Vectores

Los vectores son moléculas de ADN de replicación autónoma que pueden usarse para transportar
fragmentos de ADN extraños. Es un vehículo utilizado en la clonación de genes. El ADN de interés
se clona primero en un vector apropiado y luego por transfección, el gen puede insertarse en el
huésped para su expresión. Para expresar genes hetrologos en células de mamíferos, usualmente
se usan vectores derivados de virus de mamíferos. Estos incluyen virus tales como Simian Viruses
40 (SV40), polyomavirus, herpesvirus y papovirus. Para construir vector el requisito es seleccionar
un promotor eficiente y también el marcador de selección. En este artículo un número de vectores
han sido discutidos por el autor

Vectores de expresión basados en plasmidos

El vector de expresión es un vector que permite la transcripción y la traducción de un gen extraño

insertado en él. Los plásmidos son moléculas de ADN circulares que llevan una existencia
independiente en las células bacterianas. Se trata de fragmentos de ADN cromosómicos de
aparición natural que se heredan de forma estable de una generación a otra en un estado
cromosómico extra.En la mayoría de los casos, los primeros intentos de expresar transitoriamente
proteínas recombinantes se ejecutaron con vectores de expresión 'estándar' que contienen
fuertes promotores virales, tales como SV40 o un Promotor de citomegalovirus (CMV) .20-21 Más
recientemente, al menos un promotor no viral, el factor de elongación (EF) -1 promotor, ha
recibido fuertes endosos, ya que parece ser tan fuerte o más fuerte que algunos promotores
virales

Adenovirus vectores

El adenovirus es un virus icosaédrico de tamaño medio, no envuelto. Se compone de una

nucleocápside y un genoma de ADN lineal de doble cadena que puede utilizarse como vector de
clonación. El amplio conocimiento y los datos recolectados a lo largo de los años sobre la
regulación de la transcripción de adenovirus favorecieron la ingeniería de vectores de adenovirus
modificados para la expresión heteróloga. 23-24 Para este propósito, las primeras regiones E1 y E3
fueron suprimidas. Esto hace que la replicación del virus sea incompetente y esta función debe
entonces proporcionarse en trans por la célula huésped. Se colocó un casete de expresión en lugar
de la región E1 suprimida. En el casete, el gen recombinante se colocó bajo el control de un
promotor tardıo principal adicional (o ectópico) o bajo control de un promotor exógeno, tal como
el citomegalovirus.25 Muy recientemente, se construyó una nueva serie de vectores, pAdBM5,
con potenciadores añadidos A la región del promotor tardío principal ectópico. El hecho de que el
virus pueda propagarse en cultivos de células en suspensión es una ventaja considerable para el
trabajo a gran escala. También se hicieron informes sobre los vectores virales recombinantes
adeno asociados también
Vaccinia vectores

El genoma del virus vaccinia se compone de ADN bicatenario de casi 200.000 pb y se replica en el
citoplasma de la célula huésped.28 Las células infectadas con el virus vaccinia producen hasta
5000 partículas virales por célula, lo que conduce a altos niveles de proteína recombinante
expresión. El sistema vaccinia se ha utilizado eficazmente a gran escala (1.000 L) para producir
muchos tipos diferentes de proteínas, tales como HIV-1 rgp160 de Pasteur-Merieux29 y humanos
pro-trombina por Immuno AG.

Retroviral vecto

Los retrovirus son virus de ARN que se replican a través de un intermedio dsDNA. La razón para
hacer retrovirus como vector reside en el hecho de que la mayoría de los retrovirus no matan al
huésped, sino que producen virones de progenie durante un período indefinido de tiempo. Por lo
tanto, se pueden aplicar vectores retrovirales para hacer líneas celulares transformadas
establemente. La siguiente razón es que la expresión génica viral es impulsada por fuertes
promotores, que pueden ser subvertidos para controlar la expresión de transgenes. La otra razón
es que algunos retrovirus, como las cepas anfotrópicas del virus de la leucemia murina (MLV),
tienen un amplio rango de huéspedes, lo que permite la transducción de muchos tipos de células.

Se ha informado de que el sistema de expresión génica exógeno basado en el vector retroviral es

un método alternativo para la generación de líneas celulares de mamíferos estables y de alto
expresivo.31 Varios métodos utilizados para la transfección de osteoclastos maduros y sus
precursores usando lentivirus y adenovirus han sido Descrito.32 El gen CD59 dirigido al vector
retroviral fue construido y transfectado en células de mama (MCF-7) .14 También se ha utilizado el
sistema retroviral para la producción de factor IX recombinante humano

Baculovirus como vectores

Los baculovirus poseen cápsidas en forma de varilla con grandes genomas de ADN de doble hebra.
Ellos productivamente infectar los artrópodos, en particular los insectos. Dos baculovirus han sido
ampliamente desarrollados como vectores, a saber, el virus de la poliedrosis nuclear múltiple
Autographacalifornica (AcMNPV) y el virus Bombyxmorinuclearpolyhedrosis (BmNPV). El primero
se usa para la expresión de proteínas en líneas celulares de insectos, particularmente las derivadas
de Spodopterafrugiperda (por ejemplo, Sf9, Sf21). Este último infecta el gusano de seda para la
producción de proteína recombinante.Se ha descrito la construcción y aplicación de un baculovirus
recombinante que contiene un casete de expresión bicistrónico que puede usarse para la
expresión de proteína estable en células de mamífero.33 También se estudió la expresión de una
proteína secretada en células de mamífero usando partículas de baculovirus.

Proceso para la transferencia del gen

La elección del vector depende del método utilizado para la introducción del gen extraño en las
células de mamífero y de los elementos de control utilizados para la expresión eficaz del ARNm y
la síntesis de proteínas. Existen dos métodos generales para la introducción de ADN extraño en
células de mamíferos. Uno está mediado por la infección por el virus y el otro por la transferencia
directa de ADN a las células que emplean liposomas químicos, fosfato de calcio, DEAE-de-xtran y
polibreno y electroporación física y métodos de microinyección.19

El fosfato de calcio, el PEI y la electroporación han demostrado ser útiles como vehículos /
enfoques para la expresión génica transitoria a gran escala.35-38 Los productos comercialmente
disponibles para la transferencia de ADN se venden usualmente en pequeñas cantidades y no
están diseñados para usarse en reactores o con Grandes masas celulares. El fosfato de calcio y el
PEI logran la transferencia de ADN formando complejos con ADN en condiciones adecuadas y
estos complejos son absorbidos por las células a través de la endocitosis. Un cierto número de
métodos utilizados para transformar células también ha sido reportado por este autor también.

Líneas celulares

En la década anterior, la proteína terapéutica producida a partir de células de mamíferos han

cambiado el panorama de la salud humana. El valor de la proteína terapéutica ha hecho la
búsqueda en la dirección hacia adelante para líneas de células más rentables y eficientes que son
capaces de producir productos proteínicos de alta calidad. Los bioprocesos basados en células de
mamíferos se han aplicado en la fabricación de vacunas virales, proteínas diagnósticas y
terapéuticas en el pasado. En la producción de proteínas terapéuticas, las células son el huésped
para la producción de proteínas. Las células de mamífero huésped más ampliamente utilizadas son
células de ovario de hámster chino (CHO) y células de mieloma de ratón, incluyendo células NS0 y
Sp2 / 0.6 Dos derivados de la línea celular CHO, CHO-K1 y CHO pro-3, dieron lugar a la Dos líneas
de células más comúnmente utilizadas en el bioprocesamiento de hoy, DUKX-X11 y DG44. Estas
dos líneas celulares fueron diseñadas para ser deficientes en actividad de dihidrofolatereductasa
(DHFR).

Se han utilizado varias líneas de células de mamífero para la expresión de proteínas, siendo las
más comunes HEK 293 (riñón embrionario humano) y CHO (ovario de hámster chino). Estas líneas
celulares pueden transfectarse usando polietilenimina (PEI) o fosfato cálcico. Las células HEK 293
exhiben el nivel más alto de transfección mediada por PEI con 50-80% de células que muestran
expresión de proteína verde fluorescente (GFP) 9, y ahora se usan ampliamente para la producción
de proteínas recombinantes, tanto por transfección transitoria como por la formación de Estable
líneas celulares.
La expresión de proteínas en células de mamíferos también puede lograrse usando transducción
mediada por virus mediante técnicas tales como el sistema BacMam.10 Esta tecnología utiliza
baculovirus recombinantes para la transducción simple de células de mamífero, permitiendo la
producción de cantidades miligramo de proteína para estudios estructurales.11 Otras células
También se han utilizado para estudios estructurales líneas como COS y Vero (riñón de mono
verde africano), HeLa (cáncer cervical humano) y NS0 (mieloma de ratón). Algunas de estas líneas
celulares como NS0 son más difíciles de transfectar. La transfección se puede lograr usualmente
mediante electroporación, y solo se usan en producción de líneas celulares estables. Un número
de líneas de células de mamífero se han resumido en Las principales ventajas de la expresión de
células de mamíferos son que las señales para la síntesis, el procesamiento y la secreción de
proteínas eucariotas son reconocidas apropiadamente y eficientemente por las células de
mamífero. Sin embargo, cabe señalar que existen diferencias entre especies

De forma MAS DETALLADA LAS LINEAS CELULARES

CHO

El caballo de batalla de la producción de proteínas de mamíferos (especialmente en Escala

industrial) es la línea celular CHO, aislada por Theodore Puck en A finales de la década de 1950 [9].
Inicialmente seleccionado para estudios citogenéticos de radiación Debido a su bajo número de
cromosomas (2n = 22), las células CHO tienen Demostrado ser una línea celular resistente y
confiable en cultura. Desde el anuncio comercial Introducción del activador del plasminógeno
tisular humano (tPA) Como la primera proteína terapéutica recombinante producida a partir de
mamíferos Células [10], el ingreso global anual de los productos de CHO Ha aumentado a más de
100.000 millones de dólares EE.UU. y continúa Crecer [11]. El amplio éxito de la plataforma CHO se
debe A su incomparable adaptabilidad que permite el crecimiento de estas células A altas
densidades en cultivos en suspensión y facilidad de adaptación a Libre de suero. Ha habido una
gran mejora En la calidad y disponibilidad de productos químicos Medios que están desprovistos
de materiales derivados de animales. Estos adaptados Los medios de comunicación son más
rentables, ya que no requieren suplementación Con suero fetal de ternera; Más seguro, ya que
existe un menor riesgo de Contaminación por priones a partir de suero bovino; Y han simplificado
De procesamiento aguas abajo, ya que contienen menos proteínas Contaminantes. Además, un
estudio realizado en 1989 puso a prueba Patógenos (incluidos el virus de la inmunodeficiencia
humana (VIH), la gripe, Polio, herpes y sarampión), y encontró que la mayoría de ellos No se
replican en células CHO, haciendo así que los CHOs sean ideales Punto de vista [12]. Sin embargo,
la adaptabilidad de la línea CHO También tiene sus inconvenientes, ya que cada objetivo de
producción Selección de clones que exhiben las propiedades fenotípicas necesarias, Incluyendo la
calidad / uniformidad del producto, duplicando el tiempo y largo En condiciones de bioproceso.
Incluso cuando un Se ha identificado el clon de producción de CHO, la deriva fenotípica (Es decir,
cambios en las características previamente seleccionadas) no es Poco común y sigue siendo un
desafío [11].Aunque la mejora de la estabilidad clonal (es decir, la uniformidad del producto) es
una Área de estudio intenso, las mejoras más significativas a CHO Han resultado de la optimización
de los medios de Estrategias y procesamiento posterior. Estas mejoras han Dio lugar a
rendimientos que oscilaban entre 2 y 6 g / l para los productos de anticuerpos [13]. Un enfoque
particular de la optimización del producto en las células CHO Es la glicosilación, ya que se ha
demostrado que la variación en la glicosilación Afecta la estabilidad y la función del producto, y no
natural Glicoformas pueden ser inmunógenas [14 - 16]. Esto es particularmente Verdadero del
epítopo terminal galactosa-a-1,3-galactosa (a-Gal) Que se ha demostrado que se añade a las
proteínas producidas En líneas celulares murinas, y es capaz de inducir una respuesta inmune En
los seres humanos [17]. La importancia de los perfiles de glicoforma Terapéutica ha sido destacada
por los efectos clínicos adversos Para Ingenieros Biológicos (SBE), con el objetivo de identificar De
los marcadores genéticos asociados con alta productividad [12]. Si bien no hay duda de que las
células CHO seguirá siendo utilizado Y desarrollado para la producción biofarmacéutica, el empuje
para generar Proteínas humanas más complejas, con un mejor perfil de seguridad, Ha llevado al
desarrollo de las líneas ya existentes ya la generación De nuevas líneas de células humanas que
creemos que serán las plataformas del futuro.Asociada con una respuesta inducida por la
anafilaxia mediada por IgE en Pacientes tratados con el anticuerpo comercial Erbitux (cetuximab),
Que se fabricó en una línea celular de mieloma murino Y poseen a-Gal epítopos [17, 18]. Se pensó
que CHO Las células carecían de la maquinaria biosintética para producir el epítope a-Gal, Pero
esta suposición ha sido cuestionada por los informes Que las células CHO pueden añadir el
antígeno a-Gal a las células recombinantes Productos, como se ha observado para Orencia
(abatacept) [17]. Por lo tanto, Es esencial que los clones de producción de CHO sean
cuidadosamente monitoreados Para la uniformidad y seguridad del producto en términos de
glicosilación Perfiles La variabilidad genómica de las células CHO y el hecho de que
Funcionalmente hemizygous para muchos genes [19, 20] también tiene ciertos Ventajas, ya que ha
permitido el aislamiento de líneas mutantes con Deficiencias en las enzimas metabólicas. Estos
mutantes son dependientes Sobre ciertos nutrientes para la supervivencia, haciéndolos ideales
para la generación De líneas de productores usando la deficiencia como un marcador de selección.
Los mutantes de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR) Generado de esta manera [21] y se
discutirá más adelante. Apoyar Desarrollo de CHOs para la producción de proteínas, un genoma
Proyecto de secuenciación se inició en 2002 como una Entre la Universidad de Minnesota y la
Tecnología de Bioprocesamiento Instituto de Singapur (A / ESTRELLA). Esta colaboración Estando
construidas dos bibliotecas de cDNA a partir de tres líneas celulares CHO, Cultivadas bajo
diferentes condiciones, que corresponden a más de 4000 Secuencia tags (ESTs) [22]. Este estudio
inicial llevó a Los esfuerzos de secuenciación bajo los auspicios del Consorcio sobre Hamster Ovary
Cell Genomics en asociación con la Sociedad

Para Ingenieros Biológicos (SBE), con el objetivo de identificar De los marcadores genéticos
asociados con alta productividad [12]. Si bien no hay duda de que las células CHO seguirá siendo
utilizado Y desarrollado para la producción biofarmacéutica, el empuje para generar Proteínas
humanas más complejas, con un mejor perfil de seguridad, Ha llevado al desarrollo de las líneas ya
existentes ya la generación De nuevas líneas de células humanas que creemos que serán las
plataformas del futuro.

HEK 293
Desarrollado casi dos décadas después de la línea celular CHO, el 293 La línea celular fue la
primera línea humana que se transformó usando cizalla Adenovirus fragmentos de ADN del
serotipo Ad5 [23]. Transformación De las células del riñón embrionario humano (HEK) por ADN
viral Una técnica de transfección de calcio desarrollada por Graham y van der Eb [24, 25]. Desde su
desarrollo, la célula 293 Line se ha convertido en una de las líneas celulares humanas más
comúnmente utilizadas Para la producción de proteínas. Ha habido muchas variantes del original
Line, como el 293N3S desarrollado para el crecimiento de la suspensión en biorreactores Para la
producción de adenovirus [26] y la línea 293S que fue Adaptado para crecer en condiciones libres
de suero [27]. Para mejorar La expresión génica transitoria (que se discute a continuación), dos Se
desarrollaron líneas, la línea 293-T que expresaba el SV40 de Tantigen grande [28] y la línea 293-E
que expresa el virus de Epstein-Barr EBNA1 proteína [29]. Las dos últimas líneas sostienen la
replicación episomal De plásmidos que contienen el origen de replicación SV40 O el oriP de EBV,
respectivamente, prolongando de este modo la expresión de El gen diana después de la
transfección transitoria. Aunque las células CHO Ha sido el caballo de batalla de la producción de
proteínas recombinantes, el 293 Línea ha crecido en prominencia con la realización de que las
proteínas Producidas en células HEK son una aproximación más Proteínas humanas en términos de
modificación postraduccional y Función [30]. Las mejoras en los procesos culturales han
Plataformas basadas en 293 capaz de soportar rendimientos de anticuerpos 1 g / L [31]. Más
recientemente se ha desarrollado la línea HKB11 Que es un híbrido entre la línea HEK 293S y una
célula B humana Línea, 2B8 (derivado de una línea de linfoma de Burkitt) [32]. Esta línea Combina
las características de las líneas parentales, resultando en un sistema que Es fácil de transfectar
(una característica de 293s), con la capacidad de secretar Grandes cantidades de proteína (una
característica de las células B). Es utilidad Ha sido ampliamente demostrado en el caso de la
coagulación humana Factor VIII (que contiene 25 sitios de glicosilación N-ligados potenciales, 6
sitios de sulfatación de tirosina y 7 enlaces disulfuro) con rendimientos que son Aproximadamente
8 veces más alto que la línea 293 parental [33

PER.C6

La línea PER.C6 (Crucell) se originó originalmente de humanos Células retinoblásticas

inmortalizadas por transfección con un minigén E1 Para la producción rentable de fármacos
recombinantes seguros y de grado clínico. Adenovirus vectores [34]. Sin embargo, esta línea de
células también tiene Varias características que lo hacen ideal para la producción de proteínas
recombinantes: PER.C6 se obtuvieron de conformidad con el Práctica y ha sido ampliamente
documentado, los bancos de células Estados Unidos y la Comunidad Económica Europea
Requisitos reglamentarios y, lo que es más importante (de Punto de vista), pueden cultivarse en
suspensión a altas densidades celulares (Hasta 1 107 células / ml) en medio exento de suero. Estas
células fueron Demostrado producir fácilmente 300-500 mg / L de IgG sin ningún medio O la
optimización de la alimentación [35].

CAP / TAC
Similar a la línea PER.C6, la Producción de Amniocitos del CEVEC (CAP) Originalmente desarrollada
para la producción de adenovirus por Transformar amniocitos humanos primarios (obtenidos
transabdominalmente Por amniocentesis) utilizando las funciones E1 de Ad5 [36]. Una variante De
esta línea, CAP-T, se generó que constitutivamente Expresa el antígeno T grande de SV40 para
hacerlos adecuados Como huésped para la expresión génica transitoria utilizando plásmidos que
llevan el SV40 o; Esta línea es capaz de expresar y secretar previamente Difíciles de expresar
objetivos de proteínas [37]. Se plantea la hipótesis de que la Origen de las células CAP puede
conducir a un origen diferente o Repertorio de enzimas de procesamiento y chaperones en
comparación Líneas de producción más diferenciadas. Esta hipótesis es apoyada Por el ejemplo de
la proteína morfogenética ósea (BMP) Antagonista que no pudo ser secretada a partir de células
HEK 293 (Donde se encontraba en la fracción insoluble), pero fue exitosamente Secretadas en el
medio por células CAP. Los rendimientos de unos pocos Otras proteínas de prueba (fosfatasa
alcalina embrionaria secretada, SEAP Y un dominio extracelular del receptor de quinasa) parecen
indicar que Las células CAP-T son al menos tan buenas como las células HEK 293-E, si no Un poco
mejor, y superior a las células CHO [