FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

PRACTICA N° 1
METODOS DE COLECTA
I. INTRODUCCION.

El diagnóstico de las enfermedades de las plantas se refiere a la determinación del

agente causal de una enfermedad, y es una de las bases indispensables para lograr
un control eficaz. Sólo cuando se conoce el agente causal puede consultarse la
literatura especializada que revela la experiencia de otros fitopatólogos y puede
servir para planear las medidas de control. Ciertas enfermedades pueden ser
reconocidas fácilmente; es decir, a simple vista, basándose en la experiencia y en las
particularidades de los patógenos que los hacen inconfundibles, pero hay muchas
otras que se confunden, y entonces el diagnóstico se complica, teniendo que realizar
las siguientes actividades: colecta, aislamiento, identificación del patógeno,
inoculación, reaislamiento y reidentificación. La colecta inicia con una observación
de alteraciones en nuestro cultivo, y será más precisa si el que la realiza ha
examinado de manera personal la enfermedad en el campo. Un observador
cuidadoso puede obtener datos valiosos que faciliten todo el proceso. Por ejemplo,
la distribución local de una enfermedad varía de acuerdo con las circunstancias; es
decir, pueden estar atacadas todas las plantas por igual, algunas más que otras,
plantas sanas alternadas con plantas enfermas, áreas bien definidas de plantas
enfermas, en hileras en los bordes de la plantación, en las partes más bajas o
distribuidas al azar. Es importante notar la presencia de focos de infección inicial, a
partir de los cuales se extiende la enfermedad, debido a que esa información da
idea del patrón de diseminación y de la fuente de inóculo primario. En el desarrollo
de la Fitopatología práctica es de suma importancia la colecta del material enfermo,
puesto que de esto dependerá el que se puedan realizar las técnicas conducentes
a una identificación acertada del patógeno en cuestión.

II. OBJETIVO.
Manejar las técnicas más comunes de colecta y preservación de material de estudio
fitopatológico.

III. ACTIVIDADES PREVIAS A LA PRACTICA.

Para el desarrollo de esta práctica, los alumnos deberán resolver y entregar el
siguiente cuestionario:
1. ¿Qué es el diagnóstico de las enfermedades?
2. ¿Qué es una colecta?
3. ¿Por qué y cuándo se debe realizar una colecta?
4. ¿Qué observaciones se deben hacer en el campo?
5. ¿Qué material se necesita para realizar una colecta?
6. ¿Cómo se detectan los problemas fitopatológicos?
7. ¿De qué dependen las partes vegetales que es necesario colectar?
8. ¿Qué se debe colectar en un cultivo anual?
9. ¿Qué se debe colectar en un cultivo perenne?
10. ¿Qué se debe hacer si el tejido es carnoso?
11. ¿Qué se debe hacer si la planta presenta nodulaciones en la raíz?
12. ¿Qué se debe anotar en la libreta de campo con respecto al material
colectado?
13. ¿Qué usos se le puede dar al material colectado?
14. ¿Qué se debe hacer si el material colectado se destinará al herbario
fitopatológico?
15. ¿Qué es una solución fijadora?

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

IV. EQUIPOS Y MATERIALES

 Pala recta
 Tijeras de podas
 Serrucho
 Cámara fotográfica
 Etiquetas
 Navaja de campo
 Lupa de campo
 Bolsas de papel secante
 Prensa botánica
 Periódico y cartón corrugado
 Libreta de campo
 Hielera portátil
 Ligas Engrapadora
 Frascos
 Soluciones fijadoras

V. PREPARACION DE SOLUCIONES FIJADORAS

 FIJADOR FFA (Formaldehido, alcohol, acético), Los fijadores son

moléculas o mezclas de moléculas en solución que se usan para
preservar las características tisulares lo más parecido posible a su estado
vivo. Permiten que las muestras de tejidos sean conservadas o
procesadas en las diversas técnicas histológicas sin deteriorarse. Existen
multitud de fijadores, cada uno con características propias, y se eligen
en función del tratamiento posterior o de lo que queramos poner de
manifiesto.
La solución fijadora FFA se emplea normalmente en la fijación de tejidos,
aunque no preserva muy bien el citoplasma, es un buen fijador para
conservar estructuras vegetales.
Formol al 40 % 10 mL
Ácido acético glacial 10 mL
Alcohol al 50 % 100 Ml

 SOLUCIÓN DE HESLER
Agua destilada 1000 mL
Cloruro de Zinc 50 mL
Formalina 25 mL
Glicerina 25 Ml

VI. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Los problemas fitopatológicos se pueden presentar en hojas, raíces. tallos, etc.
y se detectan cuando las plantas crecen de modo anormal, se secan o se
mueren, disminución de la cosecha, alteraciones en el crecimiento,
decoloraciones, sobrepigmentaciones, manchas, rayados, pudriciones,
marchitamientos, etc. Es conveniente disponer del mayor número de

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

elementos vegetales colectados que permitan lograr la identificación del

agente causal.
Las partes vegetales que deben colectarse dependen del tipo de cultivo que
se trate:

 Cultivo anual. Se deberán colectar varias plantas completas que

presenten síntomas iniciales y en diferentes etapas de desarrollo de la
enfermedad, pero que no estén en estado de descomposición o
totalmente muertas, pues así no son útiles para su estudio en el
laboratorio. Si el cultivo ya está muy desarrollado, se deben colectar sólo
porciones de los órganos atacados. Es conveniente colectar también
una planta sana que sirva de comparación.

 Cultivo perenne. Se colectan partes representativas, como raíz, tallo

hojas, flores y frutos; de igual forma con síntomas iniciales y en diferentes
etapas de desarrollo de la enfermedad, y partes sanas para la
comparación. Tampoco se deben colectar partes que estén por
completo muertas o en estado de descomposición.

Para partes vegetales carnosas, como frutos y bulbos, se deben colectar en

frascos con soluciones fijadoras. En el caso de que la planta presente
nodulaciones en la raíz, es muy probable que se trate de infestaciones de
nematodos, por lo que se deben tomar muestras del suelo que hayan estado
en contacto con la raíz.

En el caso de que las plantas sean pequeñas, se debe sacar la planta entera
y, sin sacudir el suelo de las raíces, se debe meter en una bolsa de plástico
junto con aproximadamente 250 gr de suelo y cerrarla con una liga para
evitar que los nematodos mueran. Las bolsas no deben exponerse al sol.

Es indispensable que todos los ejemplares que se colecten, se acompañen

de la mayor cantidad de datos posibles, que se anotarán en la libreta de
campo.

El material colectado puede emplearse para realizar aislamientos del

agente causal, en cuyo caso se puede prensar o conservarse en
refrigeración, o bien, como material de herbario, empleándose el prensado
o la preservación en fijadores como el alcohol al 70 %, el F.A.A. o la solución
de Hesler.

El material de herbario se debe montar en cartulinas blancas de 30 x 40 cm,

siguiendo las técnicas de herbario acostumbradas.

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

Todo material preservado debe llevar su etiqueta correspondiente. Es

indispensable que todos los ejemplares que se colecten, vayan
acompañados con los siguientes datos:

1. Datos generales
Muestra No. _____________________ Variedad _________________________
Localidad_________________________ Edad del cultivo ___________________
Fecha ___________________________ Cultivos anteriores __________________ Cultivo
(hospedero)_________________ Predio _________________________

2. Apariencia general del cultivo

Marchitez_____________________ Tizones___________________________
Amarillamiento________________ Desarrollo anormal__________________
Áreas muertas_________________ Otros_____________________________
Manchas foliares_______________

3. Partes atacadas de las plantas

Raíz______________________________ Brotes o tallos______________________
Hojas_____________________________ Flores_____________________________
Frutos____________________________

4. Distribución de la enfermedad
Plantas aisladas _____________________ Manchones o grupos de plantas_________
Áreas grandes ______________________ Áreas pequeñas_____________________
Bandas o franjas____________________ Bordes de cultivo____________________

5. Condiciones prevalecientes durante la aparición de los primeros síntomas y el

desarrollo de la enfermedad
Precipitación _______________________ Humedad relativa ___________________
Vientos____________________________ Heladas___________________________
Granizo___________________________ Otros______________________________

6. Labores culturales
Frecuencia de riego__________________ Fertilizaciones ______________________
Incorporación de materia orgánica______ Aclareos___________________________
Podas_____________________________ Otros______________________________

7. Químicos aplicados al cultivo (concentraciones y dosis)

Fertilizantes_______________________ Fungicidas ________________________
Herbicidas________________________ Insecticidas ________________________
Defoliantes________________________ Otros_____________________________

VII. BIBLIOGRAFIA
 Echandi, E. 1975. Manual de Laboratorio de Fitopatología General. Herrero Hnos.
México.
 Dhingra, O. D., and Sinclair J. B. 1985. Basic Plant Pathology Methods. CRC Press. 355
pp.
 González, L.C. 1977. Introducción a la Fitopatología. I.I.C.A. San José de Costa Rica.
 López A.G. 1978. Técnicas de uso común en el manejo de Hongos fitopatógenos.
Tesis. E.N.A. Méx.
 Narayanasamy, P. 2001. Plant pathogen detection and diseases diagnosis. Marcel
Dekker Inc. 518 pp.

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

PRÁCTICA 2

AISLAMIENTO DE HONGOS FITOPATÓGENOS A PARTIR DE PLANTAS ENFERMAS

I. INTRODUCCIÓN: El aislamiento consiste en el proceso de separación

de microorganismos a partir de su sustrato natural (plantas) para
hacerlas crecer en un medio de cultivo artificial. El aislamiento y
cultivo persigue diversos fines, el más común en un laboratorio de
fitopatología es para diagnosticar la causa de una enfermedad
desconocida, sin embargo, puede tener objetivos didácticos o de
investigación sobre taxonomía, fisiología y genética microbiana. Es
común también cuando se quiere tener cepas puras en la evaluación
de productos químicos in Vitro. El cultivo de microorganismos tiene
enormes ventajas que contribuyen al conocimiento de la biología de
estos. Sin embargo, hay que considerar que al cultivar un organismo:

a. Pueden ocurrir mutaciones.

b. Se puede perder parcial o totalmente su patogenicidad.
c. Los hongos pueden o no formar cuerpos fructíferos en medios
artificiales; estos cuerpos pueden presentar variación.
d. Existen hongos que no se pueden cultivar (parásitos obligados)
y otros que requieren medios complejos para su desarrollo.

II. OBJETIVOS
Aprender a aislar y cultivar hongos fitopatógenos

III. MATERIAL REQUERIDO

1. Material vegetal enfermo
 Penicillum (cítricos)
 Hemileia vastratrix (Roya en café)
 Moniliophthora roreri (cacao).
 Rhizoctonia solani (café)
 Mycosphaerella fijensi (Sigatoka en plátano)
 Phythophtora (piña, palta)
 Colletotrichum gloeosporioides (Antracnosis palta, mango.
2. Agua destilada
3. Agujas de disección
4. Estiletes
5. Pinzas (materiales de disección)
6. Navajas Filtros de porcelana
7. Parafilm
8. Placas Petri con cultivo (agar PDA)

REACTIVOS
 Alcohol etílico
 Hipoclorito de sodio

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

IV. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA

DESINFECCIÓN
Los tejidos enfermos contienen normalmente diversidad de
organismos que invaden los tejidos muertos por el patógeno. Estos
contaminantes dificultan el aislamiento, por lo que generalmente es
necesaria una desinfección previa a la siembra.
Entre los desinfectantes más usuales se tienen a:
a. Hipoclorito de sodio. El desinfectante más usado es el
blanqueador de uso doméstico (cloralex), basta mezclar una
parte de esta sustancia en cinco partes de agua destilada
para obtener el producto deseado ya que el blanqueador
viene al 5-6%, es decir que normalmente se usa hipoclorito al
1-2%, el tiempo de exposición varía de 30 a 90 segundos; el
material viejo o muy contaminado se puede tratar por 2 a 3
minutos siempre que no se elimine el patógeno.

b. Alcohol etílico. Se usa generalmente al 70% por periodos de 30

segundos, el uso de alcohol al 95% es peligroso por su
flameabilidad.

INDUCCIÓN AL DESARROLLO MICELAR

Se recomienda que el hongo crezca y esporule sobre medios de
cultivo, recomendable para hongos que crecen en el interior del
hospedante y/o que esporulen poco en el tejido, tales como hongos
de la raíz. Este método es el más usado cuando se requiere tener a un
hongo en cultivo puro.

 Lavar el material enfermo con agua corriente y secar.

 Seleccionar al tejido vegetal afectado procurando que los trocitos
queden de 0.3 a 0.5 cm de longitud. Desinfectar los trocitos.
 Enjuagar los trocitos en 3 pasos de agua destilada estéril y secarlos
perfectamente, al secar bien, disminuyen las contaminaciones.
 Pasar 4 a 5 secciones a una caja de Petri con PDA, selle la caja
con cinta parafilm e incube de 20 a 25 °C.

V. INFORME DE RESULTADOS.

VI. CUESTIONARIO

1. A partir de una muestra identifique ¿cuál es el síntoma?

2. ¿A qué clase pertenece este hongo? ¿Por qué?
3. ¿Cómo se disemina?
4. ¿Por qué es importante la desinfección de una muestra?
5. Describa los Postulados de Koch

VII. BIBLIOGRAFÍA
 Agrios, G.N. 2007. Fitopatología. LIMUSA, México. 285-290 p.
 López, A.G.F. 1979. Manejo de Hongos Fitopatógenos. Universidad
Autónoma de Chapingo.

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

PRÁCTICA 3

ELABORACIÓN DE MONTAJES MICROSCOPICOS DE HONGOS

FITOPATÓGENOS

1. INTRODUCCIÓN.

Por su tamaño microscópico, los hongos generalmente no pueden

observarse a simple vista, a excepción de hongos macroscópico que por
su propio tamaño pueden ser observados superficialmente sin aparatos,
siempre y cuando no se requiera estudiar detalles de las esporas, etc.
Para su observación al microscopio compuesto, los hongos requieren ser
preparados y montados en portaobjetos. En estudios preliminares o de
rutina se hacen preparaciones temporales desechables, pero si se desea
preservar especímenes por largo tiempo es necesario elaborar montajes
permanentes, los que de hacerse correctamente duran uno o varios años
en buenas condiciones. Para hacer un montaje de calidad, se requiere
paciencia y experiencia, además de la destreza individual, sin embargo,
todo Fitopatólogo debe intentar hacer buenas preparaciones, ya que
actividades prácticas tales como el diagnóstico de enfermedades
dependen de alto grado de buenas preparaciones.

2. OBJETIVOS
Aprender a preparar montajes microscópicos de especímenes fungosos.

MATERIAL REQUERIDO
EQUIPO
 Microscopio biológico compuesto

MATERIAL
 Cepas de hongos.
 Montajes permanentes de hongos.
 Agua
 Cinta adhesiva
 Porta y cubre objetos
 Navajas

REACTIVOS

Fenol ( cristales )
Lactofenol azul y claro

3. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA MONTAJE CON AGUJA DE DISECCIÓN

Es útil para montar estructuras que desarrollan abundantemente en la

superficie del hospedante, o a partir de cepas que crecen en medio de
cultivo. Es la técnica obligada para hacer preparaciones a partir de
raíces infectadas. El procedimiento consiste en:

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

a. Colocar una pequeña gota de agua u otro medio de montaje en

el centro de un portaobjetos.
b. con la punta de la aguja humedecida tome o roce ligeramente
las esporas y/o micelio que desee montar, evite tomar material
excesivo ya que dificulta la observación posterior.
c. Transferir el material a la gota del medio de montaje, coloque
cuidadosamente un cubreobjetos y observe con los objetivos 10x
y 40x.
d. Para montajes temporales use agua o lactofenol, para
preparaciones permanentes use lactofenol y selle con esmalte
para uñas.

4. MONTAJE MEDIANTE CINTA ADHESIVA

Es la técnica más rápida y fácil, Las preparaciones son exclusivamente

temporales. El método consiste en:
a. Colocar una gota de agua u otro medio de montaje en el centro
de un portaobjetos.
b. cortar un trozo de cinta, 1 o 2 cm más grande que la longitud del
portaobjetos, no use trozos de cinta más pequeños o más grandes.
c. Tomar la cinta por los extremos con dos de los dedos, deposite
suavemente la parte engomada sobre la superficie del
hospedante o crecimiento del hongo en medio de cultivo, evite
presionar demasiado, pues tomara material en exceso y/o
también se pegarán setas u otras estructuras de la planta que
dificultaran la observación.
d. Tome la cinta con las dos manos y péguela sobre el portaobjetos,
vigile que la cinta pegue rápidamente en ambos extremos del
cristal, pues de lo contrario despegara fácilmente, observe al
microscopio con los objetivos 10x y 40x.

Las mejores preparaciones no son aquellas que presentan mucho

material, sino las que contienen las estructuras típicas del hongo, más aún
si se encuentran bien separadas y arregladas en forma estética.

CORTES DE CUERPOS FRUCTÍFEROS

Cuando se quieran observar estructuras que se encuentran parcial o
totalmente inmersas en el hospedante y/o encerradas en cuerpos
fructíferos, es necesario hacer cortes transversales que permitan observar
perfectamente la forma y ubicación interna de las esporas, estos cortes
se pueden hacer con aparatos especiales.
a. Coloque el material enfermo bajo el microscopio de disección,
separe una porción superficial del tejido enfermo mediante un
corte longitudinal procurando no dañar los cuerpos fungosos, esto
facilitara los cortes de los cuerpos ya que solo manejaremos una
pequeña porción de tejido, el tamaño de la muestra puede
variar, pero se aconseja dejar tiras de +/- 1 a 3 cm de largo por +/-
1 a 3 mm de ancho, con un grosor de +/- 0.5 a 2 mm; esto
depende de muchos factores tales como el tamaño de los
cuerpos a cortar, consistencia del tejido etc., la experiencia es
básica.

Responsable: Ing. William Torres Poma

FITOPATOLOGIA GENERAL - PRACTICA

b. Con una navaja de rasurar sin usar, separe el tejido adyacente

que se encuentra adelante y a los lados del cuerpo fructífero; este
quedara delimitado y listo para los cortes definitivos.
c. Coloque el dedo índice de la mano izquierda junto al cuerpo a
cortar, cuide de no presionar directamente al cuerpo, de tal
forma que, al recargar la navaja en el dedo índice, este guíe y
regule el espesor de los cortes, estos deben ser lo más delgado
posible (cortes transversales de un solo tajo).
d. Los cortes que van quedando adheridos o por un lado de la
navaja, se toman con una aguja de disección humedecida y se
transfieren al portaobjetos, en el que previamente se a
depositado una gota de medio de montaje. Coloque al
portaobjetos y observe al microscopio.

5. CUESTIONARIO
a. ¿Cómo define un hongo fitopatógeno ?
b. ¿Cómo se reproducen los hongos fitopatógenos?
c. Menciones las estructuras reproductivas y señale su importancia
en la identificación del hongo.
d. Dibuje un conidióforo con sus respectivos conidios.
e. ¿Cuáles son los síntomas más comunes que producen los hongos
fitopatógenos?
f. ¿Qué es el inóculo primario y secundario?

6. INFORME DE RESULTADOS

7. BIBLIOGRAFÍA

 Echando, E. 1971. Manual de Laboratorio para Fitopatología

General, Herrera Hermanos. 13-14 p.
 Streeta, R.B. 1972 Tha Diagnosis of Plant diseases, Univ. Arizona
Press. López, A.G. 1979.
 Manejo de Hongos Fitopatógenos. UACH. 25-29 p. 50

Responsable: Ing. William Torres Poma