CENTRIFUGACIÓN DE ÓVULOS DE DOS CÉLULAS DE RATÓN:

ESTRATIFICACIÓN DE CITOPLASMA Y RECUPERACIÓN

Proyecto realizado por: Verónica Téllez, Ariel Ahumada, Juan Muro*, Soledad Sepúlveda y
Luis Izquierdo.

1. INTRODUCCION:
El óvulo de dos células en ratón, observado por inmunofluorescencia, mostró una
regionalización de miosina (Sobel 1983a, b), fodrina (Schatten et al, 1986) y espectrina
(Sobel y Alliegro 1985, pero vea Damjanov et al, 1986) y del estado de 4 células en
adelante una fosfatasa alcalina regionalizada y actividad de la 5’ nucleotidasa puede ser
demostrada en la membrana celular (Izquierdo et al. 1980; Izquierdo y Ebensperger,
1982). No han sido reconocidas distintas regiones antes, ni en el oocito o en el óvulo
fertilizado, el cual podría ayudar a establecer un lineaje celular que conecte blastómeros
tempranos con las células diferenciadas de los blastocistos. Además, embriones
experimentalmente desordenados son capaces de regular y desarrollar a blastocistos
normales (). Estas observaciones, aun así, descartan la existencia de una estructura
espacial consistente que pueda determinar desarrollo, a pesar de eso tal determinación
puede ser rechazada por la regulación embriónica. Aquí analizamos la estructura espacial
del óvulo de dos células por medios de su centrifugación y subsecuente cultura in vitro.
Este método no ha sido usado en mamíferos, excepto por un reporte de búsqueda
preliminar por Mulnard (1970).

2. MATERIAL Y METODOS:
Para el desarrollo de este proyecto los investigadores desarrollaron una serie de pasos
que comenzaron por la Colección de embriones de ratón, que luego fueron sometidos a
un proceso de centrifugación para poder ser cultivarlos in Vitro y posteriormente ser
observados en microscopio electrónico y de luz.
Colección de los embriones:
Óvulos de dos células fueron colectados en medio Biggers conteniendo 4 mg/ml de suero
de albúmina bovina (BSA) de ratones superovulados de la cepa CF de 1 tensión, 36 h
después del presunto tiempo de ovulación.
Procedimiento de centrifugación:
Soluciones de dextrano (MW 40000 Sigma) fueron preparados en medios Biggers a
concentraciones de 17%, 15% y 11% (w/v), separados con CO2 en aire hasta ajustar el pH
a 7.2-7.4 y luego e introdujo secuencialmente en 0.8 ml de tubos de nitrocelulosa. Los
embriones fueron colocados en la parte más clara del gradiente discontinuo y los tubos
fueron centrifugados por 60 minutos usando un rotor basculante SW 39 del modelo de
centrífuga Beckman L. Las fuerzas centrífugas aplicadas en el rango de 15000 a 120000 x
g. La temperatura del contenido del tubo variaba entre 13 y 18 °C, excepto por
experimentos en el cual la centrifugación fue realizada a los 4°C.
Cultivo in vitro:
Siguiendo la centrifugación, los óvulos fueron enjuagados con medio Biggers y, o
arreglados inmediatamente o cultivados en diferentes tiempos antes de la fijación. Los
óvulos fueron cultivados en microgotas de medio Biggers con BSA en placas de Petri de
plástico (Falcon) en aceite mineral a 37°C en una atmósfera húmeda de CO2 en aire, pH
7.2-7.4. El número de células fue determinado por el método de Tarkowski (Tarkowski,
1966). Antes y durante la centrifugación los óvulos fueron expuestos a temperatura
controlada y atmosférica; los tubos control fueron tratados similarmente.

Microscopio electrónico y de luz:

Luego de la centrifugación y el cultivo in vitro, los óvulos fueron procesados por
microscopios electrónicos y de luz así como los reportados anteriormente (Lois e
Izquierdo 1984; Izquierdo et al. 1984) sin agregar ácido tánico. La microscopía fue
realizada en grandes cantidades de glicerol. En algunas series experimentales,
inmediatamente luego de la centrifugación los óvulos fueron lavados en buffer de
estabilización (Sobel 1983 a), permeabilizados con 0.5% de Triton X-100 en buffer de
estabilización por 1 minuto a 37°C y lavados en el mismo buffer por 30 s antes de la
fijación.

Técnicas citoquímicas:
La demostración no específica de lípidos fue lograda por Red Oil, Sudan Negro (Casselman
1959) y por su osmofilia. La fosfatasa ácida fue demostrada en grandes óvulos de acuerdo
al método Gomori modificado por Weissenfels (PEarse 1968). El ADN fue demostrado por
un test de Feulgen modificado en óvulos que habían sido arreglados en alcohol
formaldehído acético (Pearse 1968).

Inhibidores del citoesqueletos:

En estas series de inhibidores fueron agregados al medio de cultivo y al gradiente de
dextrano. Algunos experimentos fueron empezados con una mezcla de 0.5 ug/ml de
colcemida (Sigma) y 0.5 ug/ml de citocalasina D (Sigma), otros fueron empezados con
colcemida (2 ug/ml) o con citocalasina (0.5 ug/ml); finalmente, algunos experimentos
fueron completados a 4°C. Los óvulos fueron cultivados en medios que contenían
inhibidores por 1 h antes, durante y después de la centrifugación. Los inhibidores fueron
preparados en dimetilsulfoxido (DMSO) (Izquierdo et al. 1984) no se observaron
diferencias entre controles con o sin DMSO.
 Figura 01. Embrión fijado después de centrifugación a 90000x g (fig. 1) o en 70000X g
(fig. 2-5). 1-2 zona de lípidos (L), zona de vesículas y membranas (VM), zona
homogénea (H); plana cisternas (flecha), zona pelúcida (ZP). Bares. Figura 1, 2 um; Fig.
2, 1um; Fig. 2, 1um, 3 Zona de las mitocondrias (m) un material fibrilar (f). Golgi
sustancia (g); cuerpos multivesiculares (mb). Microvellosidades (mv) en el espacio
interblastomerico Bar, 1um. 4 Zona de cuerpos cristaloides (cb). Sección tangencial
revela corteza (Co) y microvellosidades (MV). Material fibrilar (f). Bar, 0,5 um, 5 de
contraste de fase de óvulo entero; tapa lípidos (L), capa hialina (H) y la capa granular
(G). Bar, 10um

3. RESULTADOS:
Estratificación: observaciones de microscopio de luz
Luego de la centrifugación, los óvulos se encontraron en capas correspondiendo de
13% a 15% de dextrano. Las fuerzas centrífugas mayores que 30000 x g inducidas a
estratificación visible y reproducible del citoplasma. Algunos óvulos empezaron a
romperse a 120 000 x g.
El embrión 71 fijado arreglados después de la centrifugación a 70 000 x g o
90 000 x g mostraron, mediante un microscopio de luz, una ligera elongación de sus
blastómeros en el sentido de las fuerzas de centrifugación y algunas veces un
estrechamiento. Los óvulos usualmente se orientan a sí mismos en tal forma que el
estrato estaba en un ángulo de 90° en un plano separando ambos blastómeros. El
cuerpo polar ha sido observado más frecuentemente que en el polo centrífugo.
Una capa de material lípido, fuertemente manchados con Sudan Negro o
Aceite Rojo o Tetraóxido de Osmio, se hallaron al polo centrípeto de cada blastómero.
Bajo la capa del lípido, fue hallada una cubierta de hialina, la cual en su margen
centrípeto fue marcado ligeramente con actividad de fosfatasa ácida. Bajo la cubierta
de hialina, una capa granulada extendida en la parte baja en el polo centrípeto. En esta
capa, el núcleo pudo ser visto abarcando
desde el centro del blastómero hasta el
polo centrípeto, como si fuera jalado en
esa dirección por el denso núcleo (Fig.7).
El test de Feulgen reveló que no había
presencia de cromatina fuera del núcleo
elongado.
El 33 que fue extraído con Triton X-100
antes de la fijación y la observación a
microscopía de luz mostró estratificación
similar a la de los no extraídos.
Incluyendo las tapas de lípidos. Sin
embargo, la capa de hialina apareció
parcialmente extraída y se observó una
reducción general en el volumen de los
blastómeros de alrededor de 50%.(Fig. 8).

Estratificación. Observaciones al
microscopio electrónico

En 62 embriones, que se observaron por microscopía electrónica, las capas descritas

por microscopía de luz pueden ser subdivididas en zonas. La tapa de lípidos
corresponde a la zona de lípidos y la capa hialina se subdivide en una zona centrípeta
llena de vesículas y membranas, y una zona centrífuga homogénea.

L= zona lipídica

VM = zona de vesículas y membranas. (zona hialina)

N = zona homogénea. (Zona hialina)

La capa granular está subdividida en una zona centrípeta que se caracteriza por el
material de las mitocondrias y material fibrilar y una zona de centrífuga que muestra
cuerpos cristaloides.
 M = zona de mitocondrias
f = material fibrilar
cb = cuerpos cristaloides
La zona de lípidos contiene innumerables gotitas y entre ellas, vesículas y
vesiculadas mitocondrias eran ocasionalmente reconocidas. La zona de vesículas y
membranas contiene vesículas de diferente tamaño, aisladas o asociadas y una plana y
membranosa cisterna. Las vesículas junto a la zona de lípidos probablemente
corresponden a los lisosomas ya que su localización coincide con la actividad de la
fosfatasa ácida demostrada en los embriones en conjunto y las membranas pueden
corresponder a suavizar el retículo endoplásmico. La zona homogénea contiene
material fino granular uniformemente distribuido y sin orgánulos.
La zona caracterizada por el material de las mitocondrias y fibrilar también contiene
la sustancia de Golgi, cuerpos multivesiculares y las vesículas que son más pequeñas
que las que se encuentran en la zona de vesículas y membranas. La zona de cuerpos
cristaloides no se detecta cuando los embriones han sido centrifugados a menos de
70.000 x g; a esta o fuerzas superiores esta zona parece llena de material fibrilar y
cuerpos cristaloides. El córtex de la célula es claro y muestra una malla fina carente de
orgánulos. Parece ser afectado por centrifugación y no cambia apreciablemente de
acuerdo a la fuerza centrífuga aplicada.
En 25 embriones los cuales fueron extraídos con detergente inmediatamente
después de la centrifugación y antes de la fijación para microscopía electrónica, la capa
lipídica persiste pero parece algo extraído y numerosas gotitas de lípido se agregan en
unas pocas gotas grandes. Todas la citomembranas en ésta y las otras capas han
desaparecido, quedando fragmentos de materia amorfa.
El material fibrilar se conserva y componentes del citoesqueleto se vuelven distintos
con el tratamiento con detergente. Particularmente evidente se muestran la corteza
celular densa, la red interna de microfilamentos de actina (7nm) y los microtúbulos (21
nm) observados en diversas ubicaciones, especialmente próxima al núcleo.
 f = material fibrilar
microfilamentos señalados con la flecha
co = corteza de la zona centrífuga

Relaciones espaciales cercanas fueron observadas entre los microtúbulos y las

indentaciones en el polo centripetal del núcleo, y microfilamentos son encontrados
alrededor del núcleo.

La cabeza de la flecha señala los microfilamentos y la flecha muestra

los microtúbulos cercanos al núcleo (N)

El núcleo, ya sea visualizado en preparados de extracción con detergente o no, no

se desubica por centrifugación, de su inserción en la zona de material mitocondrial y
fibrilar y se muestra elongado hacia polo centrifugo del blastómero. La parte
centrípeta final del núcleo nos muestra indentaciones profundas y el extremo
centrífugo contiene los nucléolos, fusionados en uno o dos.
 Núcleo elongado hacia la zona centrífuga,
con el nucleolo (Nu), con indentaciones
en la zona centrípeta

Restablecimiento de embriones estratificados: Observaciones al microscopio óptico

Un número embriones (66) se fija 30 mm a 4 h después de ser centrifugada a 70.000 o
90.000 x g y se observaron al microscopio óptico. Dentro de 30 a 40 minutos después
de centrifugación, los núcleos y nucléolos se encuentran de nuevo en el centro de la
célula y la estratificación del citoplasma ya ha desaparecido, pero las tapas de lípidos
persistir en los polos centrípetos de ambos blastómeros.
En embriones en los que se permitió seguir con su desarrollo, la segunda división por
lo general divide a las tapas y conforme se da escisión, las gotas de lípidos son
redistribuidas entre los blastómeros.
La centrifugación no impide el desarrollo a blastocitos normales con cerca de 30
células, aunque la blastulación es algo retrasada. El porcentaje de blastulación en
embriones centrifugados es de aproximadamente 20% menos que en los embriones
no centrifugada y tratados en condiciones similares: sin embargo, un aumento en la
fuerza centrífuga de 50.000 x g a 90.000 x g no cambia el porcentaje de blastulación
significativamente. El porcentaje blastulación sobre los controles en experimentos de
centrifugación es aproximadamente 73% que es considerablemente más bajo que el
91-92% observado en nuestros cultivos estándares. Ésta diferencia puede atribuirse a
bajas temperaturas y a la alcalinización de los medios, cuando los embriones están
fuera de la incubadora (ver Materiales y métodos).

Efecto de los inhibidores del citoesqueleto: observaciones al microscopio óptico y

electrónico
Las observaciones por microscopía de luz en 180 embriones que fueron tanto
centrifugados como cultivados en un medio que contenía una mezcla de colcemida
(0,5 ug / ml) y citocalasina D (. 0.5 ug/ ml) revelan que los embriones tratados con esta
mezcla de mineral de drogas son frágiles: a 70.000 x g. 30% de ellos se rompieron
entre la capa hialina y granular, y en 90.000 x g. Esto se observa en el 60% de los
 embriones. Sólo el 10% de los embriones no tratados se rompieron a 130.000 x g. La
estratificación de los óvulos tratada y no tratada es bastante similar, pero los
embriones tratados a 30.000 x g muestran el efecto producido por 5,000 x g en los
óvulos sin tratar.
Los óvulos que se centrifugaron y cultivaron en medios que contienen colcemida o
citocalasina D se repusieron de la estratificación mucho más lento que óvulos de
control, y su desarrollo normal se detuvo. Nosotros comparamos el efecto de estas
medicinas registrando el tiempo que pasó después de la centrifugación hasta que el
nucléolo recobrara una posición central en blastómeros, que revela la recuperación de
forma y la posición de los núcleos. La observación de 144 óvulos tratados con
colcemida muestra que en el 93% de ellos el nucléolo recuperó su posición central
180 minutos después de la centrifugación, mientras esta situación se recuperó
después de 240 minutos en el 95% de 236 óvulos tratados con citocalasina D.
La morfología de los 98 óvulos centrifugados tratados con colcemida o citocalasina D,
que se extrajeron del detergente después de la centrifugación, es diferente de la
descrita anteriormente para los óvulos sin tratar. Bajo el microscopio óptico la
diferencia destacable es el contorno liso o el polo centrípeto nuclear en óvulos
tratados con fármacos, en comparación con las hendiduras observadas en los óvulos
sin tratar.
Los embriones que fueron tratados con colcemida o en frio el núcleo permanece en la
capa granular, mientras que el tratamiento con citocalasina D causa una separación del
núcleo dejando un espacio entre el material fibrilar y la membrana nuclear colapsada.
El citoplasma de los embriones tratados con colcemida carece de perfiles de micro
túbulos y los embriones tratados con citocalasina D demuestran una corteza
discontinua y una red interior relajada (suelta floja) del material fibrilar.
4. CONCLUSIONES:
Estratificación de los componentes celulares:
La estratificación del citoplasma ha demostrado que al menos dos tipos de los cuerpos
vesiculares pueda ser reconocido por su densidad: vesículas de luz que se encuentran
debajo de la tapa de lípidos, que incluyen elementos que muestran la actividad
fosfatasa ácida y las vesículas pesados que se encuentran en la capa granular mezclan
con el material de las mitocondrias y fibrilar nuestras observaciones sugieren que este
material fibrilar, en virtud de la fuerza de las pilas centrífugas hasta la formación de
cuerpos cristaloides.
El alargamiento de los núcleos y la muesca en su fuerza centrípeta postes pueden
atribuirse a un discontinuo de la membrana nuclear en el citoesqueleto. De hecho, el
detergente de óvulos extraídos revelan los microtúbulos y microfilamentos asociado a
la hendiduras nucleares y estas desaparecen de óvulos que han sido tratados con
colcemida o denominado citocalasina o frío en él no se ha estudiado los otros
componentes del citoesqueleto que han sido identificadas en embriones de
preimplantación, alfa-actinina, citoqueratina, miosina, fodrina y espectrina.
 Recuperación por estratificación
La recuperación pasiva de acuerdo a la densidad relativa probablemente requeriría de
un periodo más largo que el tiempo de recuperación que nosotros hemos encontrado
y no explicaría por qué las gotas de lípidos permanecen coleccionadas en los polos
centrípetos. Sin embargo, esto no es posible para descartar el rol de una matriz viscosa
no estructurada con comportamiento elástico (Crick y Hughes 1950) en la recuperación
del OVA después de la centrifugación. El rol del citoesqueleto es sugerido por el
retraso observado en la recuperación cuando los rectritores son usados especialmente
con cytocalasina D. Aunque estas drogas en las concentraciones usadas aquí,
previenen la división celular y el desarrollo normal (mirar Izquierdo et. at. 1984), el
citoesqueleto no es desmantelado y la recuperación desde la estratificación quizá aún
sea atribuida para un armazón resiliente que está conectado para diversas
citomembranas y de este modo mantenerlos o restaurarlos en una orden especial.

El desarrollo después de la recuperación

En todos los experimentos de centrifugación, la hendidura y el desarrollo del
blastocisto parcialmente son perjudicados probablemente porque los embriones son
observados bajo el microscopio simple durante la hendidura, la consolidación o la
formación del blastocisto, parece que la centrifugación no causa ningún desorden de
organización de célula fundamental. Asumiendo que el desarrollo posterior es
completamente normal, al menos dos interpretaciones generales de los resultados es
posible. Primero, la existencia de estructura preestablecida que se opone a la
centrifugación o fácilmente nuevas ensenadas de ello, que retira los componentes de
célula complicados en morfogénesis a su lugar apropiado. Segundo, la ausencia en esta
etapa de cualquier estructura de morfogénesis espacial. Nuestros resultados aquí
apoyan la primera interpretación pero no podemos ser más asertivos porque la
recuperación de la estratificación puede ser un proceso pasivo, o aún uno activo que
es sin relaciones a morfogénesis del blastocisto; y más lejos, porque las anormalidades
del desarrollo que pueden aparecer posteriores no han sido excluidas. Estas
publicaciones están todavía abiertas para el debate.

5. REFERENCIAS:
1. Biggers JD, Whiten WK, Whittingham DG (1971) The culture of mouse embryos
in vitro. In: Daniel JC (ed) Methods in mammalian embryology. Freema, San
Francisco, pp 86-116.
2. Casselman WGB (1959 Histochemical) Technique. Methuen, London.
3. Crick FH, Hughes AFW (1950) The physical properties of cytoplasman. A study
by means of magnetic particle method. Part I. Exp Cell Res 37: 37-80.
4. Damjanov I, Damjanov A, Lehto V-P, Virtanen I (1986) Spectrin in mouse
gametogenesis and embryogenesis. Dev Biol 114: 132-140.
5. Izquierdo L (1977) Cleavage and differentiation. In: Johson MH (Ed) Develoment
in mammal’s vol 2. North Holland, Amsterdam, pp 99-118.
6. Pearse AGE (1968) Hystochemestry, vol.1 Churchill, London.
7. Sobel S (1983) Localization of myosin in te preimplantattion mouse embryo.
Dev Biol 95:227-231