A RTÎCULOS CIENTÎFICOS

M ETODOLOGÎ AS U T I LI Z ADAS EN LA I N V EST I GACI ÔN DE

PLAN TAS AN T I T U M ORALES: DESCRI PCI ÔN Y COM EN TARI OS

RESU M EN

En el presente reporte se han descrito los resultados obtenidos en el estudio de algunas plantas medicinales con
actividad citotóxica conocida. Se ha reportado la actividad cit ot óxica de las especies: Annona muricata, Annona
cherimolia, Annona reticulata, Persea americana, Physalis peruviana, Physalis angulata, Clinopodium vulgare,
y Croton palanostigma. Estos hallazgos han sido comentados a fin de sugerir las mejores
estrategias para efectuar un trabajo de investigación futuro.

Palabras Clave: plantas medicinales, citotoxicidad, líneas celulares, cáncer, apoptosis

SU M MARY

This article reviews the results obtained during the study of some medicinal plants with known cytotoxic activity.
The cytotoxic activity of the species: Annona muricata, Annona cherimolia, Annona reticulata, Persea americana,
Physalis peruviana, Physalis angulata, Clinopodium vulgare, and Croton palanostigma, has
been reported. These findings were commented in order to suggest better strategies for future investigations.

Keywords: medicinal plants, cytotoxicity, cell lines, cancer, apoptosis

I N T RODU CCI ÔN

El cáncer es en la actualidad uno de los problemas de salud más preocupantes de la humanidad. Se ha avanzado con-
siderablemente en el conocimiento, tratamiento y la prevención de la enfermedad. Sin embargo, quedan aún muchas
lagunas terapéuticas por descubrir. Resulta interesante señalar que los productos naturales han jugado un rol significa-
tivo en el descubrimiento y desarrollo de nuevas drogas, especialmente para agentes contra el cáncer y enfermedades
infecciosas. Un análisis efectuado sobre las nuevas drogas aprobadas para el tratamiento del cáncer por la FDA de

las plantas medicinales se han convertido en importantes fuentes de agentes quimioterápicos como la vinblastina y el
paclitaxel obtenidos a partir de derivados de las especies Catharanthus roseus y Taxus brevifolia (1).

Los compuestos de origen natural presentan una gran diversidad de estructuras químicas, comparado con las
pequeñas moléculas sintéticas, y con frecuencia proveen de actividades biológicas altamente específicas (2). Tal es
el caso del alcaloide persina, extraído de las hojas de Persea americana, que en un estudio efectuado sobre células
de cáncer de mama humano, se observó que inducía en forma selectiva arresto del ciclo celular en la fase G2-M y

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apoptosis caspasa-dependiente en las células sensibles, siendo esta última propiedad dependiente de la expresión

Se ha efectuado un enorme número de estudios para determinar la citotoxicidad y actividad antitumoral de diversas

trabajos que reportan resultados positivos frente a células tumorales (4).

MÉTODOS YTÉCNICAS UTILIZADAS

La tarea de búsqueda de plantas antitumorales y sus principios activos se inicia, frecuentemente, con la disminución
del universo de probables plantas citotóxicas, aprovechando los aportes de la medicina folklórica y tradicional, y de
conocimientos etnobotánicos que suelen ser acert ados y alentadores.

Las plant as así seleccionadas se extraen con solventes orgánicos y agua. Particularment e se usan los extractos alco-
hólicos o hidroalcohólicos por su sencillez y fácil manejo, y con el fin de cubrir un amplio espectro polar y apolar se

se requieren otros solventes. El extracto obtenido, para su utilización posterior, se resuspende o disuelve en dimet il

ellos toma en cuenta las variables y modelo siguientes:

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A= Control negativo: solvente+ prueba (de inhibición de crecimiento).

B= Muestra, extracto de planta redisuelto + prueba (de inhibición de crecimiento) B1-B2-B3: concentraciones crecientes del
extracto de planta redisuelto + pruebas.
C= Control positivo: producto antitumoral reconocido + prueba.
Prueba= todos los procesos previstos para la experiencia.

Es un esquema básico del diseño experimental para est e tipo de investigación, al cual se puede agregar pruebas
específicas.

REDUCCIÓNDEL UNIVERSO DE PLANTASANTITUMORALES

Se logra realizando diversas pruebas que ant icipan si el extracto es efectivamente inhibidor o no del crecimient o
celular. Entre ellas:

a) Inhibición del desarrollo de huevos fecundados de erizo de mar.

b) Inhibición del crecimiento de fibroblastos de ratón.

Los resultados positivos de inhibición son insuficientes para admitir su carácter antitumoral pero autorizan, ya con
un número de muestras reducido, para el paso siguiente: trabajar con células tumorales.

ASPECTOS ESPECIALESA CONSIDERAR

Mecanismos de acción.- Determinar el mecanismo de acción es un procedimiento que confiere seguridad y con-
fianza a una relación causa-efecto. Es un tema muy importante que ha concitado la atención de expertos científicos
y eminentes filósofos, quienes se plantean si una relación simple causa-efecto, acompañada o no de análisis estadís-
ticos, puede garantizar una relación causal y otorgar calidad científica a un determinado fenómeno o proceso, la
acupunt ura por ejemplo; o si se debe, necesariamente, establecer su mecanismo de acción. En diversos trabajos de
investigación de plantas citotóxicas se está realizando la verificación de hipótesis acerca de los posibles mecanismos
de acción, planteados para cada caso.

Es conocido el efecto traumático (por efectos secundarios) de los quimioterápicos, motivo por el
que se estudia la especificidad de los extractos obtenidos, es decir, si son efectivos sólo para las células tumorales, o
si t ambién son tóxicos para la célula normal. Con este fin se ejecutan las mismas pruebas de verificación con células
normales y con células tumorales, comparando el crecimiento en ambos casos.

En épocas anteriores las Farmacopeas y particularmente el Codex Francés regulaban las prepara-
ciones farmacéuticas, los extractos fluidos, extractos secos, cocimientos, infusiones, tinturas, etc... Las tinturas se pre-

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Son muy importantes estos tipos de estudios acerca de la de Concentración Inhibitoria porque permiten definir las
dosis recomendables de extractos o principios activos y conducen a su mejor aplicación en las diversas formas far-
macéut icas a prescribir.

productos galénicos obtenidos mediante procesos sencillos en los que se aumenta la cant idad total a ingerir, y se
consigue elevando su concentración al prepararlos como t inturas, extractos, tablet as u otras formas medicamen-
tosas. Nos preguntamos si la cantidad ingerida actualmente se corresponde con la requerida para lograr efecto
-
siones se venden en el mercado informal.

Tal vez est e hecho justifica la denominación de aliment o; producto nutraceútico o suplemento alimentario, como
califica estos productos para su registro la FDA de los Est ados Unidos.

Debe tenerse en cuenta que al concentrar principios activos de corteza, de hojas, flores o semillas también pueden
concentrarse otras sustancias que exhiban efectos secundarios indeseables. Aparentement e, los procesos empleados
a la fecha en muchos casos no incrementan significativamente estas propiedades negat ivas en razón de los bajos
niveles de ingestión total de estas sustancias; pero esto podría no ocurrir, lo que deberá evitarse, para cuyo efecto
han de realizarse estudios serios al respecto.

LA MOLÉCULA FARMACOQUÍMICA

Como quiera que el problema de encontrar la molécula química responsable de la acción farmacológica fue parte
del desarrollo histórico de la farmacia, durante su tarea de encontrar nuevos medicamentos lo fue también su
solución que precisó la necesidad e importancia del reconocimiento de esta única molécula química terapéutica, la
det erminación de su estructura y de las dosis requeridas para superar situaciones adversas de salud o para alcanzar
-
tigación de este tipo, que finalmente condujo al monofármaco. Con ello se consiguió eliminar otras moléculas inde-
seadas pero no todos los efectos adversos, ya que se mantienen aún los efect os secundarios propios de la molécula
terapéuticamente activa. Para aislar y caracterizar esta molécula y su estructura a partir de un extracto, se efectúa el
fraccionamiento sucesivo siempre referido a su actividad inhibitoria de crecimiento, operación que permite reducir
progresivamente el número de subfracciones obtenidas hasta llegar a la molécula química responsable. Con este fin
se emplean diversos tipos de cromatografía y otras técnicas que se mencionan en posterior párrafo de esta nota, en

POTENCIACIÓN DE EFECTOS

Sin embargo, algunos especialistas en Etnomedicina y Fitofarmacia consideran conveniente mantener formas farma-
céuticas con múltiples compuestos químicos, según la hipót esis de que su asociación potencia los efectos de muchas
de ellas. Wagner et al. publicaron su trabajo sobre Uncaria tomentosa (uña de gato) en el que ensayaron unir 2
Uncaria
verificada. Esto porque según los resultados de sus trabajos, sumados los efectos individuales de los alcaloides ais-
lados, no hacían el efecto total del extracto obtenido. Inesperadamente, hallaron mejores resultados al asociar estos
alcaloides con taninos.

Por ot ra parte, puede suponerse que algunos de los metabolitos, especialmente los secundarios, pueden contribuir
con un eslabón (un elemento o grupo orgánico) de la cadena química que representa al mecanismo de acción y así
concretarlo; o a la inversa, puede impedir la cont inuidad de esta cadena por sustitución o transformación química.

terapéuticos esperados e impedir efectos secundarios indeseables o interacciones medicamentosas de consecuencias

negativas.

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ANÁLISIS DE EXPERIENCIAS PUBLICADAS

Dada la gran cantidad de trabajos y ensayos efectuados, hemos t omado una muestra de los mismos a fin de encon-
trar patrones comunes de metodología que puedan servir de guía para aquellos investigadores que deseen efectuar
investigaciones futuras para elucidar la actividad antitumoral de especies vegetales.

Annona muricata

También conocida en nuestro medio como guanábana, los primeros estudios químicos se llevaron a cabo en las

planta. Se ha reportado que Annona muricata

encontradas en frutos, corteza y hojas. Quispe, A. et al. demostraron que el alcaloide acetogenina muricin H pre-

Por ot ra part e, Arroyo, J. et al. desarrollaron su investigación sobre la mezcla del extract o et anólico de hojas de
Annona muricata y el extracto acuoso de la raíz de Krameria lappacea, a fin de determinar el efecto citotóxico de

(sistema nervioso). Se observó efecto citotóxico de los dos extractos combinados, mientras que los ext ractos por
sí solos no demostraron citotoxicidad. Los autores atribuyeron el efecto citotóxico a las saponinas triterpenoides

presentan efectos anticancerígenos (11), (12). Esta conclusión resulta interesante pues amplía el espectro de estudio
hacia otros metabolitos secundarios que están presentes en el extracto de Annona muricata.

Annona cherimolia

Annona cherimolia es otra especie perteneciente al género Annona y familia Annonaceae, de la que se han aislado
una serie de compuestos con propiedades citotóxicas. Kim, D. et al. demostraron el poder citotóxico de los alcaloides
acetogeninas annomolin y annocherimolin aislados de las semillas de Annona cherimolia, sobre las líneas celulares
-

Annona reticulata

Conocida por anona roja, esta especie es oriunda de América Central y de sus semillas se ha aislado el alcaloide
et al. confirmaron la citotoxicidad del compuest o frente a todas las líneas celulares
utilizadas. Se observó que en la línea celular T24 de cáncer de vejiga se produjo una interrupción y detención en la
fase G1 del ciclo celular. Se indujo la expresión de los genes pro apoptóticos Bax y Bad (14).

Persea americana

La Persea americana (palto) es una planta perteneciente a la familia de las Annonaceae. Se han efect uado diversos

et al. evaluaron la actividad

cit ot óxica del alcaloide persin extraído de las hojas de Persea americana, mediante la exposición de las líneas hu-

tasa de apoptosis por citometría de flujo. La persina indujo el arresto celular en la fase mit ótica G2-M y apoptosis

Physalis peruviana

La Physalis peruviana (aguaymanto) es una especie peruana usada t radicionalmente en el tratamiento del cáncer,
et al. se de-

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mostró un mayor efecto citotóxico del extracto et anólico de hojas y tallos de Physalis peruviana frent e a las líneas

alentador ya que sugiere la presencia de metabolitos secundarios con una muy buena actividad citotóxica, y que
ameritan una investigación mas detallada.

Physalis angulata

-
trado compuestos denominados phisalinas que presentan fuerte act ividad citotóxica in vitro, y confirmada in vivo

(19). En otro estudio realizado por Damu, A. et al

pertenecientes al grupo de phisalinas y whitanolidos, los que mostraron una clara actividad citotóxica al enfrentarse

Clinopodium vulgare

El Clinopodium vulgare (clinopodio) es una planta usada tradicionalmente en Bulgaria como cicatrizante y en el
tratamiento de verrugas ocasionadas por virus. Dzhambazov, B. et al., en base a un trabajo previo, efect uaron un

Aunque no llegaron a determinar con exactitud la naturaleza química de los compuestos con actividad citotóxica,
se encontró fuerte actividad antitumoral sobre estas líneas celulares. Se identificó dos grupos de compuestos, el
primero, una combinación de glicósidos, tuvo efecto sobre la adhesión celular; el segundo grupo causo vacuolización
celular masiva (21).

-
sor de la tos. A fin de determinar su actividad antitumoral, Blatt, C. et al. evaluaron la citotoxicidad del extracto
metabólico de la corteza del tronco versus un panel de líneas celulares cancerosas humanas: BC1 (cáncer de mama
humano), Lu1 (cáncer de pulmón humano), Col2 (cáncer de colon humano), KB (carcinoma epidermoide humano),
KB-V (+VLB) (KB multidrogo resistente evaluado en presencia de vinblastina), KB-V (-VLB) (KB multidrogo resistente
-
-
toma humano), y como complemento determinaron la actividad antimitótica mediante células ASK cultivadas. Del
-
dad frente al panel de células cancerosas utilizadas (22).

Croton palanostigma

El Croton palanostigma (sangre de grado) es una planta medicinal cuya resina roja obtenida de la cort eza es usada
en el t ratamiento de úlceras gastrointestinales, cicat rización de heridas y el cáncer. Para evaluar esta última propie-
dad, Sandoval, M. et al. evaluaron el potencial efecto anticanceroso de la sangre de grado sobre las líneas celulares

DI SCU SI ÔN

Hemos señalado los resultados obtenidos en algunos trabajos de investigación que mostraron resultados de acción
cit ot óxica de plantas medicinales frente a diferentes líneas celulares de cáncer. En casi t odos los casos, se utilizaron
líneas celulares humanas de los tipos de cáncer más comunes (pulmón, colon, mama, entre otros) y que presentan
una mayor prevalencia en la población. Sin embargo, hay que tener en cuenta el hecho de que los diversos t ipos de
cáncer solo responden a fármacos específicos, y en consecuencia, se hace necesario diseñar modelos experimentales
con el mayor número posible de líneas celulares, a fin de determinar su especificidad.

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un procedimiento común en las metodologías seguidas. Es necesario efect uar pruebas control de este tipo a fin de
det erminar si los extractos o principios activos puros pueden inducir citotoxicidad en células sanas.

Las pruebas control deben referirse no solo al tipo de células, sino también al uso de una sustancia control con ac-
tividad antineoplásica conocida, y a los solventes utilizados.

Básicamente, de acuerdo a los resúmenes expuestos, podemos dividir a los trabajos de investigación en dos gru-
pos: a) aquellos que solo determinaron citotoxicidad y b) aquellos que determinaron citotoxicidad y elucidaron el
mecanismo de acción de la sustancia. La elucidación del mecanismo de acción es una tarea compleja que solo de-
bería efectuarse en el caso de sustancias puras, ya que con el conocimiento a fondo de dicho mecanismo se puede
avanzar en el estudio de la molécula y llegar a la fase de estudios clínicos y finalmente convertirla en una droga de
uso aprobado.

Con respecto a las familias y géneros considerados, hay clara evidencia de que las especies vegetales pertenecientes
al mismo género (caso de Physalis peruviana y Physalis angulata y Annona cherimolia, Annona muricata y Annona
reticulata) o pertenecientes a la misma familia (caso de Persea americana y el género Annona, ambos pertene-
cientes a la familia de las Annonaceae), es decir, emparentadas, tienen un met abolismo muy semejante, que da
origen al mismo grupo de metabolitos secundarios, lo que permitiría dirigir la búsqueda de plantas con actividad
antitumoral en base a la especie y familia.

PERSPECT I VAS

-
mente. El uso de modernas técnicas de identificación t al como la Resonancia Magnética Nuclear, Espectrometría de
Masas, Espect roscopia Infrarroja, etc; y técnicas analíticas como la cromatografía (en todas sus variantes), electro-
foresis, técnicas de aplicación de isótopos y enzimología, han result ado en la correcta elucidación de las fórmulas
estructurales exactas y las más importantes vías metabólicas.

Adicionalmente, la genética ha cobrado un mayor impulso gracias al desarrollo del proyecto genoma humano y
se están aplicando estas técnicas para caracterizar el genoma completo de plantas usadas por el hombre. Recien-
temente, el Consorcio público italo-francés para la caracterización del genoma de la vid, ha logrado elucidar por
completo la secuencia de esta planta, dando un gran avance en el entendimiento de la síntesis de metabolitos y

enfoque experimental basado en genómica funcional, para facilitar el descubrimiento de genes que participan
en el met abolismo secundario de las plantas. Este método en el futuro podría llevar a la creación de novedosas

obviamente se puede dirigir a la síntesis de sust ancias con poder antitumoral y citotóxico.

REFEREN CI AS BI BLI OGRË FI CAS

4. Graham , J. Comunicación personal

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