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de proteínas y ácidos nucleicos [1-6]. La separación mediante este método utiliza una
corriente eléctrica para impulsar biomoléculas cargadas a través de una matriz de gel
poroso a una velocidad que es una función de la carga, el tamaño y la forma de las
moléculas. Las proteínas se analizan frecuentemente usando geles orientados
verticalmente hechos de poliacrilamida, mientras que el ADN y el ARN se analizan más
comúnmente usando geles de placas de agarosa horizontales. La agarosa existe como un
copolímero que contiene B-D-galactosa 1,3-ligada y 3,6-anhidro-α-L-galactosa 1,4-unida.
Un pequeño número de sulfato y otros grupos aniónicos también están presentes [3, 4, 7].
La ebullición del carbohidrato en agua y el enfriamiento conduce a la formación de haces
helicoidales de hebras de agarosa unidas por enlaces de hidrógeno. Los paquetes se
asocian entre sí para crear poros que permiten el tamizado molecular de biomoléculas.
Los geles de placas de agarosa horizontal estándar permiten la separación de ADN que
varían en tamaño de 75 a 30,000 pb [3,4,8,9].
Los ADN grandes en la parte superior de este rango se estudian usando geles de agarosa
de bajo porcentaje (0,3-0,5%), mientras que los ADN pequeños generalmente se analizan
usando porcentajes más altos (2-4%) [8-10]. La resolución más alta de ADN
monocatenarios y bicatenarios de menos de 75 nucleótidos de longitud se logra usando
geles de poliacrilamida. Esto se debe a que el fuerte marco de gel covalentemente unido
a la poliacrilamida puede producir poros de gel más pequeños y más estables, lo que
permite un tamizado molecular más fino [2,3,6].
La electroforesis de ADN en geles de placas se realiza principalmente utilizando uno de
los dos tampones estándar, ya sea TAE, 1 compuesto por Tris (2-amino-2- [hidroximetil] -
1,3-propanodiol), ácido acético y EDTA (ácido etilendiaminotetraacético) o TBE (Tris,
ácido bórico y EDTA). Estas soluciones contienen un ácido débil, ácido acético o bórico,
que puede existir en formas neutras y aniónicas (por ejemplo, COOH y COO) y una base
débil, Tris, que existe en formas neutras o catiónicas (TrisNH2 y Tris-NH3 + ) Estos iones
llevan la corriente eléctrica, almacenan el pH y mantienen un medio de baja
conductividad. EDTA no es absolutamente esencial [4], pero se agrega como preventivo
porque quelata los iones de Mg2 + y, por lo tanto, inactiva las potenciales nucleasas de
ADN que pueden estar presentes.
Para la separación de moléculas de ADN que varían en tamaño desde varios cientos
hasta varios miles de pb, tanto TAE como TBE proporcionan una buena resolución de
fragmentos de ADN, con una separación ligeramente mejorada de fragmentos más
pequeños en TBE y de tamaños mayores en TAE.
A pesar de su rendimiento similar en la mayoría de las aplicaciones, se han observado
algunos efectos específicos del tampón, especialmente en tampones que contienen
borato [11-15].
En los últimos años, también se han desarrollado otros medios conductivos para la
electroforesis de ácidos nucleicos. Los ejemplos incluyen soluciones que contienen L-
histidina, borato de sodio, treonina sódica, borato de litio y mezclas de ácidos y bases
orgánicas compatibles con pKa [16-21].
La electroforesis de ADN generalmente se realiza a voltaje constante. Durante un
experimento, la corriente (medida en mA) aumenta y se produce el calentamiento del
buffer de ejecución. El voltaje se mantiene bajo, 10 V / cm, donde cm se refiere a la
longitud del gel, para minimizar los efectos de calentamiento. Para una plataforma de gel
horizontal típica de tamaño pequeño o mediano (10-15 cm de longitud), los suministros de
energía se establecen entre 100 y 150 V y los geles se ejecutan durante 50-90 min.
Aumentar el voltaje por encima de este rango utilizando tampones TAE o TBE 1X
estándar aumenta la velocidad de movimiento de los ADN, pero conduce a un
calentamiento asimétrico del gel y la solución. Tal calentamiento es indeseable porque
promueve el ensanchamiento, la inclinación y la compresión de las bandas entre sí, así
como un movimiento más rápido de las muestras en el centro que en el exterior del gel (''
sonriente '') y otras anomalías de carril [3 , 4,6,22].
Aunque TAE y TBE se emplean casi universalmente en laboratorios de bioquímica, sus
composiciones nunca se han optimizado rigurosamente y, por lo tanto, todavía se usan
concentraciones esencialmente arbitrarias en la actualidad (89 mM Tris, 89 mM de ácido
bórico y 2 mM EDTA en 1X TBE y 40 mM Tris, 20 mM de ácido acético y 1 mM de EDTA
en 1X TAE) [4, 8, 9].
En el estudio actual, hemos examinado sistemáticamente los impactos de las
concentraciones de ácido, base y EDTA en la corriente eléctrica y en la resolución de
ADN lineales y circulares dentro de geles de placas de agarosa. Además, se investigó el
impacto de la alteración de la estructura del gel, el porcentaje de agarosa y el volumen del
tampón de electroforesis en la corriente eléctrica. Usando condiciones optimizadas de
electroforesis que surgen de estos experimentos, demostramos que se pueden lograr
voltajes mucho más altos con los tampones tradicionales, lo que resulta en tiempos de
ejecución más cortos y una resolución mejorada de pequeñas moléculas de ADN y ARN.
Materiales y métodos
Materiales
La base Tris se adquirió de J. T. Baker y el ácido acético glacial de Mallinckrodt
Chemicals. Se obtuvieron ácido libre de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sal de
EDTA disódica y agarosa Omnipur de EMD Chemicals, Inc. El ácido bórico se adquirió de
Sigma-Aldrich y el bromuro de etidio (EtBr) de Shelton Scientific, Inc. El registro de 2-log
Escalera de ADN, escala de ADN de 1 kb, escala de dsARN y estándares de escalera de
ARNip se compraron de New England Biolabs.
Para los experimentos que implican la medición de las temperaturas del tampón de gel, se
colocaron dos termómetros en el tampón de electroforesis, uno en cada extremo del
equipo, y se promediaron los resultados. El pH se determinó usando un medidor de pH
Corning 220 después de eliminar 2 ml de tampón de electroforesis desde arriba del ánodo
y el cátodo antes e inmediatamente después de completar la electroforesis.
Resultados
La forma disódica es más soluble que el ácido libre y se usa comúnmente en mezclas
concentradas de TAE y TBE que se venden comercialmente o se preparan en laboratorios
de investigación. Los impactos de las diferentes formas de EDTA sobre la corriente
eléctrica se investigaron en la Fig. 2. El tampón TBE estándar 1X (89 mM Tris, 89 mM de
ácido bórico, 2 mM EDTA), preparado usando ácido libre o EDTA disódico, produjo
corrientes más altas que Tampón de TB 1X que no contiene EDTA en cada voltaje entre
50 y 250 V (Fig. 2A). La forma disódica produjo corrientes más altas que el ácido libre,
presumiblemente debido a la conductividad aportada por los iones Na +.
Algunos protocolos que describen la preparación de TBE recomiendan agregar EDTA a
partir de una solución madre de EDTA disódica 50 mM o 0.5 M que previamente se ajustó
a pH 8,0 para permitir que el producto químico se disuelva [8,9,24]. Debido a que el
hidróxido de sodio se usa para establecer el pH, las soluciones preparadas de esta
manera tienen niveles más altos de iones de Na + y una conductividad eléctrica más alta
(figura 2A, enumerada como Na2EDTA, pH 8). Variando la concentración de la forma más
comúnmente utilizada, EDTA disódico (usando el polvo, no una solución madre ajustada a
pH 8,0, para preparar el tampón), reveló que la concentración debe reducirse a
aproximadamente 0,25 mM para reducir las corrientes al mismo nivel como una solución
sin EDTA (Fig. 2B).
1X TBE, que contiene 89 mM de Tris y 89 mM de ácido bórico, es la forma más común de
este tampón utilizado, pero algunos laboratorios preparan y procesan geles utilizando
0,5X TBE [9,25,26]. La disminución de la concentración de los principales electrolitos en el
tampón TB (Tris-NH3 + y B [OH] 4) utilizando 0.5X TB redujo sustancialmente la corriente
eléctrica (figura 2C). La corriente observada a 150 V en 1X TB se redujo en un 36% en
0.5X TB y en un 61% con 0.3X de buffer TB.
Las corrientes producidas usando 1X TAE como tampón de electroforesis también se
vieron influenciadas por la presencia y la forma de EDTA utilizada, pero los efectos no
fueron tan fuertes como los observados con TBE. 1X TAE preparado usando EDTA
disódico y corrientes generadas con ácido EDTA libre que no fueron estadísticamente
separables entre sí (superposición de las desviaciones estándar) (Fig. 2D). Además, las
corrientes en los tampones TAE que contienen EDTA eran solo modestamente más altas
que las observadas en el tampón TA sin EDTA. El impacto más moderado de eliminar
EDTA del tampón Tris-acetato es consistente con el hecho de que la concentración de
EDTA en 1X TAE es solo 1 mM mientras que es 2 mM en 1X TBE. Sin embargo, los
resultados obtenidos con 1X TA y 1X TB (cada uno sin EDTA) también fueron bastante
diferentes, siendo las corrientes con TA aproximadamente el doble de las observadas con
TB (Fig. 2D). 1X TA contiene Tris 40 mM y ácido acético 20 mM. La reducción de las
principales especies cargadas dentro de este tampón (TrisNH3 + y CH3COO) usando
0.5X TA redujo la corriente modestamente, hasta aproximadamente el nivel visto con 1X
TB (figura 2E). Estos experimentos demuestran que las concentraciones tanto de EDTA
como de los principales componentes ácido-base pueden modificarse para reducir la
corriente producida usando tampones TBE y TAE. Es práctica habitual en muchos
laboratorios de biología molecular añadir bromuro de etidio, un fluoróforo que se une al
ADN, al gel y a los medios conductores que cubren el gel, de modo que no es necesario
un paso de tinción del ADN posterior a la electroforesis [9]. Aunque la adición de esta
sustancia química introduce especies cargadas en el sistema, las corrientes eléctricas no
aumentaron cuando se incorporaron en geles procesados en 1X TBE en la concentración
estándar (0.5 lg / ml) o en concentraciones de hasta 2.0 lg / ml (Fig. 2F). ) Los
experimentos anteriores indicaron que 1X TB tiene una conductividad más baja que 1X
TA y que las corrientes son incluso más bajas en los tampones 0.5X y 0.3X TB.
El buffer 1X TBE estándar produce bandas nítidas y una buena resolución en geles que
funcionan a bajos voltajes típicos de 10 V / cm. Sin embargo, tales geles generalmente
requieren tiempos de ejecución de 50-90 minutos para lograr una separación óptima de
los fragmentos de ADN. Realizamos pruebas para determinar si se podía mantener una
buena resolución cuando la electroforesis se realizaba a voltajes más altos, produciendo
tiempos de ejecución más cortos, si se realizaban modificaciones apropiadas para
disminuir la corriente y, por lo tanto, reducir el calentamiento y los posibles artefactos de
bandas de ADN. Se preparó una serie de geles de agarosa al 1% de 10 cm de longitud
utilizando 1X TB, 0.5X TB y 0.3X TB. EDTA se dejó fuera de los buffers porque aumenta
la corriente y, por lo tanto, limita el voltaje que se puede aplicar. La electroforesis también
se realizó usando una baja altura de amortiguación (2 mm) y un bajo volumen de gel (40
ml) para minimizar la corriente. La electroforesis de los fragmentos de ADN lineales en
dos escaleras estándar de ADN usando 1X tampón TBE a 150 V (15 V por cm) reveló una
buena separación de las bandas (Fig. 3A, panel superior izquierdo). Los carriles 2 y 6 del
gel contienen una colección de fragmentos de entre 500 y 10.000 pb de tamaño y los ADN
en los carriles 4 y 8 varían de 100 a 10.000 pb. Los geles se corrieron hasta que el
colorante azul de rastreo de bromofenol migró 7 cm hacia abajo del gel de 10 cm. Las
mismas escaleras se corrieron posteriormente en tampón TB 1X a 150, 200, 250 y 300 V
(figura 3A). La resolución permaneció alta hasta 250 V, pero hubo una notable
compresión de bandas a altos voltajes, por lo que se redujo la distancia que separa las
bandas más alta y más baja del gel. Este fenómeno está indicado por el soporte grande y
la letra '' C '' en el lado derecho de la Fig. 3A. Además de la compactación general que
acercaba a todas las bandas entre sí, también se producía una compresión localizada de
algunas bandas entre sí, vista principalmente a 300 V (mostrada por los pequeños
corchetes y la letra minúscula '' C ''). El uso de 0,5X TB también produjo una buena
separación de bandas a tensiones de hasta 250 V, aunque la resolución se vio
comprometida a 300 V (figura 3B). Los geles preparados y procesados en 0.3X TB
exhibieron baja resolución y compresión de bandas entre sí en todos los voltajes, con una
compresión más fuerte y una intensidad de banda no uniforme aparente a 250 y 300 V
(figura 3C).
Por lo tanto, se logró una buena resolución usando 0.5X TB y 1X TB a tensiones de hasta
250 V (25 V por cm), aunque todas las bandas estaban más cerca entre sí a los voltajes
más altos.
Las corrientes eléctricas producidas durante la electroforesis de los geles mostrados en la
Fig. 3A y B, más los geles de control 1X TBE, se midieron al comienzo y al final de las
ejecuciones realizadas usando varios voltajes diferentes. Las corrientes de inicio y
finalización para geles ejecutados usando 1X TBE que contiene EDTA disódico fueron
mucho más altas que las observadas cuando se usaron 1X TB y 0,5X TB (Fig. 4A).
Además, las corrientes aumentaron en porcentajes más grandes (casi el doble) durante el
transcurso de cada ejecución cuando se utilizó 1X TBE. Cuando los geles se ejecutan a
voltaje constante y la corriente aumenta con el tiempo, la temperatura del tampón de la
cámara también tiende a aumentar. Se prepararon geles de diez centímetros y se
corrieron en 1X TBE, 1X TB y 0,5X TB a 150 y 200 V como antes, deteniendo cada gel
después de que el colorante de seguimiento con azul de bromofenol había migrado 7 cm.
Las temperaturas promedio del yacimiento amortiguador se evaluaron colocando
termómetros en las cámaras al comienzo e inmediatamente después del final de cada
ejecución. A 150 V, la temperatura aumentó solo 1 C durante la prueba en 0.5X TB, pero
subió 10 C en 1X TB y 16 C en 1X TBE (Fig. 4B). Incluso temperaturas más altas se
observaron a 200 V. Estos resultados confirman el postulado de que la reducción de las
concentraciones de EDTA y tampón puede tener fuertes impactos tanto en la
conductividad como en la temperatura producida durante un experimento de
electroforesis. La realización de electroforesis a mayores voltajes utilizando medios de TB
modificados produjo otra ventaja: grandes reducciones en los tiempos de ejecución del
gel. Por ejemplo, los geles 0,5X TB se ejecutan a 100 V (10 V / cm) requirieron 70 minutos
para que el colorante azul de bromofenol viajara 7 cm hacia abajo del gel (Fig. 4C). Por el
contrario, los geles ejecutados a 200 y 250 V se completaron en solo 32 y 20 minutos,
respectivamente, una reducción de tiempo de hasta 3 veces. La agarosa no se usa
comúnmente para la separación de ácidos nucleicos de aproximadamente 75 nucleótidos
de longitud o menos [8,9,24]. Los ácidos nucleicos de este tamaño se separan mejor y
producen bandas más finas en geles de poliacrilamida.
Parte del problema con el uso de agarosa es que el andamiaje débil, unido a hidrógeno
que forma los poros del gel permite una mayor difusión de moléculas pequeñas en todas
las direcciones, dando como resultado bandas anchas de aspecto difuso. Como la
difusión es un proceso dependiente del tiempo, razonamos que el uso de condiciones de
electroforesis y amortiguadores que permiten voltajes más altos y tiempos de ejecución
mucho más cortos debería mejorar la resolución de las moléculas pequeñas. Los geles
preparados con TBE producen una mejor separación de fragmentos más pequeños que
los geles TAE (figura 5A) y también generan menos corriente. Por lo tanto, los medios de
Tris-borato se usaron para probar la hipótesis.
Se prepararon geles de agarosa (4,0%) que tenían 14 cm de longitud en 0,5X TB y se
comparó la resolución de escalas de ADN de bajo peso molecular a 140 V (10 V / cm) y
350 V (25 V / cm, equivalente a 250 V en un gel de 10 cm). Las bandas eran
sorprendentemente menos difusas a mayor voltaje, con bandas delgadas y buena
separación de fragmentos de tan solo 20 bp (figura 5B). Se realizó un experimento similar
usando dos diferentes escaleras de ARN de doble cadena que contenían fragmentos que
variaban en tamaño de 17 a 500 pb. La nitidez de la banda se mejoró enormemente a 350
V, especialmente para la escalera de ARNip que contiene fragmentos de 17, 21 y 25 pb
(figura 5C). Los experimentos descritos anteriormente establecieron que 0.5X TB, sin
EDTA, puede usarse a voltajes más altos con buena resolución de grandes ADN lineales
y con resolución fuertemente mejorada de pequeños fragmentos lineales. Dado que los
biólogos moleculares analizan rutinariamente ADN plasmídicos circulares y sus derivados
circulares y abiertos circulares mellados en geles, también se investigó la migración de
estas moléculas en los tampones modificados. Dos formas de la levadura-E. vector de
lanzadera de coli p426TEF (6352 bp) [23] se analizaron, representando tanto
conformaciones superenrolladas (sin cortar) como lineales (corte enzimático de
restricción).
La electroforesis en un gel al 1% en 1X TBE convencional que contiene EDTA disódico
produjo patrones de migración que se observan típicamente en los tampones TAE y TBE,
con ADN superenrollado (SC) que migra más rápido que el ADN lineal (LIN) (Fig. 6A,
panel izquierdo) [1,2 , 27]. La banda débil en el carril SC que comigra con el estándar de
ADN lineal de 10 kb corresponde al ADN circular abierto mellado (NOC), que migró a una
posición por encima de las formas lineal y SC como se esperaba.
Sorprendentemente, el uso de tampón de TB 1X sin EDTA redujo fuertemente la
movilidad relativa del ADN SC, haciendo que corriera más lento (más alto) que la forma
lineal. Cuando la fuerza iónica se redujo más a 0.5X TB y 0.25X TB, la migración de la
forma SC fue incluso más lenta (Fig. 6A). Un 1X TBE y un 0.5X TBE preparado usando
ácido libre EDTA restauraron el patrón al observado con los tampones preparados usando
EDTA disódico, con SC DNA migrando más rápido que el DNA lineal (Fig. 6B). Las tasas
de migración de plásmidos en tampones Tris-acetato (TAE y TA) también se probaron. A
diferencia de los tampones TBE, la eliminación de EDTA de 1X TAE no modificó las
movilidades relativas de las formas SC y LIN (Fig. 6C). Durante la realización de los
experimentos mostrados en la Fig. 6A y B, observamos que varias bandas inferiores en la
escalera de ADN de 2 log parecían altamente difusas cuando se preparaba TBE con
EDTA de ácido libre. Para explorar esto adicionalmente, se corrieron varios geles de
agarosa al 1% adicionales a 10 V / cm (Fig. 7). Los geles que contienen 1X TB o 1X TBE
convencional (EDTA disódico 2 mM) producen bandas de escalera típicas y delgadas. Sin
embargo, en geles se corrieron con 1X TBE que contenía EDTA ácido libre a la
concentración estándar (2 mM), todas las bandas por debajo de 1 kb eran amplias y
difusas (Fig. 7A, ver flecha doble). De manera similar, los geles 0,5X TB y 0,5X TBE que
contienen EDTA disódico (1 mM o 2 mM) dieron bandas agudas (Fig. 7B, paneles
izquierdos), pero los geles 0,5X TBE que contenían 1 o 2 mM de EDTA ácido libre
exhibieron la difusión que fue mayor a la concentración más alta de EDTA (Fig. 7B,
flechas dobles). Curiosamente, el número de bandas afectadas fue aún más fuerte
cuando se usaron geles TBE de 0.25X (Fig. 7C). Para completar, también se probó la
calidad de la banda en geles de Trisacetate (Fig. 7D). En contraste con los resultados con
TBE, las bandas en geles TAE 1X que contienen 1, 2 o 4 mM de EDTA de ácido libre no
difirieron sustancialmente de las observadas en los geles TAE 1X estándar preparados
con EDTA disódico 1 mM. En un intento por comprender este efecto del ácido libre, se
corrieron geles de 10 cm que contenían 0,5X TBE preparados con EDTA disódico o ácido
libre como antes, excepto que se eliminaron alícuotas de los electrodos positivo y
negativo antes e inmediatamente después de cada corrida para mediciones de pH Los
valores de pH iniciales y finales medidos en el cátodo fueron similares para ambos tipos
de TBE; sin embargo, el pH del depósito que contiene el ánodo se redujo en 0.5-0.6
unidades de pH al final de la prueba cuando se usó el ácido libre. Este resultado implica
una interrupción en la capacidad de amortiguación y, debido a que el ánodo está más
cerca del fondo de cada gel, también es consistente con las imágenes de gel en la Fig. 7
que muestran que los efectos más fuertes se observaron en las bandas en el fondo de
cada gel.
Discusión