Comunicaciones de producto natural

Actividad química y biológica de la hoja de extractos de Chromolaena leivensis

Resumen.
Los flavonoides 3,5 -dihidroxi-7-metoxi-flavanone, 3,5 -dihidroxi-7-methoxyflavone y 3,5,7 -trihidroxi-
6-methoxyflavone fueron aislados de las hojas de C. leivensis. Las observaciones preliminares de
las células K562 (humanos eritroleucemia) utilizando el azul de tripano prueba, mostró un 90% de
viabilidad con una concentración de 100 Μg/mL; sin embargo, nuevas pruebas de los flavonoides en
concentraciones de 25, 50 y 100 μg/mL tuvieron toxicidad que afectan la morfología de las células
humanas eritroleucemia (K562) y las células del melanoma humano (A375). Inducción de la
apoptosis fue producida por 3,5 -dihidroxi-7-methoxyflavone a las 72 horas después del tratamiento
con arresto domiciliario en el G2 / M fase del ciclo celular. La A375 las células tratadas con 50 μg/mL
de 3,5 -dihidroxi-7-metoxi-flavanone para 24, 48 y 72 horas, efectos de pantalla sobre el
comportamiento del ciclo celular. El flavonoide 3,5 -dihidroxi-7-methoxyflavone tiene actividad en la
membrana mitocondrial en concentraciones de 25, 50 y 100 μg/mL, en un intervalo de tiempo de 8
a 12 horas. Los flavonoides 3,5 -dihidroxi-7-metoxi-flavanone y 3,5 -dihidroxi-7-methoxyflavone a una
concentración de 25 μg/mL aumenta la expresión de moléculas coestimuladora correspondiente al
fenotipo maduro presentado por células dendríticas con diferenciación los marcadores CD40, CD83,
CD86 y HLA-DR Los dos flavonoides en concentraciones entre 0,39 y 100 μg/mL un ligero aumento
de la proliferación de las células mononucleares de la sangre periférica en presencia y en ausencia
de la fitohemaglutinina. Estos flavonoides en concentraciones de 50 y 100 μg/mL un ligero aumento
de la proliferación de fibroblastos.

Chromolaena especies son invasoras y cosmopolita con diversidad morfológica de adaptaciones a

diferentes ambientes y son consideradas malas hierbas. Este género está constituido por 202
especies de las cuales sólo 13 han sido sometidos a estudios químicos y sólo unos pocos estudios
han incluido actividad biológica. No hay ningún informe conocido sobre la especie Chromolaena
leivensis, perglabra C., C. tacotana, C. subscandens, C. opadoclinia, C. odorata, arnottiana C., morii
C., C. Collina, C. connivens, glaberrima C., C. pseudoinsignis y C. chasleae. Se han identificado
compuestos como sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos, flavonoides, ácidos grasos cíclicos,
lactonas sesquiterpénicas, germacranolides, de Chromolaenas. Se identificó una lactona
sesquiterpénicas del extracto de diclorometano de Chromolaena opadoclina [1]. 5,3-dihidroxi-6, 7,
4'-trimethoxyflavone, 5-hidroxi-6, 7, 3', 4'-tetramethoxyflavone, de 5-hidroxi, 6, 7, 3', 4', 5'-
pentamethoxyflavone y un derivado 3,4-Dihidroxiacetofenona común se han identificado en
Chromolaena arnottiana [2]. El heliangolide 4'-dihydrochromolaenid y una lactona sesquiterpénicas
fueron encontrados en Chromolaena glaberrima [3]. El ácido 7α-acetoxy-trans-amarre fue
identificado en Chromolaena collina y morii de Chromolaena germacrane D, escualeno, flavonoles y
prostaglandina tipo ácidos grasos encontraron [5b].

Se han realizado muchos estudios sobre la actividad biológica<br>Chromolaena odorata y unos

pocos en C. hirsuta, C. perglabra C. moritziana, C. modificaba y C tacotana. Entre las actividades
biológicas probadas que son las siguientes destacado: pesticidas, repelentes de insectos,
Antiprotozoarios, tripanocidas, insecticida, antibacteriano, antihongos citotóxica, antioxidante,
agente mutagénico, proliferativo de humano queratinocitos y fibroblastos. Taleb et al [6] se evaluó
el efecto antiprotozoario de extractos totales y purificada de flavonoides de Chromolaena hirsuta y
actividad determinada antiprotozoario contra tripomastigotos de Trypanosoma cruzi y los
amastigotes de Leishmania amazonensis; los extractos crudos reducidos significativamente
viabilidad del parásito y los flavonoides demostraron un efecto antiproliferativo sobre estos. Phan
encontró fenólico compuestos de Chromolaena odorata, p-hidroxibenzoico ácido y ácido p-cumárico,
flavonas, flavanonas y chalcones proteger las células de la piel del daño oxidativo y reparación de
afecciones de la piel [7]. Bouda observó el efecto de aceites esenciales de hojas de Chromolaena
odorata en el mortalidad de Sitophilus Curculionidae (Coleoptera) con un LD50 de 6,78% [8]. Thang
evaluó el efecto de antioxidantes de extractos de Chromolaena odorata humanos cutáneos
fibroblastos midiendo el efecto protector contra daño de peróxido de hidrógeno y de
hypoxanthinexanthine oxidasa [9]. Phan demostró que extraen del Eupolin complejos de adhesión y
fibronectina en queratinocitos humanos 10]. Se encontraron incremento en la expresión de la
integrina b1 y B4 inducido por el extracto en concentraciones de 0,1 y 1 Μg/mL, pero la expresión se
redujo en dosis más altas de Eupolin (10 a 150 μg/mL). Otros investigadores [11] estudiado la
proliferación de fibroblastos y células endoteliales tratados con hojas de hydroethanolic los extractos
de Chromolaena odorata (Eupolin). El mayor crecimiento de fibroblastos y células endoteliales fue
encontrado en concentraciones de 10 µg/mL y 100 μg/mL de Eupolin Extracto, pero resultó para ser
tóxico en concentraciones superior a 250 μg/mL.
Tabla 1: Efecto de los flavonoides sobre la viabilidad celular a las 24h de tratamiento.

Tabla 2: Concentraciones que afectan la morfología de la célula.

Tabla 3: Porcentaje de células en cada fase del ciclo celular

Tabla 4: Porcentaje de células despolarizadas en varias concentraciones de cada uno Flavonoide después de
8h y 12h de tratamiento.

Tabla 5: Porcentaje de viabilidad de células normales en varias concentraciones de los flavonoides y controles
vincristina y DMSO.

Tabla 6: Porcentaje de viabilidad de células normales en varias concentraciones de los flavonoides y controles
vincristina y DMSO.

Tabla 7: Porcentaje de la viabilidad de fibroblastos a varias concentraciones de los flavonoides y control

vincristina después de 24h de tratamiento.

Las especies de Chromolaena perglabra, C. tacotana, C. modificaba, C. subscandens, C. leivensis

y C. scabra son encuentran en la región Cundiboyacense de Colombia y C. barranquillensis se
encuentra en la costa atlántica., estos especies no han sido estudiadas en profundidad con respecto
a su actividades biológicas, específicamente como Agentes antiparasitarios contra el Chagas y
Leishmania y los citotóxicos y potencial antitumoral.

En esta investigación se estudió la producción de metabolitos secundarios en las hojas de C.

leivensis y aislado los flavonoides 3, 5-dihidroxi-7-methoxyflavanone, 3, 5-dihidroxi-7-
methoxyflavone y 3,5,7-6-trihidroxi-methoxyflavone, los dos primeros compuestos fueron probados
por su actividad en líneas celulares de cáncer. Uso de la prueba de azul de tripano, se observó en
las células K562 porcentajes de viabilidad (Eritroleucemia) de 90% utilizando una concentración de
100 μg/mL, lo que indica que flavonoides en estas concentraciones no son citotóxicos. El flavonoides
en concentraciones de 25, 50 y 100 Μg/mL mostró toxicidad que afectan a la morfología de las
células de la Eritroleucemia humana (K562) y humanos células del melanoma (A375). Inducción de
la apoptosis fue producido por los flavonoides 3, 5-dihidroxi-7-methoxyflavone a las 72 horas de
tratamiento con detención en G2 / M. en Células A375 tratadas con 50 μg/mL de los flavonoides para
24, 8 y 72 horas, se observó que el flavonoide 3,5 -dihidroxi-7-methoxy-flavanona influye en el
comportamiento del ciclo celular. Los flavonoides 3, 5-dihidroxi-7 -methoxyflavone tienen actividad
sobre membrana mitocondrial a concentraciones de 25, 50 y 100 μg/mL, en el tiempo intervalos de
8 a 12 horas. También se observó que la<br>flavonoides 3, 5-dihidroxi-7-methoxy-flavanona y 3,5
dihidroxi-7-methoxyflavone en una concentración de 25 Μg/mL aumenta la expresión de
coestimuladoras correspondiente al fenotipo presentado por moléculas células dendríticas maduras
con marcadores de diferenciación CD40, CD83, CD86 y HLA-DR. Los dos flavonoides en
concentraciones entre 0.39 y 100 μg/mL ligeramente aumenta la proliferación de sangre periférica
células mononucleares en presencia y en ausencia de fitohemaglutinina. También fue determinado
que del fibroblasto<br>proliferación aumentó ligeramente a concentraciones de 50 y 100 μg/mL de
estos flavonoides.
Experimental
Los materiales fueron recogidos en las afueras de Bogotá, Colombia; una muestra de control fue
enviada al nacional Herbario de Colombia para la identificación y determinado como Chromolaena
leivensis (Hieron). Rey y H. Rob. Con el número 535 COL 219 Colombia Herbario Nacional. La
extracción se llevó a cabo en Soxhlet con etanol al 95% (4L) con un rendimiento de 31.04%. 200 g
de extracto fue mezclado con gel de sílice (1:2) y sólido extraído - líquido con éter de petróleo (3 L),
tolueno (2L), diclorometano (2L), acetato de etilo (2L) y metanol (3L), sucesivamente, con
rendimientos de 2,66% gasolina, 29.09% de tolueno, 15.68% para CH2Cl2, 14,66% AcOEt y 30.08%
MeOH. Cinco gramos de la fracción tolueno estaban sometidas a cromatografía en columna con
sílica gel (100 g Silicagel Merck Kieselgel), liberador con éter de petróleo, tolueno y metanol en varias
proporciones. Por flavonoides de cristalización fraccionada tres fueron aislados e identificados como
3.5-dihidroxi-7 -methoxyflavanone, 3.5-dihidroxi-7-methoxyflavone [13] y 3,5,7-trihidroxi-6-
methoxyflavone. [14].

Viabilidad celular: viabilidad celular se midió con trypan azul, un cromóforo cargado negativamente
que interactúa con membranas celulares cuya integridad ha sido alterado. Vida excluyen el colorante
mientras que las células muertas permiten entrada de células y son manchados. El efecto de los
flavonoides 3, 5-dihidroxi-7 -Metoxi flavanone y 3, 5-dihidroxi-7-methoxyflavone en poblaciones de
células con concentraciones menores o iguales a 100 μg/mL se analizaron a las 24 y 48 horas. Los
datos de se enumeran en la tabla 1.

Evaluación de distribución de ciclo celular: para demostrar la efecto de los flavonoides 3, 5-

dihidroxi-7-methoxy-flavanona y 3, 5-dihidroxi-7-methoxyflavone en ciclo celular en la línea de
células A375 tumor, las células se sincronizaron en G1 fase por el retiro total de suero bovino fetal 3
días. Una vez sincronizado, las células se cultivan en placas de twelvewell en una densidad de
400.000 células/mL y se incubaron en presencia y en ausencia de los compuestos de prueba.
Después de la el período de incubación, las muestras fueron analizadas en un flujo Citometría,
utilizando el programa Cell Quest Pro y posteriores Análisis fue realizado por el programa de Modfit
V. 2.0. (FACSCalibur, Beckton Dickinson). La calibración de parámetros fueron establecidos y la
linealidad del laser fue medido para su posterior análisis con el programa Modfit. Los datos se
muestran en la tabla 3.

Despolarización de la membrana mitocondrial: el yoduro de 5, 5', 6, 6-tetrachloro-1, 1', 3, 3'-

tetraethylbenzimidazolyl carbocyamine (JC-1) es un compuesto catiónico lipofílico sensible a
cambios en el potencial de membrana mitocondrial. En las células sanas la mitocondria etiquetada
emite rojo fluorescencia. La carga negativa creada por intacto membrana mitocondrial permite el JC-
1, que tiene deslocalizadas carga positiva para entrar en el mitocondrial matriz donde se acumula.
Cuando llega un crítico concentración forma agregados J que emiten rojo fluorescencia. En las
células apoptóticas, el potencial de membrana de no se acumulan las mitocondrias disminuye y el
JC-1 dentro del orgánulo y permanece en el citosol como un fluorescencia de emisión verde de
monómero. El rojo total forma tiene un máximo de absorción / emisión 585/590 nm, mientras que
para el monómero verde es 510/527 nm. La prueba fue realiza utilizando el fluorocromo catiónico
lipofílico JC-1, a concentración de 10 μg/mL de una solución diluida en DMSO y se conservaron a 4°
C. Las células K562 (1 X 106) fueron tratadas con flavonoides 3.5-dihidroxi-7-methoxyflavanone y
3.5-dihidroxi-7-methoxyflavone 24 bien placas y leyó en 4, 8 y 12 horas. Las células fueron entonces
se incubaron durante 10 minutos a 37° C y leer inmediatamente utilizando un citómetro de flujo,
utilizando el programa Cell Quest Pro (FACSCalibur, Beckton Dickinson). Los datos obtenidos son
se muestra en la tabla 4.

Análisis de las células dendríticas: mononucleares de sangre periférica se obtuvieron células

(PBMC) y lavadas en RPMI 1640 suplementado con 1% de suero bovino fetal (FBS). El tripán azul
evaluaron la viabilidad y celular los números de coloración y célula de Neubauer recuento de cámara,
respectivamente. Se incubaron las células CD14 en RPMI 1640 en la presencia de 35 μg/mL de
interleucina (IL-4) y 50 μg/mL factor de crecimiento de granulocitos y monocitos GM-CSF (R&D
sistema) durante 5 días de la cultura, verificando su morfología por microscopia ligera. En el día 5
de cultivo, trataron DCs con diferentes concentraciones (12, 25 y 50 μg/mL) de flavonoides 3, 5-
dihidroxi-7-methoxy-flavanona y 3,5- dihidroxi-7-methoxyflavone y 1 μg/mL de lipopolisacárido (LPS)
como control positivo para la diferenciación. La expresión de marcadores de superficie fue
determinada por el flujo de cytometry después de 48 horas usando los anticuerpos contra el CD40,
CD83, CD86 y HLADR. Los datos obtenidos demostraron proliferación de las células dendríticas.
Evaluación del efecto de los flavonoides en el viabilidad de MPC y fibroblastos: el efecto de
flavonoides 3, 5-dihidroxi-7-methoxy-flavanona y 3, 5-dihidroxi-7-methoxyflavone en viabilidad
celular de periférico las células mononucleares (MPC) de sangre fue analizada por siembra de las
células en placas de 96 pozos a una densidad de 200.000 células/pozo en 200 μL de RPMI 1640 sin
rojo de fenol suplementado con 10% FBS y estimulado durante 12 horas con el mitógeno PHA (250
μL/100 mL) y luego se coloca en contacto con diferentes concentraciones de cada uno de los
flavonoides. Las células tratadas con DMSO (vehículo) fueron utilizadas como control. Los
fibroblastos fueron analizados de una manera similar. Brevemente, las células fueron sembradas a
una densidad de 15.000 células/pozo en 200 ΜL de medio en una placa de 96 pocillos y permitió a
adherirse para 24 horas; diferentes concentraciones de los flavonoides fueron añadidos e incubadas
por 24 horas (37° C, 5% CO2, 95% humedad). Tras la incubación con los flavonoides, 110 μL de
medio fue agregado a 10 μL de MTT de 12 mM y se incuba durante 4 horas (37° C, 5% CO2, 95%
de humedad) protegidos de la luz. Después de este tiempo, los cristales de precipitado resultante
del metabolismo de MTT por mitocondrias de células viables se disolvieron con 100 μL de SDS-HCl
0.01M. Las placas se incubaron nuevamente bajo las mismas condiciones durante 4 horas. La
intensidad de color fue leer absorbancia a 540 nm en un lector de ELISA (Labsystems Multiskan
MCC/3340).