Técnicas de Biologia Molecular

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 Técnicas de Biologia Molecular

Unidade - Técnicas de Biologia Molecular

MATERIAL TEÓRICO

Responsável pelo Conteúdo:

Prof. Dr. Evandro Luís de Oliveira Niero
Revisão Textual:
Profa. Esp. Márcia Ota.

Campus Virtual Universidade Cruzeiro do Sul | www.cruzeirodovirtual.com.br

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1. PCR

1.1 O que é PCR?

Uma das técnicas mais utilizadas em Biologia Molecular é a

Reação em Cadeia da Polimerase (Polymerase Chain Reaction - PCR),
que consiste em uma amplificação de DNA sem uso de um organismo
vivo. O PCR é utilizado em laboratórios de pesquisa e de análises clínicas
para diversas finalidades, como por exemplo: testes de paternidade,
diagnósticos de doenças hereditárias, biologia forense, clonagem,
construção de organismos geneticamente modificados, construção de
árvores filogenéticas, dentre outros.

A técnica de PCR foi realizada pela primeira vez na Califórnia em

Abril de 1983 por Kary Mullis (Figura 01). A este pesquisador em 1993 foi
atribuído o Prêmio Nobel de Química pelo seu trabalho.

Figura 01 – Imagens mostrando Kary Mullis, o pesquisador que descreveu a técnica de PCR.
Fonte: http://www.karymullis.com/pcr.shtml

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A técnica de PCR encontra sua principal aplicação quando a

quantidade de DNA disponível é reduzida. O PCR é basicamente uma
reação de duplicação do DNA realizada in vitro. Vamos supor uma
situação em que um pesquisador resolve estudar o gene A (gene
hipotético) presente no DNA plasmidial de uma bactéria. Para estudar
esse gene, o pesquisador precisa extrair o DNA plasmidial dessa bactéria,
separar o gene que ele deseja trabalhar e depois realizar os experimentos
in vitro. Como ele conseguiria isso?

Primeiramente as bactérias devem ser cultivadas em um frasco

contendo meio de cultura para a obtenção de uma grande população.
Após 24 horas de cultivo o conteúdo do frasco é centrifugado. Então se
retira o meio de cultura, ficando somente as bactérias no fundo do tubo.
Essas bactérias têm sua membrana celular lisada com a adição de um
detergente e o conteúdo é centrifugado novamente. O sobrenadante é
descartado e é adicionado álcool, que é responsável pela precipitação do
DNA. Novamente a amostra é submetida à centrifugação e o pellet (DNA)
é ressuspendido em água (Figura 02). Pronto, o DNA plasmidial das
bactérias foi extraído e esse procedimento descrito recebe o nome de
mini-prep. E como o pesquisador obterá grandes quantidades do gene A?
Para isso dispomos da técnica de PCR.

Figura 02 – Esquema de obtenção de DNA plasmidial de bactéria (mini-prep). Confeccionada por

Lauand, C., 2010.

Esse DNA que foi extraído vai ser submetido à técnica de PCR
para obtenção de várias cópias do gene A.

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1.2 O que é necessário para uma reação de PCR

Para a realização de uma reação em cadeia da polimerase é

necessário: uma pequena quantidade do DNA alvo, DNA polimerase,
primers (iniciadores) e dNTPs – timina, adenina, guanina e citosina.

Voltando ao nosso exemplo do gene A, o pesquisador iria adicionar

a um tubo o DNA plasmidial que extraiu, os primers, a enzima DNA
polimerase e dNTPs (obtidos comercialmente) e misturar bem. Mas o que
são primers? Os primers são segmentos sintéticos de ácidos nucléicos,
com 1 a 60 nucleotídeos, sendo complementares ao DNA do gene de
interesse. O pesquisador teria que construir primers que fossem
complementares ao começo e ao final do gene A, para assim amplificar o
gene inteiro (figura 02) (lembre-se de que as enzimas de replicação
seguem um único sentido na dupla-fita). A DNA polimerase começa a
adicionar nucleotídeos a partir da região iniciadora – onde os primers se
pareiam com o DNA.

Figura 02 – Visualização do local do desenho do primer para amplificação do gene A no DNA

plasmidial.

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1.3 Técnica de PCR

Após a adição das substâncias necessárias para a reação, a

mistura é então submetida a cerca de 40 ciclos de replicação e a cada
ciclo o número de cópias da região-alvo se duplica. Cada ciclo consiste de
(Figura 03):
 Cerca de 1 minuto à temperatura de 94-96ºC, período no qual o
DNA é desnaturado e fica em fita simples – ETAPA1;
 Cerca de 1 minuto a 50-65ºC, período no qual os primers se
pareiam às moléculas do DNA alvo – ETAPA 2;
 1 a vários minutos a 72ºC, período em que a polimerase se liga
aos primers e faz a extensão das cadeias complementares ao
DNA molde, que estão sendo recém sintetizadas – ETAPA 3.

Figura 03 – Esquema de um ciclo de replicação.

Fonte: Alberts et al., 2004

Cada ciclo duplica a quantidade de DNA sintetizado no ciclo

anterior e após cada um deles os novos fragmentos de DNA gerados
servem de molde. Dentro de poucos ciclos o produto predominante é uma
única espécie de fragmento de DNA, cujo comprimento corresponde à
distância entre os dois primers originais. Após 20 a 30 ciclos de reação se
obtêm uma amplificação efetiva do DNA (Figura 04).

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Figura 04 – Esquema de um PCR.

Modificada de: Lehninger Biochemistry, 2005.

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Esses ciclos eram realizados manualmente, em que água era

aquecida a diferentes temperaturas e os tubos eram deslocados sempre
que necessário. O desenvolvimento de tecnologias propiciou a elaboração
de aparelhos que realizam esses ciclos, é só preparar a reação de PCR e
programar a máquina (Figura 05). Isso facilita muito o processo, já que
essa técnica é constantemente utilizada quando se trabalha com biologia
molecular.

Figura 05 – Foto de um termociclador, aparelho que realiza os ciclos de temperatura para que
possa ocorrer o PCR. Fonte: www.eximlab.com.br/imagens/fotos//fotop_TX96_3.jpg

É possível realizar experimentos práticos em sala de aula com o

que foi aprendido até agora. A técnica de PCR não é possível de se
reproduzir, já que os materiais e aparelhos são caros e a técnica muito
específica para aluno do ensino básico. Porém é possível realizar a
extração de DNA total de cebola, banana ou morango. As etapas para
realização de atividades desse tipo estão disponíveis na internet. É uma
aula prática fácil, relativamente rápida e que ilustra bem uma aula sobre
extração de DNA como veremos na próxima unidade.

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2 Eletroforese de DNA

Voltando mais uma vez ao nosso exemplo, após realizar a extração

do material genético do organismo vivo e realizar a técnica de PCR para
aumentar a quantidade do gene A, o pesquisador tem que verificar se a
sua reação realmente funcionou. O próximo passo é verificar o tamanho
do fragmento de DNA que ele amplificou e isso é possível pela
eletroforese de DNA.

Eletroforese é um termo geral que se refere à migração de

moléculas carregadas eletricamente em um campo elétrico. Esse
processo é realizado em um gel poroso em que as moléculas são
capazes de migrar e se separar de acordo com suas propriedades físicas.
Esse gel poroso é feito de agarose, uma forma de agar altamente
purificado. Uma vez que o DNA é carregado negativamente, ele migrará
para um pólo carregado positivamente.

O gel de agarose serve como uma peneira molecular: moléculas

maiores de DNA percorrem menor distância no gel enquanto moléculas
menores migram com mais facilidade e percorrem maior distância. As
moléculas de mesmo tamanho de DNA se acumulam no mesmo local no
gel e a essa região chamamos de banda.

O tamanho de um fragmento de DNA é medido pela quantidade de

bases nitrogenadas que ele contém: quanto mais bases nitrogenadas o
fragmento tiver, maior ele será. A técnica de eletroforese pode separar
moléculas de DNA com tamanhos variando entre 100 e 30.000 pares de
bases.

Pode-se dividir a eletroforese em quatro etapas (Figuras 6 e 7):

 Preparação do gel de agarose;

 Aplicação das amostras;
 Eletroforese (“corrida” das amostras);
 Análise dos fragmentos separados.

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Figura 06 – Etapas para realização de uma eletroforese de DNA. A: local onde o gel de agarose é
colocado, chamado de cuba de eletroforese. O pente cinza é responsável por formar poços onde a
amostra será aplicada. B: Gel de agarose polimerizando na cuba. C: Aplicação das amostras nos
poços. D: Eletroforese de DNA. A fonte de energia confere um campo elétrico e os fragmentos de
DNA migram no gel de agarose. E: foto da aplicação de amostras de DNA em um gel de agarose.
Modificada de: http://www.sobiologia.com.br/figuras/Genetica/eletroforese2.gif

A análise dos fragmentos de DNA separados pela eletroforese é

realizada da seguinte forma: após a corrida, o gel é colocado em uma
solução contendo o corante brometo de etídeo. Esse corante se intercala
entre as bases dos ácidos nucléicos e fluoresce em laranja quando
iluminado por luz ultravioleta (Figura 7). Assim, é possível fotografar o gel
e obter uma foto dos fragmentos concentrados em tamanhos diferentes
(bandas de DNA).

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Figura 07 – Análise dos fragmentos de DNA por meio de um transluminador (luz UV) após deixar o
gel em contato com brometo de etídeo. Destaque para as bandas observadas graças ao corante
brometo de etídeo intercalado entre as bases nitrogenadas do DNA (em laranja). Fonte:
http://biofafijan.fotopages.com/?entry=517115

Para sabermos o tamanho dos fragmentos aplicados no gel

utilizamos um padrão de peso molecular (Figura 08). O peso molecular
contém fragmentos de DNA de tamanhos previamente conhecidos e ao
migrarem no gel formarão um padrão de bandas que servirá para
comparação com a amostra corrida juntamente com ele. Assim podemos
analisar o tamanho dos fragmentos que encontramos em um gel.

Figura 08 – Exemplo de um padrão de peso molecular. Cada banda possui uma quantidade de
pares de bases (bp), variando de 250 bp até 10000bp, também denominado de 1kb (kilo base).
Fonte: www.fermentas.com (site de vendas).

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O nosso pesquisador hipotético após realizar a eletroforese do seu

material amplificado por PCR percebe que sua reação funcionou. Ele já
sabia que o gene A possuía 3000 pares de bases. Onde será que ele
encontraria a banda do seu gene se ele utiliza-se o padrão de peso
molecular mostrado na figura acima?

Para concluir que a o PCR deu certo é preciso encontrar apenas

uma banda que corresponde a um único tamanho de fragmento de DNA.
Esse fragmento deve possuir o mesmo tamanho do gene de interesse
que foi amplificado. Caso encontremos mais de uma banda na
eletroforese, mais de um fragmento de DNA foi produzido durante o PCR
e por isso a amostra não estaria pura e o processo deveria ser repetido
(figura 09).

A B

Figura 09 – Exemplo de análise de um resultado de PCR utilizando eletrofose. A: Se o gene A

tivesse 3000bp ele se localizaria no mesmo nível que a banda do padrão correspondente a este
peso. B: Se a reação de PCR não funcionasse veríamos a banda correspondente ao gene A
(3000bp) e outras correspondentes a fragmentos de DNA diferentes. Fonte: www.fermentas.com

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A reação, no caso da figura 09B, seria inespecífica, pois os primers

além de se ligarem nas regiões iniciadoras do gene A também se ligaram
no início de outros genes.

Esse exemplo que demos sobre o gene A é bem comum em

rotinas de laboratórios de pesquisa acadêmica. Entretanto, essas técnicas
podem ser utilizadas para outras finalidades como:

 Teste de paternidade: é coletado o material do possível pai e do

filho. Algumas regiões do DNA de ambos são amplificadas por
meio de PCR e depois analisadas em gel de agarose. Se os dois
indivíduos apresentarem padrões semelhantes de bandas, o
possível pai é realmente pai.
 Biologia forense: houve um assassinato e encontrou-se uma
amostra de sangue no local. São realizadas análises no DNA
presente na amostra juntamente com o DNA dos suspeitos para
tentar descobrir o real causador do crime.

3 Clonagem Molecular

O termo clonagem de DNA pode ser utilizado em dois sentidos. No

sentido literal da palavra serve para indicar produção de várias cópias
idênticas de um fragmento de DNA (amplificação de uma sequência de
DNA – gene). No sentido mais geral refere-se ao isolamento de um gene
a partir do restante do DNA da célula e posterior amplificação deste para
inseri-lo em outro organismo.

A inserção de um gene de interesse é realizada em um DNA (DNA

alvo) purificado de um organismo que se auto-replica constantemente,
como vírus e bactérias. O DNA alvo pode ser genômico ou plasmideal.
Um gene humano, por exemplo, pode ser inserido em um plasmídeo e o
resultado disso será um DNA recombinante (Figura 10A). Esse DNA
recombinante é inserido em uma bactéria e quando essa bactéria se
divide ela replica o DNA inserido juntamente com o seu próprio DNA,

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amplificando muito esse material (Figura 10B). A bactéria E. coli divide-se

produzindo 2 novas bactérias em uma média de 20 minutos. Imagine ao
final do dia quantas novas cópias do DNA recombinante teríamos.

Figura 10 – Clonagem utilizando bactérias. A: Inserção de uma fragmento de DNA em um

plasmídeo bacteriano. B: Purificação e amplificação de uma sequência específica de DNA pela

clonagem de DNA em uma bactéria. Fonte: Alberts et al., 2004

Um clássico exemplo para entendermos o uso dessa técnica na

prática é o da produção de insulina. Conhecendo-se o gene da insulina,
realizou-se a técnica de PCR para amplificar esse gene. Então, esse gene
foi inserido em um plasmídeo de uma bactéria e esse plasmídeo foi
introduzido em uma bactéria, que se torna um organismo geneticamente
modificado (transgênico). Essa bactéria divide-se e forma uma população
de bactérias que porta o gene para produção de insulina. Esse gene é
transcrito em todas as bactérias e a proteína insulina é produzida em
grande quantidade. O próximo passo é a coleta dessa insulina produzida
e sua purificação para uso na medicina.

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4 Sequenciamento

O sequenciamento de DNA é uma técnica utilizada para determinar

a ordem das bases nitrogenadas (A, T, C e G) de qualquer fragmento de
DNA purificado. Essa técnica possibilitou a determinação da seqüência de
DNA de muitos genes e vários organismos tiveram seu genoma
totalmente seqüenciado. Como exemplos temos: a Drosophila
melanogaster, Homo sapiens e a Escherichia coli.

O Projeto Genoma é um empreendimento internacional que visa

desvendar o código genético de organismos, podendo ser de origem
animal ou vegetal ou ainda fungos, bactérias e vírus. O Projeto Genoma
Humano teve como objetivo mapear e sequenciar os genes presentes no
genoma humano. A realização desses projetos só foi possível devido à
elaboração da técnica de sequenciamento do DNA.

A técnica mais utilizada foi a desenvolvida por Sanger e

colaboradores, que se baseia na interrupção controlada da replicação
enzimática do DNA. O DNA a ser sequenciado é separado em fitas
simples e é utilizado como molde para o seqüenciamento. Esse DNA é
então submetido a uma reação de PCR. Mas, junto às bases
nitrogenadas existem algumas que são marcadas e quando são
incorporadas param a amplificação. São feitos vários tubos para a reação
e em cada tubo se adiciona uma solução de bases nitrogenadas contendo
um tipo delas marcada. Então, vários fragmentos de tamanhos diferentes
são amplificados. Depois esses fragmentos são separados por um gel e o
tamanho das bandas determinará a seqüência do fragmento (Figura 11).

Se o pesquisador do nosso primeiro exemplo quisesse estudar um

fragmento de DNA desconhecido ao invés do gene A (sequência já
conhecida) ele teria que realizar a técnica de seqüenciamento. Assim, ele
poderia descobrir a qual gene corresponderia esse fragmento.

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Figura 11 – Esquema da técnica de sequenciamento de DNA por Sanger e colaboradores.

Modificada de: Alberts et al., 2004

5 Southern, Northern e Western blotting

As técnicas Southern, Northern e Wertern blotting foram

desenvolvidas para o estudo e quantificação respectivamente de DNA,
RNA e proteínas.

5.1 Southern e Northern blotting

Suponha que o nosso amigo pesquisador deseje agora estudar se

o defeito de uma espécie de camundongo que produz anormalmente
pequena quantidade de insulina é devido a erros na sequência do DNA ou
a problemas na transcrição (níveis de RNAm). Primeiramente, ele pegará
uma amostra de pâncreas de camundongos normais e dos camundongos

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“defeituosos”. Por meio de um protocolo de extração, o RNA e o DNA

desses tecidos são separados de todos os outros componentes. O DNA e
o RNA são então separados em frascos diferentes para o estudo
separado dessas moléculas respectivamente pelas técnicas de Southern
e Northern.

Os passos para realizar uma técnica de Southern e Northern

blotting são (Figura 12):

 O DNA ou RNA são fragmentados;

 Esses fragmentos são separados por eletroforese;

 Os fragmentos são transferidos do gel para uma membrana;

 A membrana é exposta a uma solução contendo uma sonda

(para o DNA ou RNA) marcada por radioatividade, cor ou
quimioluminescência;

 Coloca-se um filme radiográfico sobre a membrana (a

luminosidade vela o filme nas bandas com as sondas).

Figura 12 – Esquema da técnica de Southern e Northern blotting.

Modificada de: Alberts et al., 2004

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A sonda é uma molécula de ácido nucléico de fita simples que é

complementar em sequência ao fragmento que se tem interesse em
detectar. No caso do nosso exemplo, a sonda seria construída para ser
complementar ao gene que codifica a insulina (Southern). Caso
quiséssemos detectar se o defeito está no RNAm (Northern) a sonda
seria complementar ao RNAm e não ao DNA.

A técnica de Southern blotting permite analisar como é o perfil de

um gene que se quer estudar, podemos verificar possíveis alterações,
como mutações. Northern blotting é um método para a detecção e
quantificação de níveis de RNAm, amplamente usado para determinar o
tamanho do transcrito e para estudar a expressão gênica tecido-
específica.

Se a produção de baixos níveis de insulina pelos camundongos do

nosso exemplo estivesse associada a um problema no gene, por
exemplo, os camundongos normais teriam um padrão de bandas
diferentes dos camundongos defeituosos ao realizar a técnica de
Southern.

Western blotting

A técnica de Western blotting é utilizada para o estudo de

proteínas. Essa técnica permite avaliar o nível de expressão protéica de
uma célula, analisar o perfil total de proteínas em um organismo e a
verificação do tamanho das proteínas.

O procedimento para sua realização é parecido com as técnicas de

Southern e Nhorthern. Primeiramente, se extrai todas as proteínas de um
tecido ou cultura celular para submeter essa amostra a uma corrida em
gel de poliacrilamida (parecido com o que ocorre na eletroforese já
estudada). Essas proteínas separam-se durante a corrida por diferença
de peso e o conteúdo do gel é transferido para uma membrana de
nitrocelulose. Essa membrana é tratada com anticorpos marcados contra
a proteína de interesse. O próximo passo é a revelação da membrana por
meio de filme radiográfico.

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6 RNA de Interferência

O RNA de interferência é utilizado para controlar os níveis de

expressão de uma determinada proteína. É uma técnica mais refinada e
bastante nova e tem sido bastante utilizada na área da pesquisa para
estudo em diversas áreas: botânica, biologia celular, zoologia, etc.

Um exemplo prático de seu uso seria: uma determinada proteína C

é super expressa em câncer de pulmão. O desenvolvimento do tumor
está intimamente associado a essa super expressão, então se
conseguirmos diminuir a quantidade dessa proteína iremos diminuir a
progressão da doença.

Estudos como este vêm sendo exaustivamente realizados, mas

ainda não foram aprovados para uso em seres humanos.

A técnica consiste em construir uma sequência de nucleotídeos

complementar a uma região do RNAm para a proteína que se quer
diminuir a expressão; esse seria o RNA de interferência (RNAi). O RNAi é
então introduzido nas células e se pareia ao seu RNAm complementar,
formando um RNA dupla fita no citoplasma. A célula detecta esse RNA
dupla fita e o destrói por meio de uma maquinaria protéica interferindo,
assim, na produção da proteína correspondente. Dessa maneira, os
níveis dessa proteína iriam diminuir e isso poderia ser confirmado
utilizando-se a técnica de Western blotting (Figura 13).

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Figura 13 – Esquema da técnica de interferência por RNA. Um RNA sintético é introduzido na

célula, processado por proteínas para se tornar fita simples. Essa simples fita de RNA se pareia
com o RNA mensageiro correspondente, formando uma dupla fita. Essa dupla fita é destruída no
citoplasma e a proteína que seria codificada por esse RNAm tem sua expressão diminuída.
Produzida e cedida por Lauand, C., 2010.

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Anotações
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Referências

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Editora, Porto Alegre – RS, 2004.

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SILVA-JÚNIOR, C.; SASSON, S. César e Sezar, Biologia – Volume

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