Determinación de los efectos de fármacos eficaces

antiparasitarios sobre la viabilidad de aislados de

Blastocystis mediante ensayo de MTT
Resumen
Blastocystis spp., Un protozoo parásito es común en todo el mundo. El metronidazol se ha usado
comúnmente en el tratamiento de la Blastocistosis. Recientemente se informó que el tratamiento
con metronidazol falló en algunos pacientes. Por lo tanto, este hallazgo estaría relacionado con la
resistencia al metronidazol. Este estudio tiene como objetivo investigar la viabilidad de
Blastocystis spp. después del tratamiento con ornidazol, ciprofloxacina y trimetroprim-
sulfametoxazol (TMP-SMX) y metronidazol. La viabilidad del parásito se midió usando el ensayo
MTT (Cell Proliferation Kit MTT, Roche, EE. UU.). Muestras de heces de tres casos donde
Blastocystis spp. (A, B, C) se habían detectado en los exámenes de lugol nativo se incubaron en
medio de cultivo. Luego, los parásitos se transfirieron a un medio nuevo que contenía antibióticos
y anti fúngicos. Se utilizaron medios de cultivo microbiológicos para verificar la contaminación
bacteriana. En una micro placa de 96 pocillos, se prepararon diluciones seriadas de fármacos y se
agregaron parásitos en los pocillos. El comportamiento de resistencia de cada cepa se diferenció.
Mientras que la ciprofloxacina fue el fármaco antiparasitario más potente sobre la viabilidad de la
cepa A, TMP-SMX y ornidazol fueron altamente efectivos en la cepa C. La viabilidad de la cepa B no
se vio afectada por la concentración de los fármacos. Concluimos que se necesitaba una prueba de
sensibilidad estandarizada para fármacos antiparasitarios para el tratamiento eficaz de la
Blastocistosis.
Introducción
Blastocystis spp. Es un parásito protozoario entérico de muchos animales y humanos. Es un efecto
zoonótico común en todo el mundo. En los países desarrollados, la incidencia es de entre 1.5 y
10%, mientras que los países subdesarrollados o en desarrollo esta proporción pueden llegar a
50%. Las especies de Blastocystis, los protozoos aislados más frecuentemente, causan síntomas
gastrointestinales, como diarrea acuosa o mucosa, dolor abdominal, náuseas, calambres y gases,
aunque se discute su patogenia.
La presencia de diferentes formas y tamaños morfológicos de especies de Blastocystis causa
dificultades en la identificación, especialmente en heces. Examen microscópico de luz y
fluorescencia, cultivo y métodos moleculares se utilizan en el diagnóstico de infección por
blastocistosis.
El metronidazol es un fármaco quimioterapéutico de amplio espectro con efectos antibacterianos
y anti protozoarios. En el tratamiento de la infección por blastocistosis, el metronidazol es también
el primer fármaco de elección. En los últimos años, se informó que algunos casos de tratamiento
con metronidazol fracasan. Para las especies de Blastocystis, la falta de una prueba de
susceptibilidad antiparasitaria estándar, como la prueba de susceptibilidad a antibióticos, plantea
un desafío para los médicos en la planificación del tratamiento. Existen pocos estudios sobre la
susceptibilidad a los medicamentos antiparasitarios in vitro de Blastocystis spp. Los efectos de
furazolidona, ketoconazol, metronidazol, ornidazol, quinacrina, tinidazol, TMP-SMX,
entereviaforma y cotrimoxazol se investigaron in vitro en Blastocystis aislado, el único estudio
xenogénico en nuestro país. En diferentes concentraciones de drogas, el efecto en diferentes días
se controló mediante el recuento de parásitos. La prueba de sensibilidad a los medicamentos
antiparasitarios hecha de esta manera requiere mucho trabajo y consume mucho tiempo. (2-
metoxi-4-nitro-5-sulfofenil) -2H-tetrazolio-5-carboxanilida (XTT), que es una sal de tetrazolio y
resazurina reducida por la reacción redox resultante de la actividad metabólica intracelular usando
cepas axénicas, En un estudio, los niveles de vitalidad de los protozoos se determinaron mediante
un método colorimétrico basado en la determinación de la respuesta con indicador de color. Se
determinó que los cambios de color con resazurin son más prominentes que el compuesto XTT. Se
ha sugerido que este método aplicado en micro placas está optimizado y puede usarse como una
prueba de susceptibilidad antiparasitaria.
En nuestro estudio evaluó el efecto de la 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-dimetilpiperazina basada en
reduccion sobre la viabilidad de tres aislamientos diferentes de Blastocystis (A, B, C), ornidazol,
ciprofloxacina y trimetoprim-sulfametoxazol (TMP- test de bromuro de difeniltetrazolio) (MTT).
Materiales y Métodos
El examen de preparación de lugol nativo en microscopio óptico reveló Blastocystis spp. (A, B, C)
se incubaron durante 3 días a 37 ° C en una solución de Ringer que contenía 10% de suero de
caballo y asparagina al 0.05%. Después de la incubación, las células del parásito contaminadas con
bacterias se intensificaron con gradiente de Ficoll y la solución de Ringer que contenía antibióticos
y antimicóticos se dejó incubar nuevamente en el ambiente de incubación.
Al día siguiente, se usaron 0.1 ml de la suspensión de cultivo para determinar si las bacterias
estaban presentes o no, y se sembraron agar sangriento de oveja y medio de azul de metileno
eosina en los días 24 y 48. Los medios a las horas fueron examinados. La cantidad de células del
parásito en las laminillas del thoma se contó después del control reproductivo.
Para la prueba de viabilidad, se usaron diluciones de diez concentraciones stock (metronidazol 6
μg / ml, ornidazol 8 μg / ml, ciprofloxacina 80 μg / ml, TMP / SMX 2 μg / ml), teniendo en cuenta
las concentraciones efectivas de los fármacos en el suero.
Se usaron tres pozos en micro placas de 96 pocillos para cada concentración. Se añadieron 5x103
parásitos a cada pocillo y la mezcla se dispensó con diluciones de fármaco y se incubó a 37ºC
durante 24 horas con dióxido de carbono. Se usaron pocillos que contenían células de Blastocystis
sin fármaco. El nivel de viabilidad se determinó mediante la prueba MTT (Cell Proliferation Kit,
MTT, Roche, EE. UU.) Y el protocolo del fabricante en la dirección de la recomendación del
fabricante. La absorbancia de la enzima reductasa en las mitocondrias de las células vivas y el
cambio de color causado por la reducción del compuesto de MTT amarillo al formazano púrpura
se midió a 500 y 600 nm en el espectrofotómetro y se determinaron las velocidades de viabilidad
de las cepas.
Resultados

En las 24 y 48 horas de la primera etapa de nuestro estudio, no se observó crecimiento microbiano

en los medios microbiológicos (Fig. 1).
 Fig 1. Número de ufc / ml de
bacterias en medio
microbiológico en 24 y 48 h de
axenización

Una vez que los aislamientos utilizados en nuestro estudio han sido identificados como
aculturados, las sensibilidades de estas cepas se han intensificado. Se investigó el efecto de las
diluciones de fármacos sobre la supervivencia de las cepas obtenidas por diluciones de diez
concentraciones de stock preparadas tomando en consideración concentraciones séricas efectivas
de fármacos mediante el método MTT. Se encontraron tres cepas diferentes de las cepas
susceptibles de las especies Blastocystis con diferentes perfiles de susceptibilidad (Fig. 2). Una
cepa de ciprofloxacina y cepas C fueron las más susceptibles a TMP-SMX y ornidazol,
respectivamente, mientras que la cepa B resultó ser resistente a todos los fármacos utilizados.
Fig. 2. El% de viabilidad de los aislados A, B, C en diferentes diluciones de metronidazol, ornidazol, ciprofloxacina y TMP-
SMX.

Discusiones y Conclusiones

El inicio de la resistencia al metronidazol, la primera opción en el tratamiento de la blastocistosis,

ha llevado a la necesidad de diferentes opciones de tratamiento. Se observó TMP-SMX
clínicamente en el tratamiento de los pacientes a ser respuestas similares a la eficacia terapéutica
de metronidazol. Además de las aplicaciones in vivo, pocos estudios estaban disponibles para
evaluar la eficacia del fármaco in vitro. Así como diversos extractos de plantas tipos Blastocystis en
son los temas de interés de los investigadores para investigar los efectos de los que se utilizan
métodos para visualizar el número de parásitos de los efectos de las drogas en tiempo de
ejecución está consumiendo y requiere mucho trabajo, muchos se opone a su aplicabilidad como
una prueba de rutina. Las cepas de uso sin su aceleradores, efecto anti-parasitario de la adición al
efecto antibacteriano de los medicamentos mediante la eliminación de la fuente de alimento de la
interferencia debida a matar a las bacterias en el medio ambiente, lo que sugiere el desarrollo de
la hipótesis de la muerte del parásito indirectamente. Una vez más, esta fuente en respuesta a la
insuficiencia de las bacterias de la flora normal de la terapia con metronidazol para la hipótesis de
que debido de inactivar al fármaco, (Figura 1) después de un estudio hecho solamente se añadió a
la presencia de células parasitaria y después se determinó que la alta tasa de supervivencia contra
las drogas de las tres cepas (Figura 2). Por esta razón, la hipótesis de que los parásitos no se
destruyen debido a la ausencia de drogas en el medio ambiente después de la inactivación de la
droga por la flora bacteriana no ha sido respaldada por nuestros hallazgos. Con el fin de
determinar la susceptibilidad a los medicamentos antiparasitarios, es importante que se
produzcan ambos métodos de acción de alto volumen y que la axonización se debe realizar para
permitir que el medicamento se investigue directamente sobre el parásito.

Ok et al. Informó que no podían erradicar los parásitos en el 5.6% de los pacientes con
blastocistosis tratados con TMP-SMX. Moghaddam et al. Metronidazol y las opciones de TMP-
SMX, se determinó que el 33,3% de los pacientes con síntomas parasitarios muy altos y síntomas
clínicos graves no respondieron al tratamiento con metronidazol y el 22,2% no respondieron al
tratamiento con TMP-SMX. Los estudios han demostrado que la erradicación de parásitos en el
tratamiento de metronidazol es tan amplia como 0-100%, y aunque TMP-SMX se ha utilizado con
más frecuencia como una opción alternativa a pesar de que no puede proporcionar una cura
completa. En un caso en el que el parásito no pudo ser erradicado mediante el tratamiento con
TMP-SMX, se proporcionó la erradicación parasitaria después de administrarle metronidazol al
paciente.

También hay estudios in vitro en los que se investiga la susceptibilidad de las especies de
Blastocystis a diversos fármacos. Hamamcı et al. Investigaron las sensibilidades de los fármacos al
determinar el número de células del parásito a diferentes concentraciones de ornidazol,
metronidazol, azitromicina, itraconazol y TMP-SMX en días diferentes sin afectar los aislamientos
de Blastocystis producidos en el caldo de Robinson. El fármaco más efectivo es el ornidazol y se ha
observado que el metronidazol, azitromicina, itraconazol y TMP-SMX lo siguen.

Yakoob et al. In vitro, la furazolidona determinó que un 40% de metronidazol al 32% y

ciprofloxacina al 100% no fueron efectivos contra las cepas de Blastocystis. Mirza et al. Blastocystis
spp. al evaluar los efectos de diferentes medicamentos en sus cepas; ornidazol, nitazoxadina,
furazolidona, mefloquina, quinacrina, quinina, cotrimoxazol, yodoacetamida y cloroquina,
doxiciclina, paromicina, ampicilina y pirimetamina resultaron ineficaces. Además, este estudio
también destacó las diferencias en los perfiles de resistencia entre las cepas.

También se encontró que las tasas de viabilidad de las tres cepas utilizadas en nuestro estudio
fueron diferentes. Mientras que la ciprofloxacina fue el fármaco más eficaz para la supervivencia
de la cepa A, se encontró que el efecto de TMP-SMX y ornidazol en la cepa C era alto. Si bien la
viabilidad de la cepa B no se vio afectada por las concentraciones de fármaco utilizadas (Figura 2).
Se necesita un método estándar para detectar la sensibilidad al fármaco antiparasitario de
Blastocystis spp. Este requisito es importante en términos de obtención de datos epidemiológicos
sobre el desarrollo de resistencia mediante la comparación de perfiles de susceptibilidad de cepas
aisladas. Sin embargo, el método de minicultivo que hemos descrito en nuestro estudio anterior
para el aislamiento de Blastocystis folicular permite la evaluación de la uremia en el segundo día
posterior a la cultura, así como la necesidad de un menor número de hombres al mismo tiempo y
pruebas de sensibilidad en términos prácticos.

Teniendo en cuenta que habrá cinco días para determinar la sensibilidad del fármaco mediante la
prueba de MTT utilizando un método de minicultivo, se necesitan métodos que puedan
determinar la resistencia más rápidamente en la aplicación de rutina para no retrasar el
tratamiento del paciente. Aún no se ha identificado un gen de resistencia para metronidazol que
esté asociado con Blastocystis spp. El trabajo futuro en esta dirección asegurará que las fallas de
tratamiento se resuelvan en un tiempo más corto.

Debe tenerse en cuenta que los fármacos utilizados en el tratamiento de la infección por
Blastocystis pueden tener diferentes sensibilidades de las cepas activas. Se considera importante
desarrollar pruebas rápidas y estandarizadas para la determinación de la sensibilidad a los
medicamentos antiparasitarios para que se pueda realizar un tratamiento eficaz.