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1120. Seccién 33-2. Organizacisn genomica ane Figura 33-15 Microgratia ce cromosomas polténicos tenidos, rocedentes de ia gianula salval de U. melanogaster. Eslos cromosomas constan de bandas terlidas de oscuro ‘eparadas por regiones poco tenidas. Los cuairo cromosomas de una célula se mantienen unidos por sus Centromeros. Se indican les posiciones cromosémicas de los genes que codifica” la alcohol deshidrogenasa (ADH), la alderidu Uxivasa (ALR) y ls acta al Uesthdr ger as (ODH}. [Por cortesia de B. P. Kaufmann, University of Michigan.) contiene un maximo de 2 x 2" = 1024 cadenas de DNA. Los 4 cromosomas gigantes de Drosophila tienen tuna longitud total de ~' 2 mm, con lo que su genoma haploide de 1,65 x 10* bp posee una relacién media de empaquetamiento cesi igual «30, Alzededor del 95 % de este DNA esta concentrado en bandas cro- mosomicas (Fig, 33-16), Estas bandas (mas correcia- mente, cromémeros), observadas al microscopio me- diante tincién, forman un patrin que es caracteristico de cada estinpe de Drosophila. De hecho, las reardena- Gones cromosomicas tales como duplicaciones, de- leciones © inversiones provocan cl correspondiente cambio en el patron de ias bandas. El patron de bandas de ws cromusuina poltrentce, por iaito, forma un mepa citolégico paralelo a sx mapa genético Los cromosomas de Dresophila muestran ~ 5000 bandas, mimero que coincide mas © menos con el nimezo estimado de proteinas que produce Drosophi- In, Esta correlacion rugiore que cada banda eromos) mica cortesponde a un gen estructural individual, hipotesis cooborada mediante el empleo de la Rie bridacién in situ (en ol mismo lugar). En esta técnica, desarcollada por Mary Lou Pardue y Joseph Gall, una preparacién de un cromosoma inmovilizado se tra- ta con NaOH para desnaturalizar su DNA, se hibrida con mRNA purificade marcado radia tivaniwatte (y 94 cDNA correspondiente) y el sitio de unién de la son- a radiactiva en el cromosoma se determina por auto- sradiografia. Un determinado mRNA hibrida con una ©, como mucho, con unas pocas bandas cromosomi- «as (Fig, 33-17). Veremos que esas bandas, que proba- blemente corresponden a los bucles radiales de los, sromocomas, metafivicos, 20n lav unidades de trans ripcion de los cromosomas (Seccién 33-3). 2. ORGANIZACION GENOMICA Los organismos superiores contienen una gran va~ riedad de células que se diferencian np slo en su aspecto (por ¢}., Fig, 1-10), sino tambien en las protei- nas que sintetizan. Las células hacinares pancreaticas, or ejemplo, sintetizan cantidades copiosas de enzi- mas cigestivos como Ia tripsina y la quimotripsina 0 no insulina, mientras que sus vecinas las células Bide! pancreas producen grande cantidades de new. lina pero no de enzimas digestives. Claramente, cada tuno de estos tipos celulares expresa genes diferentes, Sin embargo, la mayoria de las células somaticas de tun organismo pluricelular contiene la misma informa- cidn genética que el évulo fecundado del que proce- den (fenémeno descrito como totipatencia). Elle fue demosirado, por ejemplo, por John Gurdon quicn ‘obtuve una rina adulta normai a partir del huevo fecundado de rana cuyo niicleo habia sido reemplaza- do por el de una celula intestinal de renacuajo. En esta seccién describimas la organizacion genética del cromosoma eucaridtico, 1a cual permite su gran fle bilidad en la expresién. Cémo se controla esta expre~ sign génica es el tema de la Seccign 33-3, A, La paradoja del valor C Légicamente, se podria esperar que la complejidad morfologica de un onganismo estuviera correlaciona- a aproximadamente con su valor C, la cantidad de DNA en su genoma haploide. Después de todo, la compleiidad morfologica de un organismo debe refle- jar una complejidad genética subyacente, Sin embar- ge, en lo que se conoce como la paradoja del valor C, muchos organismos presentan inesperadamente valo- tea C grandes (Fig. 30-18). For ejemplo, el genoma del pez pulmonado es de 10 a 15 veces mayor que el de 10s mamiteros, y el de algunas salamandras es atin mayor, Ademés, la paradoja del valor C se presenta incluso en especies estrechamente relacionadas; por ejemplo, los valores C para varias especies de Droso- Phila muestran una dispersion de 2,5 voces, ;Tiene alguna funcién el DNA adiivual presente eit lus genomas mis grandes, y si no es asi, por qué se conserva de una generacion a otra? Se cree que los 4 millones de bp del genoma de E, coli codifican ~ 3000 productos génicos (aproximada- mente la mitad de ellos han sido caracterizados). Por al contrario, el genoma haploide humano de 2900 millones de bp, que es > 700 veces mayor que el de E.coli, se estima que codifica de 30 a 40 mil proteinas;, ps decir, ol hombre <éla tienen de 1a 13 veces mas, genes estructurales que E. coli. Desde luego, el control de la expresién génica en los eucariotae debe oer un, proceso mucho mas elaborado que en os eucariotas. ‘Asi pues, Zes el control de la expresion gentca la funcién de todo el DNA no expresado en el genoma humano, el cual constituye como minimo el 98 % del total? En la actualidad, no somos capaces de dar una respuesta catisfactoria a las proguntas anteriores. Sin embargo. como veremos después, hemos aprendido muchas Cosas subre Ja organizacion penica detallada del cromosoma eucariético. Esta informacién, sin duda, contribuira decisivamente a encontrar las res- puestas a esas preguntas. El andlisis de la curva C,t indica la complejidad del DNA La velocided a ta cual s¢ renaturaliza ef DNA cs indicatioa de las longitudes de sus secuencias tinicas. Si se corta el DNA en fragmentos uniformes de 300 10000 bp (Seccién 28-2C), se desnaturaliza y se mantiene a una concentracién baja para que lus efec- fos de agregaciin sean pequeftos, la etapa limitante de la renaturalizacion es la colision de secuencias complementarias. Una vez sc han encontrade las se cuencias complementarias mediante difusién al azat, éstas se unen rapidamente formando moleculas d= plex. La velocidad de renaturalizacion del DNA des- naturalizado se expresa por consiguiente AAIIB] [33.1] Figura 33-16 Microgratia cloctrénica de un sogmento del cromosoma, politénico de O. melanogaster. Obsérvese que las regionas situadas entre las bandas estan formadas por fibras de ‘cromating que son mAs 0 manos paraleias al ele longitudinal del cromosoma, mientras que las bandas que ‘contianen el ~~ 85% del DNA del cromosoma estén mucho mas condensedas. (Por cortesia de Gary Burkholder, University of Saskatechewan.] Capitulo 38. Expresion genica eucariotica 1121 Figura 33-17 Autorradingratia do un cromocoma politénico de ‘D. melanogaster que ha sido hibridado in situ con cDNA de la proteina del saco vitalino. Los granos oscuros (flecha) identifican la localizacion cromosomica del gen de la proteina del saco vitelino. (Tomado de Barnett, T..Pachl, G., Gergen, J. P.. y Wensink, P. C., Ceil 21, 735 (1980). Copyright © 1980 by Cell Press.) donde A y B representan las secuencias monohebra complementarias y i es una constante de velocidad de segundo orden (Seccién 13-18). Dado que (A] = [B] para el DNA duplex, la Ec. [33.1] integrada da tla ea [33.2] ical de A nf de cadenas no donde [A], €9 1a concentracion i Es conveniente medi la fracc apareadas: IAL (Ab 833] Combinaide las Les. [99.2] y [99.9], se ubticane a : fie [Alok B34] Fr estas ecriaciones, los tirminas de concentraciéin se refieren a secuencias tinicas, ya que la colision de secuencias no complementarias no permite la renatu- ralizaci6n. De ahi que, si C, es la concentracién inicial de pares de bases en disolucion, entonces fap~ 2 p31 donde x es el niimero de pares de bases de cada secuencia tinica y se conoce como la complejidad de! DNA. Por ejemplo, la secuencia repetida (AGCT),, tiene una complejidad de 4, mientras que un cromo- soma de E, coli, que consta de 4 millones de bp de secuencia no repetida, tiene una complejidad de 4 auz2_Seccidn 33-2. Organizacion gendrrica millones. Combinando las Ecs. [33.4] y [33.5] obtene- mvs 1 TGR (33.6) Cuando la mitad de las moléculas de la muestra se han renaturalzado, J = U,9 y entonces donde t,,. es el tiempo que debe transcurrir para que ‘coto ocuirra, La constante de velocidad 4 eo arash tica de la velocidad a Ja que las hebras sencillas chocan en solucion, en las condiciones empleadas, por lo que es independiente de la complejidad del DNA y, para fragmentos de DNA razonablemente cartos. de la longitud de la hohra Par In tanta, para wn Conjunto dado de condiciones, et valor.de Cylyjy depen- de sélo de la complejidad x del DNA. Esta situacién 3¢ muestra en la Fig. 33-19, que constituye una serie de representaciones de f frente a Cyt para varios DNAs, Dichas representaciones se denominan curvas Cyt (pronunciado “cot’). La complejidad de los DNAs de Ja Fig. 33-19 varia desde 1, para el duplex sintético poli(A) poli(U), hasta ~ 3x 10°, para algunas frac ciones de DNAs de mamifero. Los valores correspon- dientes de Coty. varian en consecuencia. La rapidez y sensibilidad del analisis de la curva Cyt se potencia enormemente mediante el fraccionami to del DNA renaturalizado en hidroxiapatito. El droxiapatito, camo se recordar (Seccién 28-4B), une DNA de doble hebra proferentemente al DNA mono, hebra, a concentraciones de fosiato elevadas. Por tan- 10, se pueden separar los DINAs monohebra y de doble hebra on una disolucion de DNA renaturaliza- do mediante cromatografia en hidroxiapatito y medir las cantidades de cada uno. El DNA monohebra pue- de ser renatutalizado posteriormente y repetir el pro- cove. Si ol DA que oe renaturalica ce marca radiact- vamente, se pueden detectar cantidades mucho me- ores que por unedius especuruscopicus, Asi, uwediaile cromatografia en hidroxiapatito de DNA marcado ra- diactivamente, el andlisis de la curva C,t de un DNA, cuya elevada complejidad sea tal que f,,, sea igual a dias o semanas, puede realizarse convenientemente en una pequenia fraccion de ese tiempo. B. Secuencias repetitivas Consideremos una muestra de DNA formade por secuencias con varios grados de complejidad. Su cuz- > 100 Nurwo apraxirate cetpes sla ares mms Feoties (mmm Peres y sancs ‘Ameena 90 encros 1 Avadas 1h P2028 puronssos ama Thue mm Lemorees 1 vemaceeraenes 1 Urocandsces (tuncads) NN Hird NRE ch sos ‘umerta la eompleidad rarfoiygiea > 58 Asides am Fruinovermes “0 EE Agios eR Glee ccc Hennes RE Lina o> 20 RR ries (ruse) 1 Nematodes 16-20 - 1 Ceteterados i= Exon Pr Sasa RUAN RIatA ae ears t! Algite 15 PLCS 15 ea “orgs 42 sclera, ———— 1 L al ! 208 10? 108 108 10 ao! 10%? Tomane del genoma haploide (ores de nuclebies) Figura 33-18 morfolégica de los organismos, estimaca segun el numero Distribucién de as cantidades de DNA contenidas en el ‘genoma haploide de arganismos de diversas categorias, ilustrange la paradoja del velor C. Le complejidad de sus tipos celulares, aumenta de abajo a arriba, [Segon Ralf, R.A. y Kaufman, T. C., Embryas, Genes, and Evolation, p. 814, Macmillan (1983).] va C,t, por ejemplo la Fig. 33-20, es la suma de las, ‘curvas C,t individuales para cada clase de compleji- dad del DNA. El andlisis de las curvas Cyt ha demostra~ do que las DNAs virico y procariético poseen pocas secuencias repetidas, si acaso tienen alguna (por ef., Fig 33-19 para ef M452, TA y E. cal). Bn cambio, los DNAS ‘eucaridticos presentan curvas C,t complicadas (por zi, Fig, 33-21) que deben ser consecuencia de la presencia, do segmontos de DNA de diferentes eamplojidades El analisis cinético indica que las curvas Cyt euca~ Héticaa deben atribuirse a la presencia de cuatro cla ses de DNAs definidas de forma algo arbitraria (U) secuenctas umicas (~ 1 copla/genoma haploide), (2) secuencias moderadamente repetitivas (< 10* copias/genoma haploide), (3) secuencias altamen- te repetitivas (> 10° copias/genoma haploide) y (4) repeticiones invertidas. Las secuencias y distri- buciones cromosémicas de cotos segmentos de DNA varian con las especies, por lo que no se puede hacer una descripcién unificadore de sus distribuciones. Sin embargo, como veremos més adelanie, son posibles amplias generalizaciones. Las repeticiones invertidas forman estructuras plegadas EI DNA eucaristico que se reasocia mas rapida- mente, y que representa hasta el 10% de algunos genomas, se renaturaliza con una cinética de primer orden. Al parecer, este DNA contiene secuencias in- vertidas (autocomplementarias) muy préximas, que pueden plegarse sobre si mismas formando estructu- ras plegadas, semejantes a una horquilla (fig. 33- 22a). Las secuencias invertidas pueden aislarse me- diante la adsorcion del diplex de DNA, formado a Fraccin ne asocasa, ¢ Figura 39-19 ‘Gurvas de reasociacién (Cat) de DNAs duplex cbtenidos de las procedencias indicadas. El DNA se disolvid en una solucién que contenia ion Na 0,18My se coné a una Capitulo 38, Expresion geniea euearibtica 1123 valores de Ct muy bajos, en hidroxiapatito y la de- gradacion subsiguienre de su bucle y colas mono- hebra con nucleasa SI (una endonucleasa de Aspergi- Ilus oryzae que corta preferentemente hebras Senci- lias). Las repeticiones invertidas resultantes tienen una longitud de 100 a 1000 bp, tamarios demasiado grandes para que sean producto del azar. Estudios mediante hibridacion in situ de cromosomas metafasi- cos, empleancie estas seciiencins invertidas camo som das, indican que se hallan distribuidos en muchos lugares del cromosoma. Se desconoce la funcién de las repeticiones inverti- das, tnos 2 millones de las cuales se presentan en et genoma humano. Sin embargo, ya que las estructuras ‘cuciformes formadas por estructuras plegadas apa- readas (Fig. 33-22h) san séla im paco menas estables que el correspondiente DNA diiplex normal, se ha cugeride que lar ropaticiones invertidas fancionasian cen la cromatina como una especie de interrup:or mo- Teculas EL DNA altamente repetitivo esta agrupado en los, centrémeros EIDNA altamente repetitivo consiste en agrupaciones de secuencias casi idénticas de haste 10 bp de longitu que esti repetidas en tandem miles de veces. Tales DNAs de secuencias simples pueden ser separatios habitualmente del resto del DNA cromosémico me- diante degradacion por fuerzas de cizalla, seguida de ultracentrifugacion en un gradiente de densidad de CsCl, ya que su diferente composicién en bases pro- vaca la formacion de “satélites” de la banda principal de DNA (Fig. 33-23; recordar que la densidad de flotacién del DNA en CsCl aumenta con su contenido Pas de metetions ete o 7% \ ‘ \ 14 ‘egos those eet) en | oa Ci (moles ei) longitud mecia de 400 bp. La escala superior indica el tamario gendmico de algunos de esos DNAs (MS2 y T4 son aacterislages) [Segun Brien, R. Jy Kohne, D. E., Science 161, 530 (1963) MIM Secci6n 33-2. Organizacion gen6mica en G + C; Seccion 28-4D), Las secuencias de ests DNAs, denominadas tambien como DNA. satélite, son especificas de la especie, Por ejemplo, el cangrejo ‘Cancer borealis tiene un DNA de secuencia simple que comprendo 6! 30% deci gonoma, on al que la unidad repelida es el dinucledtide AT. El DNA de Drosophila virilus muestra tres bandas satélites (Fig. 33-23), con- sistente cada una de ellas en una secuencia heptanu- dleotidica repetida diferente, aunque casi identida: s-TGLiiGA-» Satélite F ATASACT-3 g-TATTTGA-5 Satelite 5 ACA. STGTTTAA-5 ‘Sacélite II Estas comprenden el 25, 8 y 8 % de las 4,4 107 bp del genoma de D. virilus, con lo que se encuentran repetidas 11, 9,6 y 9,6 uillunes de vetes, tespectiva- mente. La hibridacion in situ de los cromosomas det ratén con RNA marcado con 2H, sintetizado a partir de moldes del DNA de secuencia simple, demuestra que este DNA ests concentrado en Ia regién heteroceomé- tica asociada con el centrOmero cromosémico (Fig. 39-24). Usta observaciéin augiere que la funigu del DNA de secuencia simple, que no es transcrito in ‘iv, es alinear los cromosomas homologos durante la meiosis y/o facilitar su recombinacién. Esta hipstesis esta apoyada por las observaciones de que los DNAs satilites som amplia oy tatslmonta oliminadas da lac células somaticas de una serie de eucariotas (los cua- Peres de mucedtdes 101 Gt 1108? 0H 4 4 csol Tee pLbtrii 1 iti Oe ww we ww ie a Got mol 66-5 Figura 39-20 Curve (G30) de una molécula hipotética de DNA que, antes de la fragmentacion, tenia una longitud de 2 millones de Op yconoleba Ue wia seuvetnd ies Ue millon Ue Up y 1000 copias de una secuencia de 1000 bp. Obsérvese la naturelezs bifésica de la curva, e Wo? 10? G1 1 10 IF 1 1 1 Cot imate s 6S Figura 33-21 Curva (C,9 Cel DNA procadente de Strongylocentrotus ‘Purpuratus (erizo de mar). [Segun Galau, G. A, Britten, A Ju y Davidson, E. H., Cell 2, 11 (1974)] les, por consiguiente, ya no san totipotentes), pero no de sus células germinales, Sin embargo, las supuestas proteinas cromosémicas que especificamente se unen a los DNAs de secuencia simple no han sido tedavia detectadas, Los DNAs moderadamente repetitivos se distribuyen en repeticiones dispersas Los DNAs moderadamente repetitivos se presentan como fragmentos de 100 a varios miles de bp, interrum- pidos pir grandec hloques de DNA sinico. Pasta de este DNA repetitivo consiste en grupos de genes repetidos en tandem que codifican productos requerides por las c#lulas en grandes cantidades, como los RNAs ribos6- micos, RNAs € histonas, La organizacon de estos genes repetidos se discute en la Seocién 33-2C. Sin embargo, la mayor parte de los DNAs moderadamen- te repetitivos, si bien pueden ser transcvitos, no cadifi- can RNAS de funcién conocida. Fl DNA mejor carace terizado de este tipo es conocido como Ia familia Alu, debido a que la mayoria de sus segmentos de ‘~ 300 bp contlenen un sitio de corte para la endonu- leasa de restriccion Alul (Tabla 28-5). La familia Alu es el DNA modetadamente repetitivo mas abundante en el genoma humano: el genoma contiene de 300 a 500 mil secuencias Alv ampliamente distriburidas que tienen, en promedio, una homolopia de! 80 al 90 % con su secuencia consenso. E] DNA Ali también apa- rete en monvs y Tuedores, y secuenclas parecidas a las Al se presentan en organismos tan distantemente relacionados como los mohos del limo, equinoder- mos, anfibios y aves, Si bien Ia familia Alu es cl DNA moderadamente repetitivo mas importante en mu- chos organismos, no 06 el tinico. Bn realidad, | genomas de los vertebrados, tal como han mostrado Jos andlisis de secuencias, contienen generalmente fa) 5 ABODE BDO BN s fe o—2 ae a oe A Figura 33-22 Eslructuras plogadas en el DNA. (a) ONA monohebra que ccontione una repeticion invertida cue, en condiciones renaturalizantes, forma un bucle de bases aparsadas, conccide como osiructura plagada. En este caso, A es ‘complementeria con A’, B con Bete. (b) Una repeticion Invertida en un DNA duplex puede adoptar una ‘conformacién cruciforme, consistente en dos estructuras plegades, una frente a otra. La estatlivad de esta estructura seria menor que la correspondiente al dplex, [Paro s0lo debico @ la energia de apareamiento perdida Dor las bases no apareadas presentes en los bucles. varios tipos diferentes de DNAs moderadamente re- petitivos. Los DNAs moderadamente repetitivos poseen funciones desconocidas Parece probable, considerando las longitudes de sus segmentos y el numero de copias, que los DNAS 170 10.6%) Wass) mH ery i i 3 FI Densélad de fotacén Figura 33-23 Patron de la densidad de flotacién del DNA de Drosophila vinlus, centrifugado hasta e! equilbrio en CsCi neutro. Se encuentran presentes tres bandas importantes ce DNA satelite (p = 1,692; 1,888 y 1,671), ademas de la banda principal de ONA (p = 1.70). (Seguin Gall, J. G.. Cohen, E. H. y Atherton, D. D., Gold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38, 417 (1973) ] Capitulo 33, Expresion génica eucariética 1125 o 5 ABODE EDCRW z Pe Ll, 3 ABO De’ EDCBA 5 vt E-e o-o e & Be ane Lhd LL a 8 wa Be o— 6 pb BOE moderadamente repetitivos que no se expresan de- sempefien varias funciones diferentes. Sin embargo, existen pocos datos experimentales que apoyen algu- na de Jas varias propuestas que han sido hechas al respecto. La de mayor eredibilidad consiste cn que los DNAs moderadamente repetitivos funcionan como secuencias de control que participan activando coor- dinadamente genes proximos. Otra posibilidad, basa da en la observacion de que el DNA Ali contiene un segmento que es homélago con el origen de replica- cién del papovavirus, es que ciertas familias de DNA maderadomente ropotitives action como ont genes de replicacion para el DNA. Un tercer tipo de fonclones que se hati propuestu para estos DNAs es que incrementan la versatilidad evolutiva de los ge- momas eucariéticos, facilitando reordenaciones

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