9/10/17

Sample Preparation
- Measure the tea samples as shown in the table below in a beaker, label the beaker in
order to avoid confusion
- Notes: when measuring the tea, pour tea leaves out of the bags first in order to prevent
contamination.

Brand Mass (g) Color stated in label

ตรามังกรบิน 1.4038 INS 124 (Ponceau 4R, Red),

INS110 (Sunset Yellow FCF,
Yellow), INS 102 (Tartrazine,
Yellow)

ตรามือ (สีแดง) 1.4259 INS 110 (Sunset Yellow FCF,

Yellow)

ตรามือ (สีทอง) 1.4095 INS 110 (Sunset Yellow FCF,

Yellow)

ตรางูเหา่ 1.4411 -

ตราหัวเสือ 3 ดาว 1.4511 INS 110 (Sunset Yellow FCF,

Yellow), INS 122
(Carmoisine, Red)

ตราสุนัขตาํ รวจ 1.4264 -

OK 1.4579 -

- Add 30 ml of distilled water to each of the beaker containing teas

- Heat the beakers for 9 minutes with 105 celsius by using the hot plate
- Change the temperature of the hot plate to 150 celsius for the last 4 minutes
- Let the sample cool down
- Prepare another set of beakers and a set of glass funnel
- Fold the filter paper and put it into the funnel in order to perform filtration
- Filter each of the cooled tea samples
TLC
- Prepare
Stationary phase: Silica gel 60G F254 (8.5 x 6 cm)
Mobile phase: Isopropyl alcohol (C 3 H 8 O) : Ammonia (N H 3 ) : Distilled Water (H 2 O)
( 10 : 1 : 1 )
- Use volumetric pipette to measure 10 ml of isopropyl alcohol, 1 ml of ammonia, and 1 ml
of distilled water
- Make a line on the TLC plate by using pencil→ start = 1 cm from edge, end = 7cm from
the start line
- Apply the sample ( 1μl ) by using micropipette
- Let the TLC run (Time used during the TLC process : approximately 1 hour)
Result

​ รามั งกรบิน, ตรามือ (สีแดง), ตรามือ (สีทอง), ตรางูเหา่ , ตราหั วเสือ 3 ดาว, ตราสุนัขตาํ รวจ, OK
From left to right: ต

Observations:
- Retention factor of each of the TLC plate is not the same
- All samples show 1 similar color
- Sample #1 (มังกร) has another pale yellow spot
- Sample #4 (งูเหา่ ) has a red spot
- Sample #6 (สุนัขตาํ รวจ) has a red spot at relatively similar position as #4, but the spot is bigger.
Also, there is a yellow spot at a relatively similar position as shown in sample #1.
- The lines drawn were not very straight
- The sample dots were too wide (could be seen from the big splotches)
Changes for next meeting (25/10/17)
- Increase the concentration of the tea sample by 5 times
- (Tea 7 g: Water 30 ml)
- Either boil the tea or use preheated water in order to prepare the sample
- Instead of applying the sample only once, apply it repetitively on the same spot in order
to intensify and ensure that there was enough sample
- Find methods to decrease the spot size
__________________________________________________________________________

25/10/17
Plan:
● Make stock from standard → 0.1 g in 100 ml Distilled water
● Test TLC separation in different mobile phase. Choose a mobile phase with best
separation.
● Prepare different dilution of standards to generate a calibration curve
● If enough time, test samples

Mobile Phase
1. Ethyl acetate : ethanol: Distilled water (75:35:30)
2. Ethyl Acetate : Ethanol : Ammonia 30% (75 : 45 : 15)
3. Ethyl Acetate : Ethanol : Water (75 : 35 : 30)
4. Isopropyl alcohol : distilled water : ammonia 30% (10 : 1 : 1)
 Dye Mass (g) Concentration (%w/v)

Ponceau 4R 0.1542 0.1542%

Tartrazine 0.1887 0.1887%

Sunset Yellow FCF 0.1310 0.1310%

Carmoisine 0.1721 0.1721%

TLC
● Spot the mixture of all colors (1:1:1:1 v/v) onto the TLC plate (0.6 microlitres per dot,
using microsyringe)
○ 100%
○ 75%
○ 50%
○ 25%
● Spot the dyes with different dilution separately
● Let the TLC run for 5 cm on the 2.5 x 7 cm Silica Gel 60G F254. Use the four different
mobile phases mentioned in order to determine the mobile phase that would result the
best separation of the dyes.

Data
 TLC plate ran with the first mobile phase: Ethyl Acetate : Isopropanol : Distilled water (75 : 35: 30)
From left to right : 25% ; 50% ; 75%; 100%

● From the TLC plate, it could be seen that the dyes haven’t separated entirely
○ Only 3 spots instead of 4 spots
○ Color is not very clear
● Most of the spots are nowhere near the solvent front
○ Either run the same system again, but with increased length of the solvent front
from the start line, or change the mobile phase
● In terms of time consumption, this mobile phase took approximately 15 minutes to run for
5 cm.
● Moreover, during the solvent preparation process, it could be seen that the solvents
didn’t mix entirely, creating a slight turbid solution.
 TLC plate ran with the second mobile phase: Ethyl Acetate : Ethanol : Ammonia 30% (75 : 45: 15)
From left to right : 25% ; 50% ; 75%; 100%

● From the TLC plate, it could be seen that there’s no separation of dyes and there’s only
one dot per sample at the starting line, where the samples are originally dotted.
○ The mobile phase should be changed
● In terms of time, it took the solvent about 5 - 10 minutes to run 5 cm on the plate
● During the solvent preparation stage, it could be seen that the compounds couldn’t be
mixed
 TLC plate ran with the third mobile phase: Ethyl Acetate : Ethanol : Distilled water (75 : 35: 30)
From left to right : 25% ; 50% ; 75%; 100%

● From the TLC plate, it could be seen that this mobile phase could be used to
successfully separate the four dyes present within the mixture
● However, there are tails
● Hence, it is not the best mobile phase to be used in the experiment
● During solvent preparation process, the compounds mixed together well and evenly

TLC plate ran with the fourth mobile phase: Isopropyl alcohol : Ammonia 30% : Distilled water (10 : 1: 1)
From left to right : 25% ; 50% ; 75%; 100%

● From the TLC plate, it could be seen that this mobile phase could be used to
successfully separate the four dyes present within the mixture and there’s no tail
● Hence, it is the best mobile phase to be used in the experiment
● During solvent preparation process, the compounds mixed together well and evenly
After the best mobile phase: ​Isopropyl alcohol : Ammonia 30% : Distilled water (10 : 1: 1) ​was determined,
the dyes (0.1 g dye in 100 ml distilled water) was spotted separately

​TLC plate ran with the fourth mobile phase: Isopropyl alcohol : Ammonia 30% : Distilled water (10 : 1: 1)
From left to right: Carmoisine ;Ponceau 4R ; Sunset Yellow FCF; Tartrazine (spotted once)

TLC plate ran with the fourth mobile phase: Isopropyl alcohol : Ammonia 30% : Distilled water (10 : 1: 1)
From left to right: Carmoisine ;Ponceau 4R ; Sunset Yellow FCF; Tartrazine (spotted twice)
 ● It could be seen that Ponceau 4R has the least retention factor, followed by tartrazine,
carmoisine, and sunset yellow FCF respectively
○ Hence, from most to least polarity: Ponceau 4R > Tartrazine > Carmoisine >
Sunset Yellow FCF
● Errors:
○ The mobile phase has tail on it, and was not as accurate as it is supposed to be
○ It did not run straightly

Teas
1. Weigh the teas as shown in the table in beakers
Tea Mass (g) Concentration (%w/v)

ตรามือ (สีแดง) 7.1664 17.916%

ตรามือ (สีทอง) 7.0213 17.55325%

งูเหา่ 7.3125 18.28125%

มังกรบิน 6.9333 17.33325%

สุนัขตาํ รวจ 6.9593 17.39825%

OK 6.9893 17.47325%

หัวสิงหส
์ ามดาว 7.0493 17.62325%

2. Heat distilled water until boiled

3. Add 40 ml of heated distilled water into each beakers
4. Heat the beakers of tea and distilled water on a hot plate with the temperature of 250 Celsius
for ten minutes
5. Wait for the teas to cool down. Meanwhile, prepare beakers, filter paper, and funnel for
filtration.
6. Filter the cooled tea
7. Using a microsyringe, dot 0.6 microlitres of the color mix and the tea samples onto a 6 x 8.5
cm Silica Gel 60G F265 plate with 7cm space for it to run.
Results

From left to right:​ Standard color mix, ตรามั งกรบิน, ตรามือ (สีแดง), ตรามือ (สีทอง), ตรางูเหา่ , ตราหั วเสือ 3 ดาว, ตราสุนัขตาํ รวจ,
OK
From left to right:​ Standard color mix, ตรามั งกรบิน, ตรามือ (สีแดง), ตรามือ (สีทอง), ตรางูเหา่ , ตราหั วเสือ 3 ดาว, ตราสุนัขตาํ รวจ,
OK
From left to right:​ Individual standard dyes (spotted twice), Individual standard dyes (spotted once), standard dye
mix with different dilution (spotted twice), standard dye mix with different dilution (spotted once), standard dye mix
and the tea samples

Observations:
● The dyes from the teas were successfully separated
● The concentration of the standard dye mix might be too high
● The two dyes, Ponceau 4R and Sunset Yellow FCF weren’t completely separated; for one plate,
sunset yellow appears to be at the top of Ponceau 4R and vice versa for the other plate
● There are some dyes that could be ponceau 4R. However, more experiments would be needed in
order to determine it.
● The shape of the dyes are different when spotted individually and spotted as a mixture
● The retention factor of different TLC plate with same mobile phase was different
● The other sample ran in a curved way, might be because the TLC plate was too big or because
the plate wasn’t not placed straightly into the beaker/chamber.
● There seems to be another color on two within the tea, next meeting check other color as our
standard too
Changes/researches for next meeting (9/11/17)
- Why the TLC ran differently?
- Why is the spot of sunset yellow look sickle-shaped?
- Using more color as standards
- (Maybe) another mobile phase to be used in the experiment
- Quantitative determination of dyes using computer programs

9/11/17
Process of Quantifying
1. Select image, open it in ImageJ program
2. Convert image to grayscale, by selecting image → type → 32 bit
3. Adjust brightness by selecting image → adjust → brightness contrast
4. Select the rectangular tool, draw around the band (make sure that it covers the whole
thing)
5. Select analyze → gels → select first lane (command 1)
6. Then draw the box from the first lane to second band of the gel
7. Select analyze → gels → select next lane (command 2)
8. Repeat steps 6 & 7 until all of the bands are completed
9. To finish select analyze → gels → plot lanes (command 3)
10. Then select straight line tool from the tool menu and draw the line from a side of a peak
base to another.
11. Repeat step 10 until all is completed
12. Select wand tool from the tool menu, select each band peak (they will outline peaks into
yellow color)
13. Another window called results will appear, showing the peak area
14. Copy and paste results into a spreadsheet

X-axis: Concentration (micrograms/mL): concentration → weight by volume

Y- axis: area under the peak
To calculate the concentration:
grams of standards portion of the substance
mL of water × total number of substances
Convert g /mL to μg/mL by multiplying 106 to the value
Ponceau 4R

0.1542grams 1
100mL × 4 = 0.0003855g/mL → 385.5μg/mL
25% = 0.25 × 385.5 = 96.375 µg/mL
50% = 0.5 × 385.5 = 192.75 µg/mL
75% = 0.75 × 385.5 = 289.125 µg/mL
100% = 385.5 µg/mL
Tartrazine

0.1887grams 1
100mL × 4 = 0.00047175g/mL → 471.75μg/mL
25% = 0.25 × 471.75 = 117.9375 µg/mL
50% = 0.5 × 471.75 = 235.875 µg/mL
75% = 0.75 × 471.75 = 353.8125 µg/mL
100% = 471.75 µg/mL
Carmoisine

0.1721grams 1
100mL × 4 = 0.00043025g/mL → 430.25μg/mL
25% = 0.25 × 430.25 = 107.5625 µg/mL
50% = 0.5 × 430.25 = 215.125 µg/mL
75% = 0.75 × 430.25 = 322.6875 µg/mL
100% = 430.25 µg/mL
Sunset Yellow

0.1310grams 1
100mL × 4 = 0.0003275g/mL → 327.5μg/mL
25% = 0.25 × 327.5 = 81.875 µg/mL
50% = 0.5 × 327.5 = 163.75 µg/mL
75% = 0.75 × 327.5 = 245.625 µg/mL
100% = 327.5 µg/mL

____________________________________________________________________________
20/11/17

● Experimenting on the mobile phase

1. Isopropyl Alcohol : Ammonia : Distilled Water → (10:3:1)

Observation: ​Ponceau 4R and tartrazine are not separating while sunset yellow and
carmoisine are separating well
2. Isopropyl Alcohol : Ammonia : Distilled Water → (10:1:3)
 3. Isopropyl Alcohol : Ammonia : Distilled Water → (12:1:1)

Observation: ​sunset yellow and carmoisine are not separating while ponceau 4R and tartrazine
are separating well

4. Isopropyl Alcohol : Ammonia → (10:2)

5. Isopropyl Alcohol : Ammonia → (12:3)

6. Isopropyl Alcohol : Ammonia → (8:4)

7. Isopropyl : Ammonia: Distilled water → (10:1:1)
Observation: ​Sunset yellow and carmoisine are not separated completely.

8. Isopropyl Alcohol : Ammonia → (4:1)

Observation: ​All of the dyes are separated fully.
Overall Observation
The mobile phase that was able to separate all four dyes the most successful is mobile phase
#4 (4:1 Isopropyl Alcohol : Ammonia)

Tea sample

Tea Mass (g) Concentration (%w/v)

ตรามือ (สีแดง) 7.0468 17.617%

ตรามือ (สีทอง) 7.1237 17.80925%

งูเหา่ 7.3823 18.45575%

มังกรบิน 7.1130 17.7825%

สุนัขตาํ รวจ 6.9780 17.445%

OK 7.3134 18.2835%

หัวสิงหส
์ ามดาว 7.3594 18.3985%
Dilution of standards

Concentrati Volume of Concentrati Concentrati Concentrati Concentrati

on the standard on of on of on of on of Sunset
being Ponceau 4R Tartrazine Carmoisine yellow (w/v)
spotted (µl) (w/v) (w/v) (w/v)

50% 0.6 0.19275 µg/µl 0.23588 µg/µl 0.21513 µg/µl 0.16375 µg/µl

75% 0.9 0.28913 µg/µl 0.35381 µg/µl 0.32269 µg/µl 0.24563 µg/µl

100% 1.2 0.3855 µg/µl 0.47175 µg/µl 0.43025 µg/µl 0.3275 µg/µl

125% 1.5 0.48188 µg/µl 0.58969 µg/µl 0.53782 µg/µl 0.40938 µg/µl

150% 1.8 0.57825 µg/µl 0.70863 µg/µl 0.64538 µg/µl 0.49125 µg/µl
ISO-OH : NH3
Tartrazine
Number Intensity Substance

1 303.92 ชาตรามือ (สีแดง)

2 111.021 ชาตรามือ (สีทอง)

3 943.648 งูเหา่

4 0 มังกรบิน

5 0 สุนัขตาํ รวจ

6 0 OK

7 0 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 16552.007 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 4990.016 50% Standard Mix

10 7285.35 75% Standard Mix

11 10592.35 100% Standard Mix

12 11882.108 125% Standard Mix

13 14537.057 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 303.92 Error (-4.4572 x 10−3 )

ชาตรามือ (สีทอง) 111.021 Error (-0.01408)

งูเหา่ 943.648 0.02744

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 0 0

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0

Carmoisine
Number Intensity Substance

1 279.092 ชาตรามือ (สีแดง)

2 316.799 ชาตรามือ (สีทอง)

3 453.276 งูเหา่

4 233.234 มังกรบิน

5 576.92 สุนัขตาํ รวจ

6 0 OK

7 360.092 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 16341.777 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 8768.309 50% Standard Mix

10 11576.723 75% Standard Mix

11 13653.43 100% Standard Mix

12 14243.309 125% Standard Mix

13 9767.652 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 279.092 Error (-2.1802)

ชาตรามือ (สีทอง) 316.799 Error (-2.1717)

งูเหา่ 453.276 Error (-2.1402)

มังกรบิน 233.234 Error (-2.1909)

สุนัขตาํ รวจ 576.92 Error (-2.1117)

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 360.092 Error (-2.1617)
 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 279.092 0.0763

ชาตรามือ (สีทอง) 316.799 0.3830 / 0.0767

งูเหา่ 453.276 0.0781

มังกรบิน 233.234 0.0758

สุนัขตาํ รวจ 576.92 0.0794

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 360.092 0.0771
Ponceau 4R
Number Intensity Substance

1 2776.501 ชาตรามือ (สีแดง)

2 6780.463 ชาตรามือ (สีทอง)

3 17457.735 งูเหา่

4 0 มังกรบิน

5 17322.827 สุนัขตาํ รวจ

6 0 OK

7 0 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 66472.63 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 41302.759 50% Standard Mix

10 55928.609 75% Standard Mix

11 61372.831 100% Standard Mix

12 50429.103 125% Standard Mix

13 47259.659 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 2776.501 Error (-6.8987)

ชาตรามือ (สีทอง) 6780.463 Error (-6.2971)

งูเหา่ 17457.735 Error (-4.6929)

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 17322.827 Error (-4.7132)

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0

Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 2776.501 error

ชาตรามือ (สีทอง) 6780.463 error

งูเหา่ 17457.735 error

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 17322.827 error

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0
Sunset Yellow
Number Intensity Substance

1 25354.07 ชาตรามือ (สีแดง)

2 22478.149 ชาตรามือ (สีทอง)

3 22846.856 งูเหา่

4 31433.09 มังกรบิน

5 18896.836 สุนัขตาํ รวจ

6 23543.856 OK

7 22018.584 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 4031.442 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 5650.066 50% Standard Mix

10 4723.501 75% Standard Mix

11 4982.451 100% Standard Mix

12 6598.643 125% Standard Mix

13 5207.329 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 25354.07 16.8080

ชาตรามือ (สีทอง) 22478.149 14.4289

งูเหา่ 22846.856 14.7339

มังกรบิน 31433.09 21.8370

สุนัขตาํ รวจ 18896.836 11.4662

OK 23543.856 15.3105

หัวสิงหส
์ ามดาว 22018.584 14.0487
 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 25354.07 error

ชาตรามือ (สีทอง) 22478.149 0.5676 / 0.5229

งูเหา่ 22846.856 0.5568 / 0.5352

มังกรบิน 31433.09 error

สุนัขตาํ รวจ 18896.836 0.6044 / 0.4704

OK 23543.856 error

หัวสิงหส
์ ามดาว 22018.584 0.5757 / 0.5129
ISO-OH : NH3 : DI
Tartrazine
Number Intensity Substance

1 515.527 ชาตรามือ (สีแดง)

2 217.092 ชาตรามือ (สีทอง)

3 12244.423 งูเหา่

4 0 มังกรบิน

5 0 สุนัขตาํ รวจ

6 0 OK

7 0 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 24570.927 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 37823.149 50% Standard Mix

10 43443.898 75% Standard Mix

11 40616.898 100% Standard Mix

12 46272.233 125% Standard Mix

13 52640.718 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 515.527 Error (-1.1155)

ชาตรามือ (สีทอง) 217.092 Error (-1.1264)

งูเหา่ 12244.423 Error (-0.6889)

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 0 0

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0
 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 515.527 0.8062 / 0.5787 / 0.4212 /

0.1937

ชาตรามือ (สีทอง) 217.092 0.8073 / 0.5743 / 0.4256 /

0.1926

งูเหา่ 12244.423 error

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 0 0

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0
Carmoisine
Number Intensity Substance

1 436.092 ชาตรามือ (สีแดง)

2 268.678 ชาตรามือ (สีทอง)

3 544.548 งูเหา่

4 649.77 มังกรบิน

5 2054.225 สุนัขตาํ รวจ

6 0 OK

7 2276.291 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 10061.877 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 12154.827 50% Standard Mix

10 14596.626 75% Standard Mix

11 13630.798 100% Standard Mix

12 20537.011 125% Standard Mix

13 22530.647 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 436.092 Error (-0.2247)

ชาตรามือ (สีทอง) 268.678 Error (-0.2315)

งูเหา่ 544.548 Error (-0.2204)

มังกรบิน 649.77 Error (-0.2161)

สุนัขตาํ รวจ 2054.225 Error (-0.1595)

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 2276.291 Error (-0.1506)

Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 436.092 error

ชาตรามือ (สีทอง) 268.678 error

งูเหา่ 544.548 error

มังกรบิน 649.77 error

สุนัขตาํ รวจ 2054.225 error

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 2276.291 error
Ponceau 4R
Number Intensity Substance

1 1726.217 ชาตรามือ (สีแดง)

2 2414.924 ชาตรามือ (สีทอง)

3 7973.723 งูเหา่

4 7012.673 มังกรบิน

5 7294.016 สุนัขตาํ รวจ

6 0 OK

7 0 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 33235.827 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 20715.128 50% Standard Mix

10 26873.978 75% Standard Mix

11 27982.463 100% Standard Mix

12 30092.07 125% Standard Mix

13 38911.04 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 1726.217 Error (-0.2760)

ชาตรามือ (สีทอง) 2414.924 Error (-0.2593)

งูเหา่ 7973.723 Error (-0.1240)

มังกรบิน 7012.673 Error (-0.1474)

สุนัขตาํ รวจ 7294.016 Error (-0.1406)

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0

Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 1726.217 0.0832

ชาตรามือ (สีทอง) 2414.924 0.0852

งูเหา่ 7973.723 0.1021

มังกรบิน 7012.673 0.0991

สุนัขตาํ รวจ 7294.016 0.1

OK 0 0
 หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0

Sunset Yellow
Number Intensity Substance

1 22763.635 ชาตรามือ (สีแดง)

2 19497.957 ชาตรามือ (สีทอง)

3 23485.22 งูเหา่

4 28784.141 มังกรบิน

5 19863.442 สุนัขตาํ รวจ

6 21002.028 OK

7 20484.371 หัวสิงหส
์ ามดาว

8 17795.321 100% Standard Mix

(แผน
่ sample)

9 5219.463 50% Standard Mix

10 6452.789 75% Standard Mix

11 6027.668 100% Standard Mix

12 6228.073 125% Standard Mix

13 3288.454 150% Standard mix

 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 22763.635 Error(-3.1426)

ชาตรามือ (สีทอง) 19497.957 Error(-2.4883)

งูเหา่ 23485.22 Error(-3.2872)

มังกรบิน 28784.141 Error(-4.3488)

สุนัขตาํ รวจ 19863.442 Error(-2.5616)

OK 21002.028 Error(-2.7897)

หัวสิงหส
์ ามดาว 20484.371 Error(-2.6860)
 Substance Intensity Concentration (g/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 22763.635 0.5713 / 0.2576

ชาตรามือ (สีทอง) 19497.957 0.5793 / 0.2246

งูเหา่ 23485.22 0.5694 / 0.265

มังกรบิน 28784.141 0.5537 / 0.3171

สุนัขตาํ รวจ 19863.442 0.5784 / 0.2282

OK 21002.028 0.5757 / 0.2397

หัวสิงหส
์ ามดาว 20484.371 0.577 / 0.2345
26/12/17
Substance Dilution Concentration
(µg/µl)
Tartrazine 50% 0.23588
75% 0.35381
100% 0.47175
125% 0.58969
150% 0.70863
Ponceau 4R 50% 0.19275
75% 0.28913
100% 0.3855
125% 0.48188
150% 0.57825
 Substance Intensity Concentration (µg/µl)

50% STD 11917.451 0.19275

75% STD 15342.208 0.28913

100% STD 20728.108 0.3855

125 % STD 26116.886 0.48188

150% STD 29793.078 0.57825

Substance Intensity Concentration (µg/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 2784.083 0.0127389

ชาตรามือ (สีทอง) 2816.669 0.01341389

งูเหา่ 6927.459 0.14347624

มังกรบิน 3129.719 0.01989848

สุนัขตาํ รวจ 7936.723 0.11947185

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0
 Substance Intensity Concentration (µg/µl)

50% STD 9175.238 0.23588

75% STD 16739.836 0.35381

100% STD 21331.522 0.47175

125 % STD 26807.907 0.58969

150% STD 33993.635 0.70863

Substance Intensity Concentration (µg/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 0 0

ชาตรามือ (สีทอง) 0 0

งูเหา่ 2221.406 0.08834028

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 0 0

OK 0 0
 หัวสิงหส
์ ามดาว 0 0

Butanol : DI : Acetic Acid: (20:12:5)

Substance Dilution Concentration (µg/µl)

Sunset Yellow 50% 0.16375

75% 0.24563

100% 0.3275

125% 0.40938

150% 0.49125

Carmoisine 50% 0.21513

75% 0.32269

100% 0.43025

125% 0.40938

150% 0.49125
 Substance Intensity Concentration (µg/µl)

50% STD 10095.773 0.16375

75% STD 16078.329 0.24563

100% STD 22159.593 0.3275

125 % STD 25418.078 0.40938

150% STD 26991.128 0.49125

Substance Intensity Concentration (µg/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 0 0

ชาตรามือ (สีทอง) 0 0

งูเหา่ 0 0

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 0 0

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 6928.497 0.07654278
Sunset Yellow
Substance Intensity Concentration (µg/µl)

50% STD 16319.593 0.16375

75% STD 23185.957 0.24563

100% STD 30615.635 0.3275

125 % STD 35892.191 0.40938

150% STD 38302.777 0.49125

Substance Intensity Concentration (µg/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 36100.212 0.43205207

ชาตรามือ (สีทอง) 25784.362 0.28302001

งูเหา่ 32983.262 0.3870218

มังกรบิน 60195.538 0.78015484

สุนัขตาํ รวจ 56091.688 0.72086693

OK 57812.103 0.74572159

หัวสิงหส
์ ามดาว 34425.141 0.40785248
27/12/17

Brand of tea leave Mass (g)

ชาตรามือ (R) 7.2568

ชาตรามือ (G) 7.0886

งูเหา่ 7.0690

มังกร 7.0464

สุนัขตาํ รวจ 7.1871

OK 7.0038

หัวสิงหส
์ ามดาว 7.0178

● Add 40 ml of boiling water

○ Then boil for 15 min
Mobile phase 1 NH3:Iso-OH (1:4)
Mobile phase 2 ethyl acetate:methanol:DI:Acetic acid (65:23:11:1)
Mobile phase 3 butanol:DI:acetic acid (20:12:5)
Plate 1: ชาตรามือ (R),ชาตรามือ (G), งูเหา่ , มังกร, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%
Plate 2:สุนัขตาํ รวจ, OK, หัวสิงหส
์ ามดาว, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%
● The only usable mobile phase is the third one, 20:12:5 Butanol:DI:acetic acid
● The mobile phase was able to separate sunset yellow from carmoisine succesfully
Sunset Yellow
Substance Intensity Concentration (µg/µl)

50% STD 16319.593 0.16375

75% STD 23185.957 0.24563

100% STD 30615.635 0.3275

125 % STD 35892.191 0.40938

150% STD 38302.777 0.49125

Substance Intensity Concentration (µg/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 36100.212 0.43205207

ชาตรามือ (สีทอง) 25784.362 0.28302001

งูเหา่ 32983.262 0.3870218

มังกรบิน 60195.538 0.78015484

สุนัขตาํ รวจ 56091.688 0.72086693

OK 57812.103 0.74572159

หัวสิงหส
์ ามดาว 34425.141 0.40785248
 Substance Intensity Concentration (µg/µl)

50% STD 10095.773 0.16375

75% STD 16078.329 0.24563

100% STD 22159.593 0.3275

125 % STD 25418.078 0.40938

150% STD 26991.128 0.49125

Substance Intensity Concentration (µg/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 0 0

ชาตรามือ (สีทอง) 0 0

งูเหา่ 0 0

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 0 0

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 6928.497 0.07654278
9/03/18

Brand of tea leave Mass (g)

ชาตรามือ (R) 7.1261

ชาตรามือ (G) 7.2177

งูเหา่ 7.1754

มังกร 7.0816

สุนัขตาํ รวจ 7.1217

OK 7.0126

หัวสิงหส
์ ามดาว 7.2370

Mobile phase: 20:12:5, Butanol : DI : C H 3 COOH

Plate 1: ชาตรามือ (R),ชาตรามือ (G), งูเหา่ , มังกร, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%
Plate 2: OK, สุนัขตาํ รวจ, หัวสิงหส
์ ามดาว, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%
Substance Intensity Concentration (µg/µl)

50% STD 21362.827 0.16375

75% STD 31215.312 0.24563

100% STD 37703.182 0.3275

125 % STD 47078.073 0.40938

150% STD 52351.709 0.49125

 Substance Intensity Concentration (µg/µl)

ชาตรามือ (สีแดง) 0 0

ชาตรามือ (สีทอง) 0 0

งูเหา่ 0 0

มังกรบิน 0 0

สุนัขตาํ รวจ 0 0

OK 0 0

หัวสิงหส
์ ามดาว 5684.759 0.0060
 Intensity Brand/ Standards Concentration

57439.491 ชาตรามือ (สีแดง) 0.838714439

64570.988 ชาตรามือ (สีทอง) 0.943768605

61339.106 งูเหา่ 0.896159714

95931.26 มังกรบิน 1.40573714

17083.019 50% Standard Mix 0.16375

21431.454 75% Standard Mix 0.24563

26073.09 100% Standard Mix 0.3275

32391.818 125% Standard Mix 0.40938

39393.032 150% Standard Mix 0.49125

82223.704 OK 1.523155091

58247.6 สุนัขตาํ รวจ 1.017169991

45507.952 หัวสิงหส
์ ามดาว 0.748315965

15784.798 50% Standard Mix 0.16375

22385.827 75% Standard Mix 0.24563

28392.375 100% Standard Mix 0.3275

29797.233 125% Standard Mix 0.40938

31477.496 150% Standard Mix 0.49125