CLASE 1

Introducción a la
Genética forestal II
Conceptos básicos

Ing. MSc Joel E. Odicio Guevara

1
 Algunos definiciones importantes
 Son las actividades restringidas al estudio genético de los
árboles

 La genética forestal trata de la aplicación de los principios

genéticos generales en el manejo de los recursos forestales.

 Entre las aplicaciones específicos de la genética forestal

están, por ejemplo la regeneración natural y artificial, la
producción de semillas, la transferencia de semilla, la
conservación de genes y el mejoramiento forestal.

2
1. Mejoramiento genético forestal
 Son actividades relacionadas con la selección dirigida, el
cruzamiento y reproducción de árboles, con un objetivo
predeterminado
ejemplo: Ejemplo: desarrollar una raza de árboles resistentes
a una peste o producir árboles que posean una madera
especialmente deseada
 El objetivo fundamental es el aumento de la productividad y
la adaptabilidad de dichas especies, así como la
conservación a largo plazo.
 Se basa en la selección y mejora continua

3
Mejoramiento genético forestal: de un árbol torcido y enfermizo a un árbol recto y vigoroso

4
 Es la combinación de las actividades silviculturales (ej.:
preparación del sitio, fertilización, etc.) y de mejoramiento
genético (control del parentesco) para mejorar la
producción total y la calidad de los productos obtenidos del
bosque.

 Es una herramienta adicional de la silvicultura relacionada

con la estructura genética de los árboles usados en las
operaciones forestales
Objetivo: obtener productos forestales con el máximo de
valor en
un mínimo de tiempo y en la forma más económica posible.

5
Mejoramiento genético forestal:
SELECCIÓN Y MEJORA continua en

Plantaciones forestales Rodal semillero de bolaina INIA-Pucallpa

6
Sistemas agroforestales tornillo-maíz en Tarapoto
 2. Variabilidad genética
 Es la variación de los genes dentro de las especies, no
son 100% heredables, mayormente son cambiantes en
función al medio ambiente.
 Se puede cualificar y cuantificar (color, sabor, forma,
tamaño, diámetro, altura…)
 Esta presente en sus características externas (fenotipo)
e internas (genotipo). La primera es fácil de observar, el
segundo requiere de análisis de ADN

Variabilidad genética del7 aji

Variabilidad genética de la papa Variabilidad genética del cacao
Y como es la variabilidad genética de un
árbol?
 Son mas difíciles de cuantificar y cualificar en comparación a
un cultivo agrícola.

 No confundir la expresión fenotípica propia de una especie

forestal (ejemplo: fruto en baya, corteza lisa, hoja
pubescente), con variabilidad genética de esa especie.

 La variabilidad genética puede estar en sus hojas, corteza,

densidad de la madera, frutos y/o semillas, pero son
imperceptibles a simple vista. Se requiere de largos y
tediosos trabajos microdescriptivos.

8
Variabilidad genética…
 Fenotipo (F) = Conjunto de caracteres visibles que un individuo presenta como
resultado de la interacción entre su genotipo y el medio ambiente

 Genotipo (G) = Conjunto de los genes que existen en el ADN de cada individuo.

 La presencia o carencia de la variabilidad genética es explorada en la

actualidad por los marcadores moleculares a través de los polimorfismos.
Estos polimorfismos genéticos permiten calcular las frecuencias alélicas
 El conocimiento de la variación genética dentro y entre poblaciones es
esencial para el establecimiento de prácticas de conservación en plantas
amenazadas.

9
3. Polimorfismo genético
 Son los múltiples alelos de un gen en una población (diferentes
fenotipos)

 Consiste en la presencia coetánea de diferentes formas de un

mismo gen (alelos) en una población.

 Son variantes de una posición de la secuencia del ADN que

coexisten simultáneamente en una misma población.

 Para que las variantes sean consideradas polimórficas el alelo

menos frecuente tiene que aparecer con al menos una frecuencia
de 1% en el genoma.

 Si la frecuencia es menor a 1% las variantes se consideran

“RARAS” o mutación
10
11
4. Frecuencias alélicas = f(A), f(a)
 Es la proporción (%) que se observa de un alelo especifico (A,a)
respecto al conjunto de los que pueden ocupar un locus
determinado.

 La suma de las frecuencias de los alelos es igual a 1. asi: p+q=1

p= frecuencia del alelo dominante (A), ejemplo 0.7 = 70%
q=frecuencia del alelo recesivo (a), ejemplo 0.3 = 30%

 son usadas para representar la cantidad de diversidad genética

Ejemplo: 4 individuos AA, Aa, AA, aa
La frecuencia alélica de A es:
p f(A) = 2+1+2+0/2 x 4 = 0.6 = 60 %
12
5. Diversidad genética
 Se refiere a todas aquellas variaciones heredables (genotipo) que
ocurren en cada organismo, entre los individuos de una población
y entre las poblaciones dentro de una especie.

 La diversidad genética es fundamental para la conservación de las

especies pues actúa como amortiguadora ante la estocasticidad
ambiental (esta sometido al azar) y permite la adaptación,
evolución y supervivencia de las poblaciones

 Por lo que su conocimiento y comprensión es importante para la

conservación y la genética evolutiva

 El sistema de reproducción de las plantas y los mecanismos de

dispersión de polen y semillas son fundamentales en la
distribución de la diversidad genética
13
Arboles de diferentes
especies que difieren en :

Forma de fuste
Tipo de corteza
Tipo de copa
Tipo de hoja
Tipo de fruto
Otros…

14
PADRE : corteza externa fisurada, copa globosa HIJO : corteza externa fisurada, copa globosa

15
 6. Estructura genética
 Es el nivel y la organización espacial de la diversidad genética
dentro de las poblaciones, como resultado del proceso evolutivo
que incluye tanto factores genéticos como demográficos.

 Es generada por la dispersión de polen y semilla, selección natural,

sobrevivencia, el modo reproductivo (autogamia-alogamia), el tipo
de polinización (gravedad-anemófla-entomófla), la acción del
hombre en la fragmentación del hábitat y el origen (especies
nativas-especies introducidas). Estos interactúan para crear y
modificar la estructura genética dentro de una población

 Esta limitada por los límites de las distancias de dispersión de

padres a hijos; es decir, bajo un modelo de aislamiento por
distancia, en donde la probabilidad de flujo genético disminuye al
incrementarse la distancia espacial
16
7. Flujo genético/génico
 El flujo genético se refiere a todos los mecanismos que
generan movimiento de genes de una población a otra.
 El flujo genético entre poblaciones vegetales ocurre
mediante el movimiento de polen o de semillas.
 si el flujo genético entre poblaciones de una especie es alto,
todas ellas evolucionan de manera conjunta (a menos que
sea contrarrestado por selección o deriva génica), pero si es
muy bajo, empiezan a divergir, lo que puede contribuir al
aislamiento reproductivo y al establecimiento de linajes
evolutivamente independientes
 Para tratar de medir estas tasas de flujo génico se han
utilizado métodos directos e indirectos.
17
Polinización anemófila y entomófila Actividades antropogénicas (siembra-transporte de s

migración 18
Método directo
 Se basan en observaciones o experimentos que miden
el grado de dispersión de gametos o individuos, por
ejemplo con la captura y recaptura de individuos
marcados

Método indirecto
 Se basan principalmente en observar la distribución
espacial de alelos en las poblaciones para hacer
inferencias de los niveles o patrones de flujo génico

19
 El modelo usado comúnmente para estimar flujo génico
es el modelo de islas infinitas (infnite islands model) de
Wright (1951). Este modelo considera condiciones en
equilibrio entre un número infinito de islas o
subpoblaciones de igual tamaño, que intercambian
migrantes entre cualquiera de las islas con igual
probabilidad, a una tasa constante.

Esta formada por

formulas complejas de
matemática.
Lo calcula un software
especializado (Darwin, ,
Cervus , Genalex, Pop
gene) 20
8. Disturbio y perturbación
 Disturbio será considerado como el conjunto de procesos que
modifican los patrones espaciales y temporales de composición de
especies forestales, así como a la estructura, dinámica y
funcionamiento de las poblaciones

 Perturbaciones son las consecuencias de un disturbio en un sistema

 Los disturbios pueden ser caracterizados en términos de distribución

espacial, área o tamaño, intensidad, severidad, frecuencia, periodo de
rotación, y sinergismo (interacción con otros factores de perturbación)

 Los disturbios juegan un importante papel en los ecosistemas terrestres

que, dado que por su acción continua han provocado la adaptación de
las especies y han generado parte de la diversidad del planeta

21
Incendios forestales Roza, tumba y quema – fragmentación del bosq

Ciclo de vida natural del bosque - creación de nuevos habitad

22
 Los bosques nativos/virgenes son los ecosistemas que
más han sido afectados por la intervención humana
favoreciendo su fragmentación Las consecuencias de la
fragmentación involucran aspectos demográficos y
genéticos (perdida de variabilidad y diversidad
genética) en las poblaciones de plantas

 A partir de aquí la importancia del estudio genético

forestal, para estimar como los disturbios han o están
modificando la variabilidad genética
23
9. Métodos para estimar la diversidad
genética
 La diversidad genética se mide a partir de la DISTANCIA GENÉTICA

 La distancia genética es una medida de la

diferencia genética entre especies o entre poblaciones. Las
poblaciones con muchas genes similares tienen distancias
genéticas pequeñas. Esto indica que son cercanos y tienen un
ancestro común reciente.

 Las distancias genéticas se pueden clasificar en dos grupos: las

basadas en un modelo geométrico (matemático) (Cavalli-Sforza y
Rogers) y las basadas en modelos biológicos (Nei).

 El modelo biológico (el que estudiaremos) es a partir del análisis

de las frecuencias alélicas en la cadena de ADN

24
 Distancia genética menor

Distancia genética mayor

La distancia genética se incrementa conforme se incremente los Taxones (desde especie hasta las
divisiones) 25
Distancia genética de Nei (1972)
 Se fundamenta en que los diferentes alelos son originados
gracias a que una base nucleotidica es distinta. Por lo tanto
a partir de datos de frecuencias alélicas debería ser posible
calcular estadísticamente el numero promedio de las
diferencias en las bases nucleotidicas por locus.
 La distancia de Nei está formulada para un modelo donde se
asume que las mutaciones ocurren en forma infnita, con la
misma probabilidad para todos los alelos a una tasa de
mutación neutral, y que la variabilidad genética inicial en la
población está en equilibrio entre la variabilidad producida
por mutaciones y por deriva genética, siendo el tamaño
efectivo de la población, en cada una, constante.

26
27
Mutaciones y/o Cambios en las bases nucleotidicas,
a partir de aquí se modificaran los genes e
indirectamente los alelos
28
10. Deriva genética
 Es una fuerza evolutiva que actúa junto con la selección
natural cambiando las frecuencias alélicas de las
especies en el tiempo.

 Es un proceso estocástico (que depende del azar, no

determinista)

 Se trata de un cambio aleatorio en la frecuencia de

alelos de una generación a otra.

29
11. El equilibrio Hardy-weinberg
 Es un modelo teórico para genética de poblaciones. Se basa
en la hipótesis:

1. La población es panmictica = todos los individuos tienen la

misma probabilidad de aparearse y el apareamiento es al
azar (panmixia)
2. La población es suficientemente grande (para minimizar
las diferencias existentes entre los individuos.
3. La población no esta sometida a migración, mutación o
selección (no hay perdida ni ganancia de alelos)

30
CLASE 2

La diversidad genética y
marcadores genéticos (MG)

Ing. MSc. Joel E. Odicio Guevara

31
La diversidad genética
Recordando…
 se refiere a todas aquellas variaciones heredables que
ocurren en cada organismo, entre los individuos de una
población y entre las poblaciones dentro de una
especie.

 La diversidad genética es fundamental para la

conservación de las especies pues actúa como
amortiguadora ante la estocasticidad ambiental (esta
sometido al azar) y permite la adaptación, evolución y
supervivencia de las poblaciones
32
En donde se encuentra esa diversidad
genética?
 Las diferencias que distinguen una planta de otra están
codificados en el material genético de la planta, el ácido
desoxirribonucleico (ADN)

 Para que exista diversidad genética de existir diferentes

genes en el genoma, así como diferentes expresiones de
estos (alelos). 33
 Hoy en día ya se han secuenciado el genoma de 30
plantas, todas son cultivos agrícolas y arboles frutales
tales como:
 Arroz, maíz, soya, trigo, papa, café, plátano, palta,
manzana, cacao, mani, palta…

Y la secuenciación del genoma de los arboles forestales?

 no existe ninguno (aun no son considerados tan
importantes como los cultivos agrícolas), su estudio por
ahora solo esta limitado a determinar variabilidad
genética dentro y entre poblaciones
 Para ayudar identificar genes específicos ubicados en el
ADN, la mayoría de los científicos usan un método
indirecto llamado marcadores genéticos.

34
Marcadores genéticos
Se puede definir como:

 Es un hito (punto referencial) cromosómico o alelo que

permite el rastreo de una región específica de ADN.

 Es una pieza específica de ADN con una posición

conocida en el genoma.

 Es un gen cuya expresión fenotípica es generalmente

fácil de distinguir/ubicar, utilizado para identificar a un
individuo o una célula que lo lleva.
35
36
37
Clasificación de los marcadores
genéticos (MG)
1. Aquellas basadas en rasgos visualmente evaluables
(marcadores morfológicos y agronómicos) = fenotipo.

2. Aquellos basados en el producto de los genes

(marcadores bioquímicos: isoenzimas).

3. Aquellos que dependen de un ensayo de ADN

(marcadores moleculares)

38
Marcadores morfológicos
 Morfología = Parte de la biología que trata de la FORMA
de los seres vivos y de su evolución.

 los polimorfismos de los genes se detectan a través de

sus productos, por ejemplo: el color de flor, el tamaño
del fruto, tipo de hoja...

 En los arboles forestales se determina la altura y

diámetro del fuste, es decir la selección de los mejores
individuos “arboles madre” están basados en estas
características. A partir de ahí se debe seguir
seleccionando a las progenies.
39
 Esta selección solo esta limitada a características externas
(fenotipo), no a las internas (genotipo).

 El fenotipo depende del genotipo mas el ambiente, por eso

la progenie no garantiza que heredaran las características de
los padres.

 Son profundamente afectados por fluctuaciones

ambientales y por las etapas de desarrollo de la planta,
así como por el vasto número de individuos a analizar.

40
Entorno = Condiciones medioambientales-
edafoclimáticas

Suelo (nutrientes, textura)

Viento (resistencia, severidad)

Sol (evotraspiración, fotosíntesis)

Agua (intensidad de la precipitación)

Sequia (modificación de las raíces, disminución del

área foliar)

Altura (humedad relativa, precipitación)

41
Mapa genético del tomate basado en marcadores morfológicos

42
Marcadores moleculares (MM)
 Son secuencias identificables de ADN, encontradas en un lugar
especifico del genoma y transmitidos de una generación a otra.

 Nos permite estudiar un carácter (Fenotipo) o gen (Genotipo)

asociado a este, y este es de herencia mendeliana.
 se diferencia del marcador morfológico porque esta es detectada
como secuencias de ADN, no como carácter visual.

 Se utilizan para localizar y aislar genes de interés, a partir de allí

estiman la diversidad genética

 Los diferentes tipos de marcadores se distinguen por su

capacidad de detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples y
son de tipo dominante o co-dominante.

43
Que significa MM dominantes o
codominates?
 Que pueden detectar situaciones de dominancia o
codominancia de los alelos.
 Es decir los dominantes solo pueden detectar 1 alelo (una
banda en el gel de agarosa), y los codominantes pueden
detectar 2 alelos (2 bandas)
 Ejemplo: el humano es diploide (2 juegos de cromosomas,
uno proveniente del padre, el otro de la madre)
 Entonces, en cada locus puede existir 1 o 2 alelos, si hay un
alelo eso significa que ambos padres transfieren IGUAL
secuencia y tamaño (PP=homocigoto). Si hay 2 alelos
entonces ambos padres transfieren DIFERENTE secuencia y
tamaño (bP=heterozigoto)
44
 Ojo:
Esto es un par de
cromosomas antes de su
replicación, es decir cada
cromosoma solo tiene
una cromatida por eso no
lo vemos con forma de X

En cada locus un individuo podría presentar uno o mas alelos,

dependiendo del numero de juego de cromosomas que posea.

45
 Marcador molecular

Son segmentos de ADN fáciles de ser detectados y monitoreados de una generación a otra

46
Importancia de los marcadores
moleculares
 Con la llegada de los marcadores moleculares, el proceso de
selección se ha acelerado y el ámbito de la mejora vegetal
convencional ha aumentado mucho.

 El factor ambiente no interviene en este nivel de

caracterización, por lo cual las inferencias y conclusiones de
lo que viene pasando en una población de arboles forestales
son mas precisas. Además evita los defectuosos registros de
progenie (medir DAP y altura de fuste)

 Los marcadores moleculares son más confiable para

estudios genéticos que los marcadores morfológicos

47
48
Clasificación de los MM
 Las técnicas básicas de marcadores moleculares se pueden
clasificar en dos categorías: (1) técnicas no basadas en PCR y (2)
técnicas basadas en PCR.

 El análisis de PCR es un procedimiento in vitro para la síntesis y la

replicación de secuencias específicas de ADN.

 El PCR tiene tres pasos básicos: (1) desnaturalización de la

plantilla de ADN de doble cadena; (2) anclaje de los primers en la
región que se va a amplificar; y (3) amplificación/sintesis usando
una ADN polimerasa. Los tres pasos se repiten durante muchos
ciclos para producir grandes cantidades de segmento de ADN
específico (mas adelante detallare este importante proceso)

49
Clasificación de los marcadores genéticos (MG), dentro de ello, la clasificación de los Marcadores
Moleculares (MM)

Importante:
La extracción (aislamiento) de ADN de las muestras (mayormente hojas de
los árboles) para ser estudiadas es el primer paso para todos los tipos de
marcadores moleculares

Solo estudiaremos a los MM basados en la PCR, por ser mas precisos. 50

CLASE 3

Extracción de ADN en
especies forestales

Ing. MSc. Joel E. Odicio Guevara

51
Que es extracción de ADN y de
donde se extrae ?
 Es el procedimiento de extraer/aislar el Acido Desoxirribonucleico
(ADN) de las células de los seres vivos (especies forestales).

 Mayormente se extrae de las hojas jóvenes, porque el

rendimiento, calidad y pureza es mayor, son mas fáciles de
trasportar hasta el laboratorio y por no tener muchos
contaminantes (polvo, sílice, resinas, latex…) que dificultan el
proceso de extracción en laboratorio.

 La extracción de ADN es el primer paso para realizar los análisis

de diversidad genética dentro y entre poblaciones forestales
(plantaciones o bosque natural) con los Marcadores moleculares
(MM)

52
Algunos ejemplos
 Assessment of morphological and genetic diversity of Calycophyllum
spruceanum (Benth) K. Schum (Rubiaceae) in the Peruvian Amazon
2011. Bc.JanTauchen

 Genetic diversity of a tropical tree species Guazuma crinite Mart.

(Malvaceae) in the Peruvian Amazon. 2015. Bc laura tuisima coral

 Genetic variability of aguaje Mauritia flexuosa L.f (Arecaceae) in

Peruviam Amazon. Bc Joel Odicio Guevara

 Russel, R.; Weber, C.; Booth, A.; Powell, W.; Sotelo, C.; Dawson, K. 1999.
Genetic variation of Calycophyllum spruceanum in the Peruvian Amazon
basin, revealed by AFLP analysis. Molecular Ecology 8: 199–204

53
Mayormente el ADN se extrae de las hojas
jóvenes (rendimiento, calidad y pureza)

54
Que se necesita ?
Materiales de campo:

Gel de silice - absorber humedad

Tijera podadora

cooler Micro tubetes – 5-10 mg

55
Materiales de laboratorio

Succionadores / acopladores
Micropipetas de 0.1 – 500 ul de las micropipetas
Micro tubetes de 25 – 500 ul

arena/grava (micro esferas) esterilizada de 1- 2 mm Rejillas para los microtubetes 56

 Kit comercial de extracción de ADN
Nitrógeno liquido

57
Equipos de laboratorio

Mescladora Centrifuga, hasta 14 000 rpm

Refrigeradora, hasta -20 Cº

58
espectrofotómetro
Cuales son los métodos de extracción
de ADN ?
Los métodos mas importantes de extracción de ADN en plantas son

1. El método DOYLE o Mini prep, desarrollado por Doyle y Dolye

(1987)
2. El método CTAB, desarrollado por Rogers and Bendich (1985)

Existen laboratorios que combinan estos métodos o simplemente

han desarrollado su propio procedimiento, dependiendo de su
equipamiento y tipo de planta, sus resultados suelen ser de poca
calidad, rendimiento y pureza

59
 También se usan kits comerciales (como el de la foto mas
arriba) cuando se requiere ADN de alta calidad o bien se
trata de organismos de cierto grado de complejidad como
en plantas que naturalmente producen gran cantidad de
compuestos secundarios. Algunos paquetes comerciales de
alto rendimiento son:

• PURIGEN
• QUIAGEN
• MILIPORE
• GENTRA
• MoBio

60
A la hora de escoger que método de extracción de ADN
utilizar se tienen en cuenta varios factores:

1. La cantidad de muestra de la que se dispone para

extraer el ADN.
2. El tipo de muestra o fuente de la que se quiere
obtener el ADN (planta, animal, bacteria)
3. La pureza con la que se quiere obtener el ADN
extraído.
4. El tiempo que consume cada método, su costo y el
rendimiento esperado.
5. Uso que se le va a dar al ADN extraído.
61
Que traen esos kits ?
Generalmente lo siguiente:
1. CTAB 2% (hexadecyltrimethylammonium bromide) =
detergente
2. EDTA 20 pH8 (agente quelante o secuestrante) =
desestabiliza la membrana celular e inhibe a las ADNasas
3. NaCl = recubre al ADN evitando su degradación
4. Tris-HCl 100 pH8 = estabiliza la solución (tampón)
5. b-mercaptoetanol 0.3% = inhibe otras proteínas
6. Proteinasa K 0.1% mg/ml = degrada proteínas y enzimas

62
Como se obtiene el ADN ?
 El ADN se obtiene a través de una serie de pasos
consecutivos (ver archivo adjunto). Que se resumen
básicamente en 3 pasos:

1. Lisis celular (ruptura de tejidos + ruptura de membranas

celulares)
2. Eliminación de proteínas (inhibición de enzimas)
3. Precipitación y limpieza del ADN (extracción de
contaminantes)

 Así, la extracción de ADN combina procesos químicos, físicos

y mecánicos
63
 1. Lisis celular de los tejidos, las
células quedaran separadas
(individuales)

2. Ruptura de la membrana
celular y nuclear, el ADN
conjuntamente con otros
organelos citoplasmáticos
están libres (sueltos)

3. Captura del ADN (precipitación y

limpieza del ADN)
64
65
66
Como puede concluir el procedimiento
de extracción de ADN ?
1. No hay ADN

2. El ADN aparece como cortado

(muy fragmentado), lo cual es una
indicación de degradación por
diferentes razones.

3. El ADN aparece como finos hilos

blanquecinos (buena calidad de
ADN) o como hilos pardos (oxidado
por contaminantes = compuestos
fenólicos) 67
Y ahora que ?
 El ADN que acabamos de obtener es muy poco
(mayormente menos de 10 ul) y debemos hacer muchos
experimentos, en promedio se gasta de 100 a 800 ul,
entonces que hacemos?

 Replicar (hacer muchas copias) de este poco ADN, es decir

hacer copias de los segmentos de ADN obtenidos (hilos finos
blanquecinos)

 La replicación es a través del proceso de PCR (Reacción en

Cadena de la Polimerasa), esto será la próxima clase.

68
CLASE
4

PCR
(Polymerase Chain Reaction)
Reacción en Cadena de la
Polimerasa

Ing. MSc. Joel E. odicio Guevara

69
Recordemos : ¿Que es la replicación
del ADN?
S = síntesis, donde la célula duplica (replica) su ADN, es decir de una
cromatida a dos cromatidas, dando la forma de X al cromosoma

Esto es un proceso natural, la PCR hará lo mismo In Vitro no para todo

el genoma, sino solo para segmentos específicos de ADN

Ciclo celular 70
Que es la PCR ?
 Es el procedimiento In Vitro para la obtención de muchas copias
de segmentos de ADN.

 Se realiza la amplificación de un segmento específico de ADN,

teniendo poco material disponible, (pocos microlitros (ul)).

 Este segmento especifico es un gen de interés o simplemente se

desea saber cuantas veces se repite ese segmento en el genoma
y a partir de allí determinar la diversidad genética. Ejemplo:
tenemos 2 arboles de caoba, en uno el segmento (AGAGAG) se
repite 100 veces en todo su genoma, y en el otro solo 10 veces,
entonces el primer individuo es mas diverso para ese segmento
(en función a ese segmento)

71
Que necesitamos para realizar una
PCR?
 Entre otras cosas lo mas importante es tener el ADN molde (lo que
obtuvimos de la extracción del ADN).
 Las demás cosas lo comprenden REACTIVOS Y UNA MAQUINA que en
conjunto cumplen la misma función de los “personajes” que
intervienen en el proceso natural de replicación del ADN, estos son:
La TOPO Isomerasa (rompe y desenrolla el ADN)
Helicasas (mantienen abiertas y sigue
desenrollando)
El ADN polimerasa III (lee y replica)
Los nucleótidos (A,T,C,G)
Cebadores-iniciadores-primers (inician la lectura)

72
 KIT PCR
 Al igual que en la extracción de ADN, existen KITs que se usan en
el proceso de PCR, los reactivos que traen son:

 Todos los KITs de PCR traen estos mismos reactivos, el nombre de

un KIT comercial es PCR CORE I Kit (Promega, UK)
73
Que son estos componentes
(reactivos) ?
 MgCl2 = actúan como cofactores de la ADN polimerasa
(cofactor= componente no proteico, termoestable necesaria para la acción de una
enzima)
 Green GoTaq® Flexi Buffer = una solución tampón/buffer,
para el funcionamiento de la ADN polimerasa
 Desoxirribonucleotidos trifosfatos dNTP = sustratos para
polimerizar (adicionar) el ADN, estos son: dATP, dGTP, dCTP,
dTTP, de estos se obtendrá la A, G, C y la T respectivamente.
 2 primers (el que va hacia adelante y el que va hacia atrás) =
Son secuencias cortas de nucleótidos (±20 unidades),
complementarias a una región del ADN que se quiere
amplificar
 GoTaq® DNA Polymerase = la ADN polimerasa (enzima capaz
de replicar/trancribir ácidos nucleicos, ADN y ARN)
Taq=Thermus aquaticus, bacteria de la cual aíslan esta
enzima, capaz de soportar altas temperaturas sin
degradarse.
74
Y la famosa maquina que hace la magia
de la polimerización es el
TERMOCICLADOR

Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de

75
Los primers-cebadores-iniciadores
 Secuencia de nucleótidos complementaria que se
anclan a la secuencia de ADN que se desea amplificar
 Los primers se sintetizan químicamente a gusto del
usuario o se utilizan juegos disponibles comercialmente.
 Como los primers son cortos (±20 nucleótidos) es muy
probable que encuentren varios lugares
complementarios en un genoma. La variación en el
numero de repeticiones crea nuevos alelos
 Así, los productos de amplificación solo depende de la
combinación del primer y del ADN molde (lo que
obtuvimos de la extracción)

76
2 primers (el que va hacia adelante y el que va hacia atrás)
con 21 nucleótidos cada uno, ambos al igual que la ADN
Polimerasa III solo pueden leer de 5´ a 3´

77
Los desoxinucleótidos (dNTPs)
• Laboratorios
especializados sintetizan
químicamente estos
nucleótidos.

• Estos son la materia prima

para polimerizar
(transcribir/replicar)

• Su concentración afecta la
especificidad y fidelidad de
la reacción

• Concentraciones altas:
disminuye fidelidad de
polimerasa y puede inhibir
su actividad. 78
El ADN taq Polimerasa (taq pol)
• Enzima que se une con alta afinidad al ADN
• Debe ser resistente a altas temperaturas:
hasta 95°C
• Existen varias: la más usada es la Taq
obtenida de la bacteria Thermophilus
aquaticus (enzima termoestable)
• Actividad exonucleasa 5´ 3´
• Necesita de primer o cebador para empezar
la reacción
• Necesita de cofactores (MgCl2, Mg2+).
79
Cuales son los pasos en la PCR?
1. Desnaturalización de 94°C a 95°C

2. Apareamiento (anclaje de primers) de 35°C a 60°C

3. Extensión (elongación, polimerización o síntesis) de

70°C a 80°C

Estos pasos se repiten consecutivamente 1+2+3 = 1 ciclo,

se pueden realizar hasta 40 ciclos continuos.
80
Antes que suceda estos 3 pasos se debe:

81
Desnaturalización
 Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla
en hebra sencilla.
 Rotura de puentes de H que unen desoxinucleótidos
 Típicamente se usa una temperatura de 94˚C - 95˚C, por
30s a 3min (el tiempo depende del tamaño del genoma)

82
Apareamiento
 Los primers previamente diseñados, reaccionan con la
hebra sencilla de ADN y se pegan en lugares específicos
(secuencias target) por complementariedad de bases.
Para esto, se baja la temperatura ej: 55˚C por 30
segundos-.
 La temperatura y el tiempo puede variar entre primers
según sea el caso.

83
Extensión
 Una Polimerasa de ADN (taq pol) extiende/polimeriza los
primers colocando dexosirribonucleotidos trifosfatados
(dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el ADN de 3’a 5’. De estas forma
sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de ADN
molde

 La temperatura y el tiempo de síntesis depende del tamaño de

la secuencia target a replicar, este se mide en par de bases (pb)
o en kilobase (Kp) = 1000 pb

84
Entonces en resumen mas o menos es esto:

85
Cuantos ciclos se deben realizar?
se deben realizar hasta 40
ciclos, en mayor cantidad de
ciclos pasara lo siguiente

• Degradación de reactivos
• Inactivación de la enzima
• Agotamiento de reactivos

86
Y ahora que?
 Después que el termociclador haya terminado los ciclos
(entre 30 a 40, dependiendo de la programación), se sacan
los microtubetes (donde se mezclo todos los reactivos +
ADN molde). Y ahora?

 En estos microtubetes solo seguiremos viendo un liquido (la

solución), donde se supone que el fragmento de interés
(secuencia target) se ha multiplicado muchas veces (mas de
100 millones de veces).

 Estos segmentos de ADN serán visualizados después de

realizar una ELECTROFORESIS, (esto lo veremos la siguiente
clase)

87
CLASE 5

Marcador Molecular :

AFLP
Amplified Fragment Length Polymorphism
(Polimorfismos de Longitud de los Fragmentos Amplificados)

Ing. MSc. Joel E. Odicio Guevara

88
Recordemos… que son los MM?
 Son secuencias identificables de ADN, encontradas en un lugar
especifico del genoma y transmitidos de una generación a otra.

 Nos permite estudiar un carácter (Fenotipo) o gen (Genotipo)

asociado a este, y este es de herencia mendeliana.

 Se utilizan para localizar y aislar genes de interés, a partir de allí

estiman la diversidad genética.

 Los diferentes tipos de MMse distinguen por su capacidad de

detectar polimorfismos en loci únicos o múltiples y son de tipo
DOMINANTE o CO-DOMINANTE.

89
Donde estamos?

Con los marcadores dominantes, a los

heterocigotos solo se les observa con una sola
banda por locus, en los codominantes llevaran
2 bandas.
90
Que es AFLP?
 Es un marcador molecular de tipo dominante, es decir solo puede
identificar individuos homocigotos (AA, aa).

 Son fragmentos de ADN que han sido amplificados (x PCR)

usando primers dirigidos a partir de la digestión (cortes
específicos-restriccion) del ADN.

 Está basada en la amplificación selectiva de los fragmentos de

restricción mediante la PCR

 Es una técnica que combina la digestión de dos enzimas de

restricción, generalmente Mse I que reconoce y corta 4 pb y EcoR
I que reconoce y corta 6 pb dentro de una secuencia de ADN.

91
Como se detectan los polimorfismos
con AFLP?
 En AFLP los polimorfismos son detectados desde las diferencias
en longitud (en par de bases) de los segmentos amplificados,
vistos en el gel de agarosa, después de la corrida electroforética.

 Esta tecnología detecta polimorfismos causados por cambios en

los sitios de restricción o en sus regiones adyacentes

 Estos segmentos de diferentes tamaños (polimorfismo), son

analizados en la forma de presencia (1) o ausencia (0), estos
números son anotados en una plantilla Excel y son introducidos a
un programa (Software) especializado (Genepop, Darwin, Cervus
etc)

92
Cuales son los pasos en AFLP?
1. Extracción de ADN
2. Digestión (corte de segmentos de ADN con enzimas)
3. Ligación del adaptador (pegado de secuencias
bicatenarias. Después estos servirán como primers)
4. PCR 1- Pre amplificación (Se añade un nucleótido a los
primers para que la amplificación sea mas especifica)
5. PCR 2- Amplificación (se añade 2-3 nucleótidos mas, para
hacerla aun mas especifica, así limitar el nivel del
polimorfismo, sino nos complicaríamos con tantos
fragmentos)
6. Electroforesis

93
Esto sucede en cada paso:

94
Al ADN lo cortamos con enzimas:

95
96
Este es el genoma, las
flechitas amarillas son las
enzimas que reconocen y
cortan pequeños
segmentos de ADN (de 2
a 6 bp). Estos pequeños
segmentos están
distribuidos en todo el
genoma unos mas juntos
que otros, como
resultado se ampliaran
segmentos (líneas
celestes) de diferentes
tamaños

97
Los segmentos de diferente
tamaños son visibles en el gel de
agarosa después de una corrida
electroforética.

Los segmentos mas grandes

estarán al inicio de la corrida y
los mas pequeños al final.

Es lo mismo que sucede con un

colador o zaranda, los grandes
se quedan y los chiquitos se
caen. A partir de aquí es cuando
nos referimos a la Dominancia o
codominancia del marcador, asi:

98
Ventajas
 No necesita ninguna información previa de la secuencia de
ADN
 Es rica en información debido a su habilidad de analizar
simultáneamente gran numero de loci polimórficos
(segemntos de ADN) con una sola combinación de primers.
 Elevado numero de bandas obtenidas
 Los AFLP permiten una exploración rápida de los
polimorfismos del genoma entero.
 Puesto que se genera un gran número de bandas, cada
marcador da una huella identificadora de ADN sumamente
informativa

99
Desventajas
 Nivel de información limitada debido a su naturaleza
dominante

 Requieren bastante técnica en el laboratorio y

especialmente en el análisis de los datos

 Implica un costo adicional por la compra de enzimas de

restricción y ligación, así como de adaptadores

100
Entonces… Para que sirve el AFLP?
1. Para la evaluación de diversidad genética
2. Para el análisis de distancia genética
3. Para identificar huellas identificadoras de ADN

101
ALGUNOS EJEMPLOS DE SU UTILIDAD

102
103