SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Colmenares Angie, Del castillo Heidy, Bautista Geraldine

Corporación Tecnológica de Bogotá; Tecnología en Química Industrial, Bioquímica
Bogotá D.C. Colombia
23/01/2018

RESUMEN gel is probably the stationary phase with

La separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina puede llevarse
a cabo empleando diversos tipos de fases
estacionarias en la modalidad de
cromatografía de adsorción. El gel de
sílice es probablemente la fase estacionaria
con la que mejores resultados se obtienen.
En esta práctica llevaremos a cabo la
separación del aminoácido: fenilalanina,
incluyendo la mezcla de Aspartame en
agua, Aspartame en HCl y Coca-Cola
Zero, empleando gel de sílice como fase
estacionaria y una mezcla de (Butanol:
ácido acético: agua, 12:3:5) como fase
móvil.
En este caso, y a continuación del
desarrollo cromatográfico es precisa una
etapa de revelado, ya que el analito de la
fenilalanina es incoloro. En dicha etapa se
utiliza la ninhidrina como agente de
revelado, la cual forma con los
aminoácidos un derivado de color azul-
violáceo.
ABSTRACT
The amino acid separation by thin layer
chromatography can be carried out using
various types of stationary phases in the
adsorption chromatography mode. Silica
which better results are obtained.
In this practice we will carry out the
separation of the amino acid:
phenylalanine, including the mixture of
aspartame in water, aspartame in HCl and
Coca-Cola Zero, using a silica gel as a
stationary phase and a mixture of
(Butanol: acetic acid: water, 12: 3: 5) as a
mobile phase
In this case, and once again the
development of the chapter is necessary a
stage of development, since the analysis of
phenylalanine is colorless. In this stage,
ninhydrin is used as a development agent,
the quality with the benefits of the blue-
violet color.
INTRODUCCION
La cromatografía se engloba dentro de las
llamadas técnicas de separación y permite
el análisis de mezclas complejas de
compuestos muy estrechamente
relacionados químicamente. Son varias las
modalidades usadas y se clasifican según
la fase móvil (de gases, líquida) y por el
tipo de soporte (columna, capa fina, papel)
usados. La separación se lleva a
cabo según la distinta interacción que
presenta cada uno de los componentes de
una muestra respecto a dos fases: una
estacionaria y otra móvil que fluye sobre
ella. Esta interacción puede ser de varios
tipos que a su vez dan lugar a distintas
subclases de cromatografía: de absorción,
de reparto, de cambio iónico, de afinidad,
etc.
Para elegir una técnica de separación,
además de tener en cuenta los criterios
económicos y de accesibilidad, hay que
atender a dos tipos de consideraciones:
unas tienen que ver con las propiedades
físicas y estructurales de las moléculas que
se pretende separar, o de las características
de la matriz en que se encuentran; otras se
derivan de los objetivos del análisis
(sensibilidad, resolución, tiempo de
análisis, necesidad de una detección
específica).
El método de selección incluye los pasos
necesarios para la obtención, preparación
y posible fraccionamiento de la muestra, la
aplicación de la técnica analítica adecuada
y el tratamiento de los datos obtenidos.
Las técnicas analíticas más empleadas en
la actualidad pueden englobarse en dos
grandes grupos: técnicas de separación y
técnicas espectroscópicas. Las técnicas
espectroscópicas proporcionan, para cada
compuesto analizado, una información
compleja, relacionada con sus
características estructurales específicas y
las técnicas de separación se utilizan para
resolver los componentes de una mezcla y
la señal obtenida puede utilizarse con fines
analíticos cuantitativos o cualitativos.
METODOLOGIA
Agitar bien el recipiente donde se
encuentra la fase móvil. Agregar a la
cámara Cromatográfíca 5 mL de fase
móvil (Butanol: ácido acético:
agua,12:3:5). Cerrarla herméticamente y
dejarla saturar durante 30 minutos.
Dibujar con un lápiz dos líneas en ambas
placas cromatográficas, una a 1.0 cm de un
extremo y otra a 0.5 cm del otro extremo,
como se muestra en la figura 1. Haga los
trazos suavemente, sin raspar la sílice de la
placa.
Pesar 50 mg de aspartame, agregar a un
tubo de ensayo y agregar 4 mL de HCl 3
M. Caliente en mechero por 30 segundos
mediante flameo circular, sin dejar que el
contenido se evapore.
Pesar 50 mg de aspartame, agregar a un
tubo de ensayo limpio y disolver en 5 mL
de agua destilada. Caliente un poco el tubo
para favorecer la solubilidad si es
necesario.
Pesar 20 mg de cada uno de los siguientes
aminoácidos (glicina, glutamato,
fenilalanina,
Lisina), agregar c/u a tubos de ensayo
diferentes previamente rotulados, y
disolver en 4 ml de agua destilada.
Sembrar las muestras en las placas
cromatográficas en el orden que se indica
en la figura 2. Para ello, utilice un capilar
o un extremo de capilar para cada muestra.
Para sembrar muestras con un capilar,
introduzca un extremo del mismo en la
solución de la respectiva muestra y toque
rápida y suavemente en un punto de la
línea de siembra. Deje secar y repita el
proceso 5 veces más, procurando que el
diámetro de cada muestra no supere los 2-
3 milímetros y que las muestras estén lo
suficientemente espaciadas y no se toquen.

Colocar las placas en la cámara

cromatográfica previamente saturada con
fase móvil. Deje que la fase móvil recorra
la placa hasta la línea de llegada. No
mueva la cámara
Cromatografíca durante el proceso para no
alterar el frente de corrida.

RESULTADOS

El reparto de los aminoácidos en el papel

se debe a su naturaleza química. Las
fórmulas de los compuestos usados como
patrón son:

Retirar las placas de la cámara

cromatográfica. Dejar secar hasta que no
se perciba el olor a solvente.

Agregar el revelador de ninhidrina sobre

las placas con ayuda del atomizador. Deje
reposar durante 5 minutos.

Colocar las placas en una estufa o en una

plancha de calentamiento hasta que se
observen las manchas de los analitos.

Medir la distancia recorrida por las

muestras desde el centro geométrico de
cada mancha hasta la línea de siembra.
Divida dichos valores por la distancia
recorrida por la fase móvil
Los estándares utilizados en este
laboratorio fueron sometidos a TLC y
teñido con ninhidrina para localizar
cualquier compuesto con grupos amino
libres (Ilustración 1).

Ilustración 1. Separación de aminoácidos
basado en Cromatografía de capa fina.
Referenciándolos como: (F) Fenilalanina –
(A) Aspárteme y Agua – (H) Aspartame y HCl
– (C) Coca-Cola cero.
La posición del aminoácido se revela con
ninhidrina, apareciendo una mancha de
coloración azul-violeta. La ninhidrina
reacciona con los aminoácidos formando
aductos coloreados según la reacción.
1
La Ninhidrina es un agente oxidante muy potente
y al reaccionar con el aminoácido en caliente
causa su desanimación oxidativa, liberando
amoníaco, CO2
Ilustración 2. Reacción de la ninhidrina y
Aminoácidos1.
(1). Ninhidrina reaccionando con el
Aminoácido.
(2). Se forma el primer intermedio.
(3). El intermedio decarboxila y dehidrata
para dar un ion dipolar.
(4). El ion dipolar hidroliza dando la amina.
(5). La amina condensa con otra molécula de
Ninhidrina para darle Purpura de Ruhemann.
Según, el grupo alfa-amino de los
aminoácidos forma complejos coloreados
con la ninhidrina: violeta azuloso en la
mayoría de los aminoácidos cuyo grupo
amino es primario, amarillo para la prolina
e hidroxiprolina.
 Distancia La reacción de los aminoácidos con la
Aminoácidos RFx
recorrida en cm Ninhidrina es muy utilizada en la
Fenilalanina 1,9 0,2923 cuantificación de éstos, ya que se forma un
Aspartame con Agua 1,8 0,2769 compuesto coloreado cuya intensidad es
Aspartame con HCl 2,9 0,4462 proporcional a la concentración del
Coca-Cola 2 0,3077 aminoácido presente. La formación de
Glicina 0,6 0,0923 color se toma como resultado positivo e
Glutamato 0,5 0,0769
indica su presencia, mientras que el no
desarrollo de color es indicativo de que no
Lisina 0,4 0,0615
está presente.
Tabla 1. Distancia recorrida por cada
aminoácido y cálculo del Rf (Df=6,5cm) Aunque en la presente práctica se llevó a
En la Tabla 2, se puede observar la cabo la determinación cualitativa de
estructura de los aminoácidos de acuerdo aminoácidos (ausencia o presencia de
a la polaridad. dichos compuestos), las reacciones
coloreadas pueden también ser utilizadas
para la determinación cuantitativa de
dichas biomoléculas.
Después de la reacción con la Ninhidrina,
se puede observar que la mancha que más
elución tiene es la del Aspartame y el HCl
(color amarillo), ya que, la mezcla no es
tan a fin con la fase estacionaria, es decir,
no se retiene el analito en la fase en
normal, debido a que la silica gel es polar.
Con respecto a la fenilalanina, se observa
que es el aminoácido más a fin a la fase
estacionaria, esto evidenciado en qué fue
el aminoácido que se retuvo con mayor
Tabla 2. Estructura de los aminoácidos fuerza por la silica gel por tanto no fue
analizados en el laboratorio, de acuerdo a su migrado por la fase móvil.
orden de polaridad (más polar al menos
polar). Con respecto al reparto se obtiene de la
siguiente manera: aminoácido apolar
ANALISIS DE RESULTADOS (aspartame en agua y aspartame en HCl)
son los compuestos más afines a la
“Esta técnica de separación polaridad de la fase móvil y arrastrados por
cromatografíca es de las más simples, él. Por tanto se observa mayor migración
aunque también de las más didácticas, ya en la placa con respecto a los demás
que los alumnos deben preparar y cortar aminoácidos; la fenilalanina es la que
el papel, aplicar la muestra y revelar la presenta menor movilidad, debido al pH
posición de los aminoácidos” del Butanol.
Se observa en la Tabla 1 las fases de la
cromatografía en capa fina.
Fase Normal Reversa
Polaridad Alta Baja
Polaridad del
Baja Alta
solvente
Orden de Primero el Primero el
elución menos polar más polar
Tabla 3. Fases de la Cromatografía en capa
fina.
Ahora bien, en el caso de la Coca-Cola
cero que se presenta incoloro, quiere decir
que NO da positivan para la prueba de
Biuret2, indica que no hay proteínas pero
sí hay aminoácidos libres de un pH 4 y 8.
De acuerdo con las tablas 1 y 2, se pude
decir que la polaridad esta inversamente
relacionada con el factor de retención, al
determinar los Rf se puede observar que el
Aspartame con HCl posee el mayor valor,
mientras que la Licina posee el menor
factor de retención de la fase móvil,
(Butanol: ácido acético: agua,12:3:5), es
decir, entre más polar sea la sustancia
menor será su RF, por lo tanto, a menor Rf
la sustancia queda más retenida en la fase
estacionaria y a mayor Rf la sustancia no
está unida con fuerza a la fase estacionaria
y es arrastrada por la fase móvil.
Con base en la Tabla 2 las estructuras de
los aminoácidos influyen en
la cromatografía, debido a su radical, ya
que, ellos cambian la polaridad de la
molécula& por el carácter de los átomos,
por ejemplo: el glutamato es más polar por
tener un grupo ácido carboxílico adicional
a la estructura
básica de aminoácido, caso contrario a la
2 compuestos con dos o más enlaces peptídicos en
Reactivo de Biuret es aquel que detecta la
presencia de proteínas, péptidos cortos y otros
fenilalanina, la cual por tener un benceno
en su estructura es apolar.
CONCLUSIONES
Este tipo de cromatografía nos permite
identificar aminoácidos con lo cual se
genera una reacción como consecuencia de
la reacción entre la Ninhidrina y los
distintos aminoácidos por la presencia del
grupo amino, por lo tanto, presenta un
color característico como es el morado o
amarillo
La Ninhidrina, es el reactivo adecuado y
necesario para aplicar en cromatografía de
aminoácidos, puesto que reacciona con los
principales compuestos (aminoácidos),
permitiendo el reconocimiento de los
mismos por la coloración denominada
purpura de Ruhemann.
Las pruebas para identificar aminoácidos,
como la cromatografía, se basan encaracte
rísticas propias de cada aminoácido, como
es su punto isoeléctrico y su RE. Mediante
un buen uso de la técnica de
cromatografía, se puede separar una
mezcla compleja de aminoácidos.
BIBLIOGRAFIA
 Jorrín J., Nieves M., Bárcena J.
Separación de aminoácidos por
cromatografía en capa fina y
detección mediante reacción con
ninhidrina. Departamento de
Bioquímica y Biología Molecular,
Campus Universitario de
sustancias de composición desconocida.
 Rabanales, Edificio Severo Ochoa,
14071-Córdoba

 A.L. Lehninger, D.L. Nelson and

M.M. Cox, 1993.Principles of
Biochemistry (SecondEdn.)
WorthPublishers.
 Murray, R. K. (2009). HARPER
Bioquímica Ilustrada. Mexico:
Lange MedicalPublications.

 Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL

(2003) Estructura y función de las
proteínas. En: “Bioquímica”, 5ª ed.
Editorial Reverté (Barcelona,
España), pp. 41-76. Muestra las
características de los aminoácidos:
estructura, variación de su carga
con el pH, etc.