la célula receptora. El ADN
monocatenario transferido se recirculariza y su cadena complementaria se sintetiza.
La conjugación resulta de la secuencia del plásmido y de una parte del ADN cromosómico
bacteriano. Debido a la conexión frágil entre los compañeros de apareamiento, la
transferencia generalmente se aborta antes de completarse, de modo que solo se
transfieren las secuencias cromosómicas adyacentes a la F integrada. La disrupción
artificial de un apareamiento entre un HFR y un par F ha sido útil en la construcción de
una secuencia de ADN cromosómico de E. coli. En dichos mapas, la posición de cada gen
se da en minutos (en base a 100 minutos para la transferencia completa a 37 ° C), de
acuerdo con su tiempo de entrada a un contenedor.
transducción
recombinación
La incorporación de ADN extracromosómico (extraño) en el cromosoma se produce por
recombinación. Hay dos tipos de recombinación: homóloga y no homóloga.
Ingeniería genética
La mayoría de los vectores han de clonación sido "ingeniería" para tener un sitio web para
la inserción de ADN extraño, tiene moyen de selección de las bacterias que-han
incorporado Cualquier plásmido (por ejemplo, resistencia a antibióticos), y tiene moyen
de distinguir las bacterias que-han incorporado Esos plásmidos Eso contener ADN
insertado Los vectores de expresión tienen secuencias de ADN para facilitar su replicación
en bacterias y células eucariotas y la transcripción del gen en ARNm.
El ADN para ser clonado puede obtenerse por purificación de ADN cromosómico a partir
de células, virus, u otros plásmidos o por amplificación selectiva de secuencias de ADN por
un técnico conocido como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (PCR más Top se
explica en el capítulo 5). Tanto el vector como el ADN extraño se escinden con enzimas de
restricción (véase la figura 13-14).
Las enzimas de restricción reconoce una secuencia palindrómica específica y haga un corte
escalonado que genera extremos cohesivos corte embotado oro que genera extremos
romos (véase la Tabla 13-1).
La mayoría de los vectores de clonación tienen una secuencia llamada sitio de clonación
múltiple que puede escindirse por muchas enzimas de restricción.
Ligación del vector con la molécula de ADN recombinante de ADN general, que es capaz
de replicar la secuencia insertada. El número total de vectores recombinantes obtenidos
cuando se clonan todos los fragmentos que resultan de la escisión del ADN cromosómico
es una biblioteca genómica. Alternativa Un enfoque para la clonación del gen de una
proteína es usar una enzima de retrovirus llamada transcriptasa inversa caducado (RNA-
polimerasa dependiente de ADN) para convertir el ARNm en la célula en un ADN
complementario (ADNc). Una biblioteca de ADNc representa los genes que se expresan
como ARNm en una célula particular.
La biblioteca puede explorarse luego para encontrar un clon de E. coli que posee el
fragmento de ADN deseado. Se pueden usar diversas técnicas de detección para
identificar las bacterias con el ADN recombinante apropiado. La clonación múltiple
el sitio usado para insertar el ADN extraño a menudo es parte del gen lacZ del operón lac.
La inserción del ADN extraño en el gen lacZ inactiva el gen (que actúa casi como un
transposón) y evita la síntesis plásmido dirigida de β-galactosidasa en la célula receptora,
los resultados qui en blanco colonias bacterianas en vez de colonias de color azul si ß-
galactosidasa se producido y capaz de dividir un cromóforo apropiado.
La ingeniería genética ha-ha utilizado para aislar y expresar los genes de las proteínas
útiles, tales como la insulina, interferón, hormona del crecimiento, interleucina y en
bacterias, levaduras, células de insecto o impar. De forma similar, se pueden preparar
grandes cantidades de inmunógeno puro para una vacuna sin la necesidad de trabajar con
los organismos patógenos intactos.
MUTACIONES (BROCK)
Todos los organismos contienen una secuencia específica de bases de nucleótidos en su genoma,
su modelo genético. Una mutación es un cambio hereditario en la secuencia de bases de ese
genoma, que es un cambio que pasa de la célula madre a las células de la progenie. Las
mutaciones pueden conducir a cambios, algunos buenos, otros malos, pero principalmente
neutros, en las propiedades de un organismo. Aunque la tasa de mutación espontánea es baja
(Sección 10.3), la velocidad a la que muchos procariotas se dividen y su crecimiento exponencial
asegura que las mutaciones se acumulen sorprendentemente rápido. Una mutación en una
mutación genética. Tomados en conjunto, la mutación y la recombinación alimentan el proceso
evolutivo.
El fenotipo de un organismo se designa con una letra mayúscula seguida de dos letras minúsculas,
con un superíndice más o menos para indicar la presencia o ausencia de esa propiedad.
Por ejemplo, su cepa de E. coli es capaz de producir su propia histidina, mientras que una cepa no
lo es. La cepa His- requeriría un suplemento de histidina para el crecimiento. Una mutación en el
gen conducirá a un fenotipo si elimina la función de la proteína HisC.
Aislamiento de mutantes: cribado frente a selección
Estos métodos están disponibles para detectar grandes cantidades de colonias para ciertos tipos
de mutaciones. Por ejemplo, los mutantes nutricionalmente defectuosos pueden detectarse
mediante la técnica de replicado de placas (Figura 10.2). Una colonia de un asa estéril, un palillo de
dientes o un brazo robótico. Las colonias de los padres crecerán normalmente, mientras que las
del mutante no crecerán. Por lo tanto, la incapacidad de una colonia para crecer es una falta de
señales de nutrientes que es un mutante. La colonia en la placa maestra correspondiente a la
mancha vacante se puede recoger, purificar y caracterizar.
Un mutante con un requerimiento nutricional para s'intitule crecimiento año auxótrofo, y la qui
relativa Fue derivado de s'intitule tiene prototroph. (A prototroph puede o no puede ser el de tipo
salvaje. Un auxótrofo se pueden derivar de la de tipo salvaje o mutante de un derivado de la de
tipo salvaje.) Por ejemplo, los mutantes de E. coli con un His-fenotipo son auxótrofos de histidina.
Ejemplos de clases comunes de mutantes y sus medios por los que se detectan en la Tabla 10.1.
Las mutaciones espontáneas son aquellas que ocurren sin intervención externa. El grueso de las
mutaciones espontáneas es el resultado de la ADN polimerasa durante la replicación del ADN.
Las mutaciones que cambian solo un par de bases se llaman mutaciones puntuales. Las
mutaciones puntuales son causadas por sustituciones de pares de bases en el ADN o por la
pérdida o ganancia de un solo par de bases. La mayoría de las mutaciones puntuales en realidad
no causan ningún cambio fenotípico, como se explica a continuación. Sin embargo, como ocurre
con todas las mutaciones, se produce cualquier cambio fenotípico que resulte de una mutación
que depende de la mutación y del tipo de cambio de nucleótidos.
Si una mutación está dentro de la región de codificación de un polipéptido, es muy probable que
cualquier cambio en el fenotipo del polipéptido resulte de un cambio en la secuencia de
aminoácidos del polipéptido.
Al interpretar los resultados de una mutación, primero debemos recordar que el código genético
es degenerado (Sección 4.11 y Tabla 4.5).
Por lo tanto, no todas las mutaciones en la secuencia de bases que codifica un polipéptido
cambiarán el polipéptido. Esto se ilustra en la figura 10.3, que muestra varios resultados posibles
cuando el ADN codifica un codón de tirosina único en un polipéptido mutado. Primero, un cambio
en el ARN de UAC a UAU no tendría efecto aparente porque la UAU también es un codón de
tirosina. Aunque no afectan la secuencia del polipéptido codificado, tales cambios en el ADN se
consideran un tipo de mutación silenciosa; es decir, una mutación que no afecta el fenotipo de la
célula. Tenga en cuenta que las mutaciones silenciosas en las regiones de codificación casi siempre
están en la tercera base del codón (la arginina y la leucina también pueden tener mutaciones
silentes en la primera posición).
En la primera o segunda base del codón, más a menudo conduce a cambios significativos en la
secuencia de aminoácidos del polipéptido. Por ejemplo, un UAC a AAC (Figura 10.3) da como
resultado un cambio de aminoácido dentro del polipéptido de tirosina a asparagina en un sitio
específico.
Esto se llama mutación sin sentido debido al "sentido" informativo (secuencia precisa de
aminoácidos) en el polipéptido que ha cambiado. Si el cambio se produce en una ubicación crítica
en la cadena polipeptídica, la proteína podría estar inactiva o tener actividad reducida. Sin
embargo, no todas las mutaciones sin sentido conducen necesariamente a proteínas no
funcionales. El resultado depende de la sustitución en la cadena polipeptídica. Por ejemplo, las
mutaciones en el sitio activo de una enzima tienen más probabilidades de destruir la actividad que
las mutaciones en otras regiones de la proteína.
Otro resultado posible de una sustitución de un par de bases es la formación de un codón sin
sentido (detener). Esto da como resultado una finalización prematura de la traducción, lo que
conduce a un polipéptido incompleto (figura 10.3). Las mutaciones de este tipo se denominan
mutaciones sin sentido porque el cambio es un codón de sentido (codificación) a un codón sin
sentido (Tabla 4.5). A menos que la mutación esté muy cerca del extremo del gen, el producto se
considera truncado o incompleto. Las proteínas truncadas son completamente inactivas o, al
menos, carecen de actividad normal.
Otros términos son comunes en genética microbiana para describir el tipo de sustitución de bases
en un punto de mutación. Las transiciones son mutaciones en las que una base de purina (A o G)
se sustituye por otra purina, o una base de pirimidina (C o T) se sustituye por otra pirimidina. Las
transversions son mutaciones puntuales en las cuales una base de purina es sustituida por una
base de pirimidina, o viceversa.
Debido a que el código genético es uno de los componentes más importantes de los codones,
cualquier eliminación o inserción de un solo par de bases da como resultado un cambio en el
marco de lectura. Estas mutaciones del marco de lectura a menudo tienen serias consecuencias.
Las inserciones o deleciones de una única base cambian la secuencia primaria del polipéptido
codificado, típicamente de una manera importante (figura 10.4). Dichas microinserciones o
microdeleciones pueden ser el resultado de errores de replicación. La inserción o eliminación de
dos pares de bases también causa un cambio de marco; sin embargo, insertar o eliminar tres pares
de bases agrega o elimina un codón completo. Esto da como resultado la adición de un único
aminoácido en la secuencia polipeptídica. Sin embargo, a menudo no es algo malo para el cambio
de marco, que codifica toda la secuencia polipeptídica después del punto de mutación.
Las inserciones o eliminaciones también pueden generar ganancias o pérdidas. Dichos cambios
inevitablemente resultan en una pérdida completa de la función del gen. Algunas eliminaciones
son tan amplias que pueden incluir varios genes. Si alguno de los genes eliminados es esencial, la
mutación será letal. Tales deleciones no se pueden restaurar a través de mutaciones adicionales,
sino solo a través de la recombinación genética. Las inserciones y deleciones más grandes pueden
surgir como resultado de la recombinación genética. Además, muchas mutaciones de inserción
amplias se deben a la inserción de secuencias de ADN identificables específicas llamadas
elementos transponibles (Sección 10.11). El efecto de los elementos transponibles sobre la
evolución de los genomas bacterianos se analiza con más detalle en la Sección 6.12.
Los diferentes tipos de mutaciones ocurren. Algunos tipos de mutaciones ocurren raramente por
lo que casi no es posible detectar Son, mientras que otros se producen con frecuencia a fin de que
las dificultades de este experimento año intentan tratar de mantener un constante genéticamente
cultivo de reserva. A veces, una segunda mutación puede revertir el efecto de una mutación
inicial. Además, todos los organismos poseen una variedad de sistemas para la reparación del
ADN. En consecuencia, la tasa de mutación observada no sólo depende de la frecuencia del
intercambio de ADN objetivo aussi en la eficiencia de reparación del ADN.
Reversiones mutaciones (cambios Volver) Point son reversibles Por lo general, un proceso
conocido como la reversión. Una reversión es una cepa en el qui fenotipo original que se cambió
en el mutante es restaurado por una segunda mutación.
Los reversores pueden ser de dos tipos, el mismo sitio o el segundo sitio. En revertientes samesite,
la mutación restaura Esa actividad se encuentra en la página web saami como la mutación original.
Si la mutación no es solo de regreso en el sitio tiene como objetivo aussi Sami restaura la
secuencia original, es cierto de reversión s'intitule.
Una clase interesante de mutaciones supresoras son aquellas que resultan en cambios de
secuencia de bases en ARNt. Las mutaciones sin sentido se pueden suprimir cambiando la
secuencia del anticodón de una molécula de ARNt de manera que ahora reconozca un codón de
terminación (figura 10.5). Tal ARNt alterado se denomina ARNt supresor e insertará el aminoácido
en el codón de parada que ahora lee. Las mutaciones del ARNt supresor serían letales a menos
que un ARNt para un codón particular. Un ARNt puede ser mutado en un supresor, mientras que el
otro realiza la función original.
La mayoría de las células tienen múltiples ARNt y las mutaciones suprimidas son comunes, al
menos en microorganismos. A veces, el aminoácido insertado por el supresor es idéntico al
aminoácido original y la proteína está completamente restaurada. En otros casos, se inserta un
aminoácido diferente y se puede producir una proteína parcialmente activada.
La prueba de Ames
La prueba de Ames (llamada así por el bioquímico Bruce Ames que desarrolló la prueba) hace uso
de la detección de revertantes en grandes poblaciones de bacterias mutantes para probar la
mutagenicidad de sustancias químicas peligrosas. Ames es una prueba para un aumento de
mutaciones en cepas auxotróficas de bacterias (figura 10.6). La prueba Ames prueba mutaciones
en la espalda en lugar de mutaciones (generando auxótrofos del tipo salvaje) porque los
reversores pueden seleccionarse más fácilmente.
Es importante que la cepa auxotrófica utilizada en la prueba de Ames tenga un punto de mutación
para que la tasa de reversión sea medible.
Tales nutrientes (p. Ej., Un aminoácido), e incluso poblaciones de células muy grandes, pueden
extenderse en la placa sin formación de colonias visibles. Sin embargo, si hay reversores (mutantes
de vuelta), esas células forman colonias. Por lo tanto, si se extienden sobre la superficie de una
sola placa, incluso entre 10 y 20 colonias pueden ser detectadas por las 10-20 colonias que forman
(Figura 10.6, foto de la izquierda). Sin embargo, si la tasa de reversión aumenta por la presencia de
un mutágeno químico, el número de colonias revertidas es aún mayor. Después de la incubación
durante la noche, la mutagenicidad del compuesto puede detectarse en el papel (figura 10.6).
Tasas de mutación
Para la mayoría de los microorganismos, los errores en la replicación del ADN ocurren a una
frecuencia de 10-6 a 10-7 por mil bases durante una única ronda de replicación. Un gen típico
tiene alrededor de 1000 pares de bases.
Por lo tanto, la frecuencia de una mutación en un gen también está en el rango de 10-6 a 10-7 por
ronda de replicación. Por ejemplo, en un cultivo bacteriano que tiene 108 células / ml, hay varios
mutantes diferentes para cualquier gen dado en cada mililitro de cultivo. Los eucariotas con
genomas muy grandes tienden a tener
Los virus de ADN, especialmente aquellos con genomas muy pequeños, pueden tener de 100 a
1000 veces más que los de los organismos celulares. Los virus de ARN tienen tasas de error aún
mayores debido a una menor corrección de pruebas (Sección 4.6) y la falta de mecanismos de
reparación de ARN.
Los errores únicos de mutación durante la replicación del ADN tienen más probabilidades de
producir mutaciones sin sentido que mutaciones sin sentido porque la mayoría de las
sustituciones individuales producen codones que codifican otros aminoácidos (Tabla 4.5). El tipo
más frecuente de cambios de codones provocado por un cambio de base única conduce a una
mutación silenciosa.
Esto se debe a los codones más diferentes para un aminoácido diferente en la tercera posición
"silenciosa". Un codón dado se puede cambiar a cualquier otro codón por una única sustitución de
base, y en promedio, aproximadamente dos de estos serán mutaciones silenciosas,
aproximadamente uno tiene mutación sin sentido, y el resto serán mutaciones sin sentido.
También hay algunas secuencias de ADN, típicamente secuencias que contienen repeticiones
cortas, que son puntos calientes para las mutaciones debido a que la frecuencia de error de la
ADN polimerasa es relativamente alta allí. La tasa de error de los puntos calientes se ve afectada
por la secuencia de bases en la vecindad.
A menos que sea una mutación, es difícil de medir e incrementa la capacidad del genetista
microbiano para aumentar la eficiencia de la detección de mutaciones. Esto se puede hacer
aumentando el conjunto de mutaciones. Como vemos en la siguiente sección, es posible aumentar
en gran medida la tasa de mutación por tratamiento con agentes mutagénicos. Además, la tasa de
mutación puede cambiar en ciertas situaciones, como en condiciones de alto estrés.
10.4 Mutagénesis
La tasa de mutación espontánea es muy baja, la variedad objetivo de químicos, físicos, y los
agentes biológicos pueden aumentar la tasa de mutación y son, por tanto, para inducir dichas
mutaciones. Estos agentes se denominan mutágenos caducados. Nos Chat revisa algunas de las
principales categorías de mutágenos y sus actividades aquí.
Mutagens químicos
Un resumen de las revisiones algunos de los principales mutágenos químicos y sus modos de
acción se dan en la Tabla 10.2. Existen varias clases de mutágenos químicos. Los análogos de bases
de nucleótidos son moléculas que se asemeja a las bases de purina y pirimidina del ADN en la
estructura todavía mostrar propiedades de apareamiento defectuosos (figura 10.7). Si un análogo
de base se incorpora en el ADN en lugar de la base natural, el ADN puede replicar normalmente la
mayor parte del tiempo. Sin embargo, los errores de replicación de ADN se producen a Superior
tesis frecuencias en el sitio debido a apareamiento de bases incorrecto. El resultado es la
incorporación de una base no coincidentes en la nueva cadena de ADN y por lo tanto la
introducción de una mutación.
Otros mutágenos químicos inducir modificaciones químicas en una base o Otra, resultante y en el
apareamiento de bases defectuoso o intercambio relacionado (Tabla 10.2). Por ejemplo, agentes
alquilantes (Eso productos químicos reaccionan con amino, carboxilo, y grupos hidroxilo
sustituyendo em con grupos alquilo) tales como nitrosoguanidina son de gran alcance y
mutágenos Generalmente inducir mutaciones en frecuencia más alta que los análogos de base. A
diferencia de los análogos de base, qui-tiene un efecto Sólo cuando se incorpora Durante la
replicación del ADN, agentes alquilantes pueden intercambiar Introducir Incluso En no replicantes
de ADN. Ambos análogos de bases y agentes alquilantes tiende a inducir sustituciones de pares de
bases (Sección 10.2).
Otro grupo de mutágenos químicos, las acridinas, son moléculas planas que funcionan como
agentes de intercalación. Estos mutágenos Hazte Entre insertan dos pares de bases de ADN y
empujan aparte. Durante la replicación, esto puede conducir a la conformación anormal
inserciones de una sola base o deleciones en el ADN que contiene acridina. Por lo tanto, acridinas
Típicamente inducir mutaciones del marco de lectura (Sección 10.2).
El bromuro de etidio, que a menudo se usa para detectar ADN en la electroforesis en gel, también
es un agente intercalante y, por lo tanto, un mutágeno.
radiación
Las bases de purina y pirimidina de los ácidos nucleicos absorben fuertemente la radiación UV y la
absorción máxima para el ADN y el ARN es a 260 nm. La muerte de las células por radiación UV se
debe principalmente a su efecto sobre el ADN. Aunque se conocen varios efectos, un efecto bien
establecido es la generación de dímeros de pirimidina, qui en dos bases de pirimidina adyacentes
(citosina o timina) en la hebra de Sami de ADN unido covalentemente a convertirse en uno
Another. Esta es una actividad de la ADN polimerasa muy mejorada o aumenta en gran medida la
probabilidad de que la ADN polimerasa malinterprete la secuencia en este punto.
Rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma (figura 10.8). Estos rayos provocan que el agua y otras
sustancias se ionicen, lo que da como resultado la formación de radicales libres tales como
hidroxilo radical, OH · (Sección 5.16). Radicales libres con macromoléculas en la célula, incluido el
ADN. Esto provoca roturas bicatenarias y monocatenarias que pueden provocar reordenamientos
o grandes eliminaciones. A dosis bajas de radiación ionizante, solo se producen unos pocos
"golpes" en el ADN, pero a dosis más altas, los impactos múltiples causan la fragmentación del
ADN que a veces no se puede reparar y por lo tanto conduce a la muerte de la célula.
Reparación de ADN y el Sistema SOS
Por definición, una mutación es un cambio hereditario en el material genético. Por lo tanto, si el
ADN dañado se puede corregir antes de que la célula se divida, no se producirá ninguna mutación.
Las células tienen una variedad de procesos de reparación de ADN diferentes.
Si bien la mayoría de estos sistemas de reparación de ADN están virtualmente libres de errores,
algunos son propensos a errores y el proceso de reparación en sí introduce la mutación. Algunos
tipos de daño en el ADN, especialmente el daño a gran escala de químicos altamente mutagénicos
o grandes dosis de radiación, pueden causar las lesiones que interfieren con la replicación. Si tales
lesiones no se eliminan antes de que ocurra la replicación, la replicación del ADN se detendrá y se
producirán roturas letales en el cromosoma.
La replicación estancada y otros tipos de daños en el ADN activan el sistema de reparación SOS. El
sistema SOS inicia una serie de procesos de reparación de ADN, algunos de los cuales están libres
de errores.
Sin embargo, el sistema SOS también permite que la reparación del ADN ocurra sin una plantilla,
que es, con incorporación aleatoria de dNTP. Como podría esperarse, esto da como resultado
muchos errores y, por lo tanto, muchas mutaciones. Sin embargo, las mutaciones se pueden
detectar en el cromosoma, ya que las mutaciones a menudo se pueden corregir, mientras que las
rupturas cromosómicas generalmente no se pueden corregir.
Incluso si no hay una plantilla disponible para permitir la inserción de las bases correctas, es
peligroso mantenerla viva. En consecuencia, la síntesis de translesión genera muchos errores. En
E. coli, qui en el proceso de mutagénesis ha-sido estudiado con gran detalle, las dos polimerasas
de reparación propensos a errores son la ADN polimerasa V, una enzima codificada por los genes
umuCD (figura 10.9), y la DNA polimerasa IV, codificada por DinB . Ambos son inducidos como
parte del sistema de reparación SOS.
El sistema SOS está regulado por dos proteínas, LexA y RecA. LexA es un represor que
normalmente impide la expresión del sistema SOS. La proteína RecA, que normalmente funciona
en la recombinación genética (Sección 10.5), se activa por la presencia de daño en el ADN, en
particular por el ADN monocatenario que se replica cuando se detiene la replicación (Figura 10.9).
La forma activada de RecA estimula a LexA a inactivarse mediante la autoescisión. Esto conduce a
la desrepresión del sistema SOS y da como resultado la identificación de varias proteínas que
participan en la reparación del ADN. Debido a que algunos de los mecanismos de reparación del
ADN son intrínsecamente propensos a errores, surgen muchas mutaciones. Una vez que el daño
original del ADN ha sido reparado, el SOS regula es reprimido y cesa la mutagénesis.
La alta fidelidad (baja frecuencia de error) en la replicación del ADN es esencial para que los
organismos permanezcan genéticamente estables. Por otro lado, la fidelidad perfecta es
contraproducente porque evitaría la evolución. El hecho de que organismos tan filogenéticamente
distantes como Archaea y Bacteria tengan la misma tasa de mutación puede sugerir mutaciones.
Sin embargo, esto no es así. Por ejemplo, los mutantes de algunos organismos que son
hiperactivos en la replicación y reparación del ADN han sido seleccionados en el laboratorio.
Sin embargo, en estas cepas, los mecanismos mejorados de corrección y reparación resultan en un
crecimiento más lento; por lo tanto, la hipercifración mutante podría ser una desventaja en el
entorno natural.
Como se indicó anteriormente, un fenotipo de mutador puede ser inducido en cepas de tipo
salvaje por situaciones estresantes. Por ejemplo, el sistema de reparación SOS incluye reparación
propensa a errores. Por lo tanto, cuando se activa el sistema de reparación SOS, la tasa de
mutación aumenta. En algunos casos, esto es simplemente un subproducto inevitable de la
reparación del ADN, pero en otros casos, el aumento de la tasa de cambio puede ser de valor
selectivo para el organismo con fines de supervivencia.
Antes de discutir los mecanismos de transferencia, consideramos el destino del ADN transferido.
Ya sea que se transfiera por transformación, transducción o conjugación, el ADN que ingresa a la
célula mediante la transferencia horizontal de genes enfrenta tres posibles destinos: (1) Puede ser
degradado por enzimas de restricción; (2) puede replicarse por sí mismo (pero solo si posee su
propio origen de replicación, como un plásmido o genoma de fago); o (3) puede recombinarse con
el cromosoma del huésped.
Para que la recombinación homóloga genere nuevos genotipos, las dos secuencias homólogas
deben estar relacionadas, pero genéticamente distintas. Este es obviamente el caso en una célula
diploide eucariótica, que tiene dos conjuntos de cromosomas, uno de cada padre. En
las procariotas, moléculas de ADN genéticamente distintas pero homólogas se unen de diferentes
maneras. La recombinación genética en procariotas ocurre después de que los fragmentos de ADN
homólogo de un cromosoma donante se transfieren a una célula receptora mediante
transformación, transducción o conjugación. Solo después del evento de transferencia, cuando el
fragmento de ADN del donante está en la célula receptora, se produce la recombinación
homóloga. En procariotas, solo se transfiere parte de un cromosoma; por lo tanto, si no se
produce la recombinación, el fragmento de ADN se perderá porque no puede replicarse
independientemente. Por lo tanto, en procariotas, la transferencia es solo el primer paso en la
generación de organismos recombinantes.
Complementación
En los tres métodos de transferencia génica bacteriana, solo una porción del cromosoma del
donante ingresa a la célula receptora. Por lo tanto, a menos que la recombinación tenga lugar con
el cromosoma receptor, el ADN del donante se perderá porque no puede replicarse
independientemente en el receptor. No obstante, es posible mantener establemente un estado de
diploidia parcial para su uso en el análisis genético bacteriano.
Una cepa bacteriana que porta dos copias de un segmento cromosómico en particular se conoce
como diploide parcial o merodiploide.
En general, una copia está presente en el cromosoma mismo y la segunda copia en otro elemento
genético, como un plásmido o un bacteriófago.
Competencia en Transformación
Se dice que una célula que puede absorber ADN y transformarse es competente, y esta capacidad
está determinada genéticamente. La competencia en la mayoría de las bacterias naturalmente
transformables está regulada, y las proteínas especiales desempeñan un papel en la captación y el
procesamiento del ADN. Estas proteínas específicas de competencia incluyen una proteína de
unión a ADN asociada a membrana, una autolisina de pared celular y varias nucleasas. Una vía de
competencia natural en B. subtilis -una especie fácilmente transformable- está regulada por la
detección de quórum, un sistema regulador que responde a la densidad celular (Sección 7.9).
Esto es importante porque el ADN en E. coli -el caballo de batalla de la ingeniería genética- es
crítico para la biotecnología, como veremos en el Capítulo 11.
La electroporación es una técnica física que se utiliza para llevar el ADN a organismos que son
difíciles de transformar, especialmente aquellos con paredes celulares gruesas. En la
electroporación, las células se mezclan con ADN y luego se exponen a breves pulsos eléctricos de
alto voltaje. Esto hace que la envoltura celular sea permeable y permite la entrada del ADN.
Durante la transformación natural, las bacterias competentes se unen de forma reversible al ADN.
Pronto, sin embargo, la unión se vuelve irreversible.
Las células competentes unen mucho más ADN que las células no competentes, tanto como 1000
veces más. Como se señaló anteriormente, los tamaños de los fragmentos transformantes son
mucho menores que los del genoma completo, y los fragmentos se degradan aún más durante el
proceso de captación. En Streptococcus pneumoniae, cada célula puede unir solo unas diez
moléculas de ADN bicatenario de 10-15 kbp cada una. Sin embargo, a medida que estos
fragmentos se incorporan, se convierten en piezas monocatenarias de aproximadamente 8 kb,
degradando la cadena complementaria. Los fragmentos de ADN en la mezcla compiten entre sí
por la captación y, por lo tanto, disminuye la probabilidad de que un transformante tome ADN que
confiere una ventaja o un marcador seleccionable.
En la transducción, un virus bacteriano (bacteriófago) transfiere ADN de una célula a otra. Los
virus pueden transferir genes del hospedador de dos maneras. En la primera, llamada
transducción generalizada, el ADN se deriva de la presencia del virus en el genoma. En el segundo,
llamado transducción especializada, el ADN de una región específica del cromosoma se integra
directamente en el genoma del virus, generalmente reemplazando algunos de los genes del virus.
Esto ocurre solo con ciertos virus templados como el fago lambda (Sección 8.8).
En la transducción generalizada, los genes del donante bacteriano no pueden replicarse de forma
independiente y no son parte de un genoma viral.
Por lo tanto, a menos que los genes donantes se recombinen con el cromosoma bacteriano
receptor, se perderán. En la transducción especializada, la recombinación homóloga también
puede ocurrir. Sin embargo, dado que el ADN bacteriano del donante es en realidad una parte del
genoma del fago, puede integrarse en el cromosoma del huésped durante la lisogenia (Sección
8.8).
Transducción Generalizada
Sin embargo, durante la infección lítica, la enzima responsable del empaquetamiento del ADN viral
en el bacteriófago El resultado se llama partícula transductora.
Estos no pueden conducir a una infección viral porque no contienen ADN viral y se dice que son
defectuosos. Una de la lisis celular, las partículas de transducción se liberan junto con viriones
normales que contienen el genoma del virus.
Por lo tanto, el lisado contiene una mezcla de viriones normales y partículas transductoras.
Cuando se utiliza este lisado para infectar una población de células receptoras, la mayoría de las
células están infectadas con el virus de la normalidad. Sin embargo, una pequeña proporción de la
población recibe la transducción de partículas inyecta el ADN que envasan de la bacteria huésped
anterior.
Aunque esto no puede replicar el ADN, puede recombinarse con el ADN (Sección 10.5) del nuevo
huésped. Debido a que sólo una pequeña proporción de las partículas en el lisado son
defectuosos, y cada uno de estos contiene sólo un pequeño fragmento de ADN del donante, la
probabilidad de una partícula de transducción dada que contiene un gen particular es bastante
bajo. Típicamente, solo se transduce aproximadamente 1 célula de 106 a 108 para un gen dado.
En el primer cuadro de la transducción especializada para ser descubierto, genes galactosa para el
catabolismo fueron transducidas por el fago lambda templado de E. coli.
Cuando lambda lysogenizes una célula huésped, el genoma del fago se integra en el cromosoma
de E. coli en un sitio web específico (Sección 8.8). Este sitio está al lado del grupo de genes que
codifican las enzimas para la utilización de galactosa. Después de la inserción, la replicación del
ADN viral está bajo el control del cromosoma bacteriano del huésped.
Tras la inducción, el ADN viral se separa del ADN huésped en un proceso que es el inverso de la
integración (Figura 10.15). Por lo general, el ADN lambda se escinde exactamente, bebió de vez en
cuando el genoma del fago se escinde incorrectamente. Algunos de los genes bacterianos
adyacentes a un lado de la profago (por ejemplo, el operón galactosa) se cortan junto con el ADN
del fago. Al mismo tiempo, algunos genes de fagos quedan atrás (Figura 10.15b). Esta partícula
transductora puede transferirse posteriormente a galactosa. Esta transferencia sólo se puede
detectar si una cepa galactosa negativo (Gal) está infectado con Tal partícula de transducción y Gal
+ se seleccionan transductantes.
Para una lambda sea virión infeccioso, existe un límite a la cantidad de ADN de fago que puede ser
reemplazado con ADN del huésped. ADN de fago suficiente deben ser retenidos para codificar la
proteína de cubierta de fago y otras proteínas necesarias para la lisis del fago y lysogeny. Sin
embargo, si un fago auxiliar se utiliza junto con un fago defectuoso en una infección mixta,
entonces ahora se necesitan menos genes de fagos específicos en el fago defectuoso. Sólo el área
att (fijación), el sitio cos (extremos cohesivos, para el envasado), y el origen de replicación del
genoma de lambda (Figura 8.17a) son considera.
Conversión de fagos
La alteración del fenotipo de una célula huésped por lisogenización se llama conversión de fagos.
Cuando un fago de fago normal (es decir, no defectuoso) se lisogeniza a una célula y se convierte
en profago, la célula se vuelve inmune a una infección posterior por el mismo tipo de fago.
Dicha inmunidad se puede considerar como un cambio en el fenotipo. Sin embargo, a menudo se
observan otros cambios fenotípicos no relacionados con la inmunidad del fago en la conversión
del fago de las células lisogenizadas.
Dos cajas de conversión de fagos han sido especialmente bien estudiadas. Uno da como resultado
una estructura de un polisacárido en la superficie celular de Salmonella enterica serovar Anatum
en la lisogenización con bacteriófago ε15. El segundo resultado en la conversión de las cepas no
productoras de toxinas de Corynebacterium difteria (la bacteria que causa la difteria enfermedad)
a las cepas productoras de toxinas (patógenos) Siguiendo lysogeny con β bacteriófago (Sección
29.3). En ambos casos, los genes responsables de los cambios son una parte integral del genoma
del fago y, por lo tanto, se transmiten a la célula por fagos y lisogenización.
Muchas bacterias aisladas de la naturaleza son lisógenos naturales y, por lo tanto, es probable que
la lisogenia sea esencial para la supervivencia de muchas especies en la naturaleza.
CRISPR
10.12 Conservando la Integridad del Genoma:
Interferencia CRISPR
Bacteria y Archaea no solo producen endonucleasas de restricción (Secciones 8.6 y 11.1) que
funcionan para destruir el ADN extraño que ingresa, también tienen un programa de defensa
basado en ARN para destruir el ADN invasor de la infección viral y algunas veces la conjugación.
Este tipo de "sistema inmune" procariótico ayuda a preservar la estabilidad del genoma y se llama
sistema CRISPR, que significa repeticiones palindrómicas cortas agrupadas, regulares e
interespaciadas.
La región CRISPR en el cromosoma bacteriano es esencialmente un banco de memoria de
secuencias de ácido nucleico entrantes usadas para vigilancia contra ADN extraño. Consiste en
muchos segmentos diferentes de ADN extraño llamados espaciadores que se alternan con
secuencias idénticas repetidas (figura 10.28). Las secuencias espaciadoras corresponden a
fragmentos de ADN extraño que previamente han invadido la célula. Una vez que los espaciadores
se recombinan en la región CRISPR, el sistema proporciona resistencia a cualquier ADN entrante (y
a veces ARN) que contiene las mismas secuencias o muy estrechamente relacionadas con regiones
espaciadoras individuales. Las proteínas del sistema CRISPR llevan a cabo funciones esenciales de
esta "inmunidad" basada en ARN.
Las proteínas del sistema CRISPR (proteínas asociadas a CRISPR o proteínas Cas) desempeñan dos
funciones. Algunos participan en la obtención y almacenamiento de segmentos de ADN extraño
como espaciadores mediante el reconocimiento de secuencias de nucleótidos específicas
asociadas con los espaciadores. Otros usan la información almacenada de la secuencia para
reconocer el ADN intruso y destruirlo. Las propias proteínas Cas están codificadas por genes que
se encuentran aguas arriba de las secuencias de ADN de CRISPR (figura 10.28).
La región CRISPR se transcribe como un todo en una molécula larga de ARN que luego se escinde
en el medio de cada una de las secuencias repetidas mediante la actividad nucleasa de las
proteínas Cas. Esto convierte la molécula larga de ARN en segmentos espaciadores de pequeños
ARN llamados ARN CRISPR (ARNcr). Si uno de estos pares de bases de los ARNcr con ácido nucleico
invasor, el ADN o ARN extraño es destruido por la actividad nucleasa de otras proteínas Cas.
La utilidad del sistema se demostró por primera vez en la industria láctea, donde los cultivos
iniciadores utilizados para la fermentación de la leche son susceptibles a la infección desenfrenada
de bacteriófagos. Sin embargo, se encontró que una cepa de Streptococcus thermophilus era
resistente a un bacteriófago virulento. La diferencia entre esta cepa de S. thermophilus y aquellos
susceptibles a la infección viral fue sus espaciadores dentro de la región CRISPR. Si bien se
desconoce por qué algunos virus no son atacados por el sistema CRISPR, los experimentos de
laboratorio han demostrado que los bacteriófagos pueden superar el reconocimiento por las
proteínas Cas y los ARNcr modificando su genoma a través de la mutación.
La tecnología CRISPR es una reciente herramienta de edición del genoma que actúa como unas
tijeras moleculares capaces de cortar cualquier secuencia de ADN del genoma de forma específica
y permitir la inserción de cambios en la misma.
Los años setenta marcaron el inicio de la Era de la Ingeniería Genética, en la que importantes
hitos, como la producción de insulina a partir de Escherichia coli o la utilización de ratones
transgénicos en el estudio de enfermedades humanas, cambiaron el curso de la medicina. Sin
embargo, los métodos utilizados no dejaban de ser imprecisos y difíciles de aplicar a gran escala,
resultando en experimentos complicados y costosos.
En el transcurso de las últimas décadas, los investigadores se han centrado en superar dichas
limitaciones con el objetivo de desarrollar un mecanismo de edición genómica capaz de generar
numerosos cambios en el genoma de una célula de forma coordinada y precisa. A día de hoy, las
estrategias empleadas en los laboratorios para manipular, de forma específica y directa,
secuencias del genoma de organismos vivos son dispares. Entre las herramientas actuales,
destacan las nucleasas de dedos de zinc (ZFN), las nucleasas tipo activadores de transcripción
(TALEN) y las revolucionarias nucleasas de secuencias palindrómicas repetidas inversas (CRISPR-
Cas). Las dos primeras están basadas en proteínas constituidas por una región de catalítica de
escisión del ADN y una región guía de reconocimiento del gen diana que se quiere manipular. Las
TALENs son más fáciles de diseñar que las ZFN. No obstante, ambas resultan difíciles de
administrar en las células debido a su tamaño, complicando la capacidad de generar múltiples
cambios genéticos simultáneos. Por lo contrario, CRISPR-Cas ofrece a los científicos la posibilidad
de cambiar una secuencia de ADN de una forma más fácil, rápida y precisa en diferentes puntos
concretos del genoma dentro de un organismo vivo.
El sistema CRISPR-Cas es un mecanismo de defensa empleado por algunas bacterias para eliminar
virus o plásmidos invasivos. Dicho sistema consta de un componente proteico Cas9 con actividad
de nucleasa, que corta el ADN, y un ARN, conocido como ARN guía, que dirige al anterior dominio
catalítico hacia la secuencia de ADN que se quiere editar.
El proceso de edición genómica con CRISPR-Cas9 incluye dos pasos. En una primera etapa, el ARN
guía, complementario a la región del ADN que se quiere modificar y sintetizado previamente, se
asocia con la enzima Cas9. Además, gracias a las reglas de complementariedad de nucleótidos, el
ARN hibrida con la secuencia de interés presente en el genoma, dirigiendo a la endonucleasa Cas9
a cortar el ADN en la región concreta. En la segunda etapa se activan los mecanismos naturales de
reparación del ADN fragmentado. Esta reparación resulta en algunos casos, en la aparición de
mutaciones de inserción o deleción, que si están localizadas dentro de un gen pueden dar lugar a
la pérdida de producción de la proteína que codifica. Así, una posible aplicación es la de inhabilitar
genes.
Si se proporciona a la célula una molécula de ADN que sirva como molde durante la reparación, a
la que se ha añadido un cambio, la célula lo copiará y el cambio quedará incorporado en el ADN.
Esta otra aplicación, la introducción de cambios específicos en posiciones concretas supone uno de
los aspectos más prometedores de la técnica, ya que permitiría corregir errores en los genes
responsables de causar enfermedades.
Además, el sistema también puede ser utilizado para regular la expresión génica, o incluso para
introducir modificaciones epigenéticas, inactivando la actividad nucleasa de Cas9 e incorporándole
un módulos que interaccionen con elementos reguladores de la expresión génica o capaces de
llevar a cabo cambios en metilación o modificaciones de las histonas.
El desarrollo de la tecnología CRISPR-Cas ha inaugurado una nueva era para la ingeniería genética
en la que se puede editar, corregir y alterar el genoma de cualquier célula de una manera fácil,
rápida, barata y altamente precisa.
RESUMEN BROCK
Diferentes tipos de mutaciones a diferentes frecuencias. Para una bacteria típica, se observan
tasas de mutación de 10-6 a 10-7 por kilobase. Aunque las polimerasas de ARN y ADN constituyen
la misma velocidad, los genomas de ARN generalmente acumulan mutaciones a frecuencias
mucho más altas que los genomas de ADN.
Mutágenos: Agentes químicos, físicos o biológicos que aumentan la tasa de mutación. Los
mutágenos pueden alterar el ADN de muchas maneras diferentes. Sin embargo, las alteraciones en
el ADN no son mutaciones a menos que se hereden. Algunos daños en el ADN pueden repararse y
existen sistemas de reparación de ADN propensos a errores y de alta fidelidad.
10.6 • Ciertos procariotas de competencia, un estado en el cual las células pueden ser liberadas
por otras bacterias. Incorporación del ADN del donante en un receptor de proteína de unión
monocatenaria, proteína RecA y varias otras enzimas. Solo las células competentes son
transformables.
10.7 La transducción es la transferencia de genes del huésped de una bacteria a otra por un virus
bacteriano. En la transducción generalizada, los virus defectuosos son fragmentos incorporados al
azar de la célula de ADN cromosómico, pero la eficacia de transducción es baja. En la transducción
especializada, el ADN de un virus templado elimina de manera incorrecta y lleva consigo genes
hospedadores adyacentes; la eficiencia de transducción aquí puede ser muy alta.
10.9 • El cromosoma de la célula del donante se puede movilizar para una célula receptora. Esto
requiere que un plásmido se integre en el cromosoma para formar el fenotipo. Debido a que el
cromosoma raramente está completo, las células receptoras rara vez se vuelven F +. Los plásmidos
han integrado previamente plásmidos que han sido extirpados y capturados por algunos genes
cromosómicos.
10.11 • Los transposones y las secuencias de inserción son elementos genéticos que pueden
moverse de un lugar a otro por transposición. La transposición puede ser oro replicativo o
conservador. Los transposones a menudo portan genes que codifican resistencia a antibióticos y
pueden usarse como mutágenos biológicos.
10.12 El sistema CRISPR es un mecanismo basado en ARN para proteger el genoma procariota del
ADN invasor resultante de la infección y la conjugación. Si las secuencias de ARN pequeñas
resultantes de las regiones de región CRISPR de la región, la proteína descompone el dúplex de
ácido nucleico.