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RESUMEN
ABSTRACT
1
Servicio Nacional de Sanidad Agraria – SENASA, Perú
2
Unidad de Biología y Genética Molecular, Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional
Mayor de San Marcos, Lima
3
CONOPA – Instituto de Investigación y Desarrollo de Camélidos Sudamericanos, Perú
4
E-mail: lenin.maturrano@gmail.com
272
Genotipificación de Clostridium perfringens de alpacas con enterotoxemia
toxins, respectively. A total of 47 C. perfringens isolates were obtained from the small
intestine of neonatal alpaca mortalities which presented clinical signs, as well as gross
and histological injuries typical of enterotoxemia. The results showed that 46/47 (97.9%)
of the isolates were genotype A, 13 of these 46 (28.3%) also had cpb2 (genotype A,
subtype cpe-cpb2+), while the remaining 33 (71.3%) were negative for both cpe and cpb2
genes (genotype A, subtype cpe-cpb2 -) and only 1/47 (2.1%) had the cpa, cpb y cpe
genes (genotype C, subtype cpe+cpb2-). The results indicate that both the alpha and
beta2 toxins likely play an important role in enterotoxemia aetiology, but excluded
participation of the enterotoxin.
Cepas de referencia cpa cpb etx iap Genotipo cpe cpb2 Subtipo
C. perfringens tipo A - -
+ - - - A - - cpe cpb2
(CECT 563)
C. perfringens tipo C
+ + - - C - - cpe -cpb2-
(CECT 820)
C. chauvoei - - - - _ - - _
C. septicum - - - - _ - - _
al. (1999). La subtipificación se realizó de- Los resultados obtenidos por la PCR
tectando la presencia de los genes cpe y cpb2, múltiple de las cepas de referencia de C.
según lo descrito por Garmory et al. (2000). perfringens tipo A y C amplificaron genes
correspondieron a los tipos A y C, respecti-
vamente, mientras que las cepas de C.
RESULTADOS chauvoei y C. septicum no evidenciaron
amplicones similares (Cuadro 1). La ampli-
Se logró aislar C. perfringens en las ficación genética determinó que el 97.9%
47 muestras intestinales de crías muertas por (46/47) de los aislamientos de C.
enterotoxemia. Todos los aislados fueron po- perfringens fueron del genotipo A y el res-
sitivos a la tinción Gram, presentaron una tante (2.1%) correspondió al genotipo C. El
doble hemólisis, fueron catalasa negativa y, 71.7% (33/46) de los aislamientos de C.
mayoritariamente (42/47), fueron positivas a perfringens con genotipo A que no tenían
la Reacción de Nagler. los genes secundarios cpe y β2 correspon-
dieron al subtipo cpe-vocpb2-vo y el 28.3% (13/ enterotoxina o toxina β2, mientras que los 13
46) restante correspondió al subtipo cpe- restantes correspondieron al subtipo cpe-
vo
cpb2+vo (presencia del gen cpb2). El único vo
cpb2+vo, con sólo la capacidad de producir
C. perfringens genotipo C aislado presentó la toxina β2.
el gen de la enterotoxina (subtipo cpe+vocpb2-
vo
) (Cuadro 2). En ninguno de los 46/47 aislados se lo-
gró amplificar el gen cpe productor de
enterotoxina, sugiriendo que la enterotoxina
DISCUSIÓN de C. perfringens no participaría en el desa-
rrollo de la enterotoxemia de las alpacas.
La técnica de PCR múltiple permitió la Estos resultados son similares a otros estu-
geno y subtipificación de los 47 aislados de dios donde no se detectó la presencia del gen
C. perfringens obtenidos de casos confir- cpe en aislamientos de C. perfringens pro-
mados de enterotoxemia en neonatos de venientes de alpacas con problemas entéricos
alpacas, evidenciando ser una herramienta de (Garmory et al., 2000; Bueschel et al., 2003;
diagnóstico rápida y confiable (Petit et al., Baums et al., 2004; Ellis, 2006), e incluso
1999; Baums et al., 2004), contrastando con asociados a casos de muertes súbitas
el método de tipificación clásico de la prueba (Sawires y Songer, 2006). La ausencia del
de seroneutralización in vivo, basada en la gen cpe también ha sido demostrado en re-
letalidad de ratones o por dermato-necrosis portes de casos de enterotoxemia de terne-
en cobayos. Estas ventajas han permitido a ros, cabras, venados y corderos (Manteca et
la PCR múltiple ser empleada en forma al., 2002; Dray, 2004; Embury-Hyatt et al.,
exitosa en este estudio y por otros investiga- 2005; Kalender et al., 2005), así como en
dores interesados en elucidar la participación cuadros descritos como disentería
de las toxinas de C. perfringens en proce- hemorrágica en corderos (Gkiourtzidis et al.,
sos entéricos en lechones (Kanakaraj et al., 2001), enteritis necrótica en pollos (Engstrom
1998; Garmory et al., 2000; Waters et al., et al., 2003; Gholamiandekhordi et al., 2005),
2003), enteritis necrótica en pollos (Engstrom enteritis necrótica en lechones (Kanakaraj et
et al., 2003; Gholamiandekhordi et al., 2005), al., 1998; Garmory et al., 2000, Waters et
enterotoxemia en corderos (Gkiourtzidis et al., al., 2003) y tiflocolítis en caballos (Herholz
2001; Kalender et al., 2005), enterotoxemia et al., 1999). La ausencia del gen cpe llama
en ciervos (Embury-Hyatt et al., 2005), enormemente la atención, pues la enteroto-
tiflocolitis en caballos (Herholz et al., 1999) xina fue siempre considerada como el princi-
y en intoxicación de origen alimentaria en hu- pal factor de virulencia del C. perfringens
manos y diarreas asociadas a antibióticos en en la patogénesis de la enterotoxemia en las
humanos (Sparks et al., 2001). alpacas (Ramírez, 1987), pese a que no se
descartaron en dichos estudios la presencia
El 97.9% de los aislamientos correspon- de otras toxinas (toxinas y β2).
dieron al genotipo A, concordando con otros
resultados (Moro, 1987; Ramírez, 1987), quie- Por otro lado, el efecto patogénico de la
nes mediante la seroneutralización determi- enterotoxina no encaja con los cuadros de
naron al tipo A del C. perfringens como el enterotoxemia descritos en alpacas, pues la
principal agente causal de la enterotoxemia producción de esta toxina está frecuentemente
en alpacas. Los aislados pertenecientes al asociada a problemas de intoxicación
genotipo A y de acuerdo a la presencia de alimentaria que ocasionan diarreas profusas,
genes secundarios fueron agrupados en esporádicas y autolimitantes en individuos
subtipos, siguiendo la clasificación propuesta inmunocompetentes (McClane, 2000; Sparks
por Garmory et al. (2000), determinando que et al., 2001). Los casos clásicos de
el 71.7% fueron del subtipo cpe-vocpb2-vo, es enterotoxemia en alpacas raramente se ob-
decir, cepas incapaces de producir servan o se asocian con diarreas y cuando
17. Kanakaraj R, Harris DL, Songer JG, rumiantes menores. INIPA y SR-CRSP.
Bosworth B. 1998. Multiplex PCR Reporte Técnico N.º 63. Lima. 17 p.
assay for detection of Clostridium 25. Ramírez A. 1987. Alpaca Clostridium
perfringens in feces and intestinal perfringens type A enterotoxemia:
contents of pigs and swine feed. Vet Purification and assays of the
Microbiol 63: 29-38. enterotoxin. PhD Thesis. USA: Colora-
18. Manteca C, Daube G, Jauniaux T, do State University. 201 p.
Linden A, Pirson V, Detilleux J, Ginter 26. Sawires SY, Songer JG. 2006.
A, et al. 2002. A role for the Clostridium perfringens: Insight into
Clostridium perfringens β2 toxin in virulence evolution and population
bovine enterotoxaemia? Vet Microbiol structure. Anaerobe 12: 23-43.
86: 191-202. 27. Songer JG, Meer RR. 1996.
19. McClane BA. 2000. Clostridium Genotyping of Clostridium perfringens
perfringens enterotoxin and intestinal
by polymerase chain reaction is a useful
tight junctions. Trends Microbiol 8: 145-
adjunct to diagnosis of clostridial enteric
146.
disease in animals. Anaerobe 2: 197-203.
20. Moro M. 1966. Enfermedades infeccio-
28. Songer JG. 1996. Clostridial enteric
sas de las alpacas. Enterotoxemia, dia-
diseases of domestic animals. Clin
rrea bacilar producida por el Clostridium
welchii tipo A. Rev Fac Med Vet, Microbiol Rev 9: 216-234.
UNMSM.18-20: 85-87. 29. Sparks SG, Carman RJ, Sarker MR,
21. Palacios C. 2004. Caracterización McClane BA. 2001. Genotyping of
anatomopatológica de enteropatías cau- enterotoxigenic Clostridium perfrin-
santes de mortalidad en crías de alpaca. gens fecal isolates associated with
Tesis de Médico Veterinario. Lima: Fa- antibiotic-associated diarrhea and food
cultad de Medicina Veterinaria, Univ poisoning in North America. J Clin
Nacional Mayor de San Marcos. 164 p. Microbiol 39: 883-888.
22. Petit L, Gibert M, Popoff M. 1999. 30. Waters M, Savoie A, Garmory HS,
Clostridium perfringens: toxinotype Bueschel D, Popoff MR, Songer JG,
and genotype. Trends Microbiol 7: 104- Titball RW, et al. 2003. Genotyping and
110. phenotyping of beta2-toxigenic Clostri-
23. Prehn N, Saez S, Arraigada M. 1999. dium perfringens fecal isolates
Estudios microbiológicos y clínicos de associated with gastrointestinal disease
enterotoxemia por Clostridium in piglets. J Clin Microbiol 41: 3584-3591.
perfringens en camélidos sudamerica- 31. Yoo HS, Lee SU, Park KY, Park YH.
nos. II Cong. Mundial sobre Camélidos. 1997. Molecular typing and epidemio-
Cusco, Perú. p 140. logical survey of prevalence of
24. Ramírez A, Huamán D, Ellis RP. 1985. Clostridium perfringens types by
Enterotoxemia de la alpaca. Programa multiplex PCR. J Clin Microbiol 35: 228-
colaborativo de apoyo a la investigación en 232.