Phyllomedusa 14 (2): 89-97, 2015´

© 2015 Universidad de San Pablo - ESALQ

ISSN 1519-1397 (impresión) /ISSN 2316-9079 (en línea)
doi: http://dx.doi.org/10.11606/issn.2316-9079.v14i2p89-97

La evidencia de la contribución paterna múltiple en

Podocnemis sextuberculata (testudines:
Podocnemididae) detectada por los marcadores de microsatélites
Cleiton Fantin 1 Dorothy Ivila Melo Pereira 1, Jorge Frank Ferreira 1, Paulo Cesar Andrade
Machado 2, Tomas Hrbek 2, Luiz Alberto Santos Monjeló 2, y Izeni Pires Farías2
1 Departamento de Biología, Universidad del Estado de Amazonas, Av. Djalma Batista, 2470, 69050-010, Manaus, AM,
Brasil. E-mail:cleitonfantin@hotmail.com.
2 Departamento de Biología, Laboratorio de Genética Animal e Evolução, Universidade Federal do Amazonas, Av.

Rodrigo Octávio Jordão Ramos, 3000,69077-000, Manaus, AM, Brasil.

Abstract
Evidence of multiple paternity in Podocnemis sextuberculata (Testudines:
Podocnemididae) detected by microsatellite markers. We found evidence of multiple
paternity in a sample of 12 Podocnemis sextuberculata nests including seven nests (80
hatchlings) collected along the Amazonas River, in the municipality of Barreirinha, AM,
Brazil and five nests in the Abufari Biological Reserve, Tapauá, AM, Brazil (54 hatchlings).
As observed in other species of the genus, P. sextuberculata also presented polyandric
behavior. By means of allelic frequency and variation in six microsatellite loci for each
location, the occurrence of multiple paternity in sampled nests of this species was inferred,
even though the maternal genotype was unknown. For one of the nests, a minimum of four
males contributed to the clutch, whereas for nearly all remaining nests at least two males
contributed. Only one of the twelve nests did not show clear evidence for contributions
from more than one male. This is the first genetic evidence of multiple paternity in P.
sextuberculata.

Keywords: mating system, paternity, Podocnemis, reproduction, turtles.

Resumen
La evidencia de la contribución paterna en Podocnemis sextuberculata (testudines:
Podocnemididae) detectada por los marcadores de microsatélites. Encontramos evidencias
de paternidad múltiple en una muestra de 12 nidos de Podocnemis sextuberculata, incluyendo 7
nidos(80 crías) recolectados a lo largo del rio Amazonas, ene el municipio de Barreirinha, AM,
Brasil; y 5 nidos en la Reserva Biologica de Abufari, Tapauá, AM, Brasil (54 crías).
Como se observó en otras especies del género, P. sextuberculata también presentó un
comportamiento poliandríco. Mediante la frecuencia alélica y la variación en seis loci de
microsatélites para cada ubicación, se infirió la ocurrencia de paternidad múltiple en nidos
muestreados de esta especie, aunque el genotipo materno era desconocido. Para uno de los nidos, un
mínimo de cuatro machos contribuyeron a la nidada, mientras que para casi todos los nidos
restantes contribuyeron al menos dos machos. Solo uno de los doce nidos no mostró evidencia clara
de contribuciones de más de un macho. Esta es la primera evidencia genética de paternidad múltiple
en P. sextuberculata.

Palabra clave: sistema de apareamiento, la paternidad, Podocnemis, reproducción, tortugas.

Introducción
La fauna de tortugas de América del Sur es rica y
variada, comprende alrededor del 20% de las
especies que viven en el mundo (Pritchard, 1975).
El género Podocnemis comprende seis especies,
incluyendo Podocnemis sextuberculata (Cornelia,
1849), conocido popularmente como tortuga
cupiso. La coloración del caparazón varía de claro
a marrón oscuro. El macho adulto es más pequeño
que la hembra y, en individuos jóvenes plastrón
tiene seis tubérculos de color gris o marrón, que
da a la especie su nombre (IBAMA 1989). Su
distribución geográfica se extiende a lo largo de la
cuenca del río Amazonas en Brasil, Perú y
Colombia (Ernst y Barbour 1989, Iverson 1992).
Realizan nidos en los río y playas, una o dos
veces al año, ponen de 8-19 huevos elípticos
(Ferri 2002).P. sextuberculata su carne ha sido
intensamente consumido y comercializado
ilegalmente en la región amazónica, que
contribuyó a la inclusión de esta especie en la lista
roja de especies amenazadas como vulnerables.
Los estudios de los sistemas de apareamiento de
las tortugas han avanzado sustancialmente en las
últimas décadas (Galbraith 1991, Galbraith et al.
1993, Bowen y Karl 1996, Rieder 1996, Curtis
1998, FitzSimmons 1998, Crim et al. 2002, Moore
y la bola de 2002, Jensen et al. 2006, Zbinden et
al. 2007, Refsnider 2009, Theissinger et al. 2009,
Fantin et al. 2010, Stewart y Dutton 2011, Lasala
et al. 2013, Todd et al. 2013). Sin embargo, el
hecho de que la mayoría de las especies son
acuáticas el comportamiento en la naturaleza y es
responsable de la falta de información para la
mayoría de las especies (Carpenter y Ferguson
1977).
Ciertos aspectos de la reproducción de quelonios,
como la fidelidad del sitio de nidación, pero
muchos investigaron el uso molecular, pero
muchos otros todavía permanecen sin estudiar
(Bowen y Karl 1996). El análisis de parentesco de
los nidos de tortuga puede revelar aspectos
fundamentales de la biología de la reproducción
dentro de una población, pero la mayoría de los
esfuerzos están limitados por el pequeño tamaño
de la muestra y / o marcadores ambiguos, y no
queda claro si la paternidad múltiple es la
excepción o la regla.
Trabajos recientes han demostrado múltiples
paternidad en P. expansa, P. erythrocephala y P.
erythrocephala y P. unifilis (Pearse et al. 2006,
Fantin et al. 2008, Fantin et al. 2010). P. expansa
las hembras muestran un comportamiento
poliándricas que varía las tasas de paternidad
múltiple entre diferentes localidades (Valenzuela
2000, Pearse et al. 2006).
Fantin et al. (2008), encontraron paternidad
múltiple en los estudios de nidos en P. unifilis; y
Fantin et al. (2010) informó de paternidad
múltiple en nidos de P.erythrocephala. Sin
embargo, las observaciones sobre la patrón
reproductivo en P. sextuberculata aún no han sido
reportados.
Los datos moleculares se han utilizado
ampliamente para estudiar los sistemas de
apareamiento de quelonios (DeWoody et al. 2000,
Neff et al. 2000, Valenzuela 2000, Myers y
Zamudio 2004, Pearse et al. 2006). Entre las
técnicas moleculares disponibles, marcadores de
microsatélites han sido la herramienta más
frecuentemente aplicada y con éxito para
determinar patrones de paternidad en las especies
de tortugas.
En este estudio, se utilizó marcadores
microsatélites para determinar el sistema de
apareamiento en dos P. sextuberculata
poblaciones.
Pusimos a prueba la hipótesis de que el sistema
reproductivo de esta especie es poliándricas como
se observa en otras especies de este género. Este
estudio proporciona información valiosa para los
programas de conservación y gestión. Proporciona
una mejor comprensión de la biología
reproductiva de la especie y se espera estimular a
otros estudios de la biología de P. sextuberculata
y especies afines.
Materiales y métodos
Se estudiaron un total de 12 nidos de dos
localidades para este informe. 80 crías reciente de
P. sextuberculata fueron recolectadas a lo largo
del río Amazonas en Barreirinha-AM (03°03 ' 25 ''
S, 57°10 ' 28 '' W) (Figura 1), y 54 crías se
recogieron en la Reserva Biológica Abufari,
Tapauá-AM. El permiso para recolectar muestras
de tejido fue concedida por la RAN / IBAMA (nº
113/2006).
La colección de las crías se hizo con el apoyo de
los miembros del proyecto Pé-de-Pincha (UFAM),
que seleccionaron al azar los nidos. Los nidos
fueron trasplantadas a un lugar conocido como “el
vivero”, protegido por la comunidad local. Para
evitar la mezcla de las crías de diferentes nidadas,
los nidos fueron separados unos de otros por
pequeñas vallas.
Una vez comenzó la eclosión, obtenido a través de
la punción de la vena femoral usando una jeringa
de 1 mL hasta 500μL de sangre. Las muestras se
almacenaron en tubos Eppendorf con 500 ml de
etanol absoluto.
Los animales fueron puestos en libertad en los
sitios donde habían sido recogidos. El total de
nidos y crías por nido se enumeran en la Tabla 1.
La muestra de sangre materna no se
recolectó, por lo que genotipo materno fue
desconocido.
La extracción de ADN se realizó utilizando una
Kit GFX (GEHealthcare), De acuerdo con las
instrucciones del fabricante. La paternidad se
analizó mediante el uso de seis loci de
microsatélites diferentes para cada ubicación. Para
las crías del río Amazonas, Barreirinha-AM,
cuatro de los primeros pares utilizados para la
amplificación de ADN fueron inicialmente
desarrollados para la amplificación de ADN
para P. unifilis por Fantin et al. (2007), el
quinto fue desarrollado para P. expansa por

Figura 1. Mapa que muestra la ubicación de los sitios Barreirinha y Tapauá para los nidos de
Podocnemis sextuberculata estudiados en el presente trabajo.
 Tabla 1. Número de alelos maternos inferido / número de alelos para cada locus se encontró en nidos de
Podocnemis sextuberculata. Los alelos maternos se infiere por la presencia de homocigotos jóvenes, y
los resultados en negrita indican la presencia de aporte extra de par.

Número de
Nido Método simple de conteo alélico
Crías

Número de
hermano completo
familias

Sites Jr. et al. (1999) y el último fue
desarrollado para P.expansa por Valenzuela
(2000). Para individuos de la Reserva
Biologica Abufari, Tapaúa- AM, los seis
primeros pares fueron desarrollados por
Fantin et al. (2007). Las reacciones en cadena
de la polimerasa de genotipo (PCR) siguió el
protocolo económico descrito por
Schuelke(2000). Todos los loci se
amplificaron en condiciones idénticas de
termociclado, que fueron ajustados para un
volumen total de 11 μL que contenía 3,7 μL
H 2 O, 1,0 μL de 10X tampón de PCR con
(NH 4 ) 2SO 4 ( Fermentas), 1,5 μL MgCl 2
( 25 mM), 1,0 μL Del primer inverso (2 μM),
0,5 μL primer directo (2 μM), 0,5 μL 6-FAM
etiquetado M13 primer etiqueta (2 μM), 1,5
μL de mezcla de dNTP (0,2 mM cada uno),
0,3 μL LGC Biotecnología Taq ADN
polimerasa (1 U / l), y el ADN 1! l (10 ng).
La temperatura de desnaturalización inicial
fue de 94 o C durante 1 min, seguido por 25
ciclos a 94 o C durante 30 s, 55 o C durante
30 s, Cy 68 o C durante 30 s. Entonces, 20
ciclos a 94 o C durante 30 s, 50 o C durante
30 s y 68 o C durante 30 s con una extensión
final de 72° C durante 15 min.
Fragmento de ADN amplificados fue
visualizado en gel de agarosa al 1% antes de
la determinación del genotipo.
Los productos de PCR se diluyeron en la
proporción 1:
100, y el marcador de tamaño ROX pUC-19,
modificado a partir de dewoody el tal (2004),
para determinar los tamaños de los alelos
observados.
El genotipo se realizó en el ABI 3730xl DNA
Analyzer, y los análisis de alelos observados
para cada locus se hicieron usando el
programa GeneMapper v.4.0 (Aplicado
Biosystems).
Se calcularon las heterocigosidades por locus
observadas y esperadas para cada locus con
Arlequin 3.1 (Excoffier et al.2005). A fin de
determinar la probabilidad por Weir (1996) se
utilizó. La probabilidad de exclusión de
paternidad (Q) es el parámetro basado en la
exclusión de varios machos complicados en
cada nidada, que estadísticamente puede ser
distinguido
A través de este parámetro, el progenitor
masculino más probable no ser descubierto,
aunque es posible excluir los progenitores
masculinos probables en la población
estudiada.
Los valores de exclusión de paternidad más
cercanos a 1 proporcionan una mayor
confianza para excluir correctamente a un
individuo de la paternidad. La probabilidad
de que dos individuos no relacionados
presenten el mismo el genotipo se calculó
mediante el método de identidad genética (I)
descrito por Paetkau et al. (1995).
Considerando todos los loci analizados
juntos, la probabilidad de exclusión de
paternidad (QC) (Weir 1996) y la
probabilidad conjunta de identidad genética
(IC) también se analizaron.
El análisis de paternidad se realizó de
acuerdo con el Método Mínimo de recuento
de alelos (Myers y Zamudio 2004), que
presupone una distribución mendeliana de los
alelos en la progenie. Cuando los dos alelos
maternos son locus muestreado entre las crías
de cada nido se considera indicativo de la
paternidad múltiple.
Dado que uno o más descendencia
homocigoto se observa en un solo nido, es
posible estimar el alelo materno y los
restantes se cuentan como la contribución
paterna. En tales casos, la presencia de tres
alelos diferentes en un locus dado indica
múltiple paternidad.
Desafortunadamente, el método de mínimo
de conteos de alelos no proporciona el
número real de contribuir a los padres a la
descendencia, ya que este método no
distingue múltiples pares con alelos comunes.
Por lo tanto, para estimar el número más
probable de contribuir machos, se utilizó el
programa informático Kinalyser (Berger-
Wolf et al. 2007), que realiza un análisis
multiloci con el propósito de la estimación de
la relación entre hermanos medio lleno y en
el mismo nido, atribuyendo la paternidad e
inferir sistemas de apareamiento (poligámica
/ monogámicos). La inferencia de las familias
de hermanos completos es posible incluso sin
conocer el genotipo de los padres, ya que este
programa utiliza la información de la
distribución de alelos en loci múltiples, entre
los individuos de cada nidos.
Resultados
El número de alelos por locus varió de 1 - 8,
con un promedio de 7,5 ± 2,8 alelos por
locus. Heterocigosidad observada varió de
0.2297 (Puni_1D9) a 0,9500 (Puni_2A9)
(Tabla 2). La probabilidad de que dos
individuos no relacionados que presenta el
mismo genotipo (IC) fue 1,29 x 10- 6, y la
probabilidad conjunta de exclusión a través
de todos los loci ( QC) fue 99,27% (Tabla 2).
Tomados en conjunto, IC y QC proporcionar
evidencia para alta potencia para detectar la
paternidad múltiple utilizando estos loci para
P. sextuberculata.
El número de alelos por locus dentro de cada
nido varió de uno (nidos 3, 6, y 7) a ocho
(Nido 10) (Tabla 1).
Basado en el método mínimo de recuentos de
alelos, paternidad múltiple se encontró en 7
de los 12 nidos analizados (Nidos 1, 2, 5, 7,
8, 9, y 10) (Tabla 1). Al contar fue utilizado
con la deducción del alelo materno, todos los
nidos, excepto Nido 12, mostraron al menos
dos machos que contribuyen a la
descendencia. Un mínimo de dos
progenitores masculinos contribuyó a nidos
de 1, 3, 4, 5, 6, 7, y 9; al menos tres machos
contribuyeron a los nidos 2 (Puni_2E7) y 8
(Puni_B1 y Puni_2E7); y al menos cuatro
machos contribuyeron a la descendencia en el
Nido 10 (Puni_2E7); los uso del programa
KINALYSER (Berger-Wolf et al. 2007)
refuerza la contribución fuera de la pareja por
medio de la inferencia de más de una familia
de medios hermanos de cada nido analizados
(Tabla 1).
Tabla 2. Número de alelos, heterocigosidad observada ( Ho), heterocigosidad esperada ( Él), la probabilidad de
exclusión de paternidad ( Q) y la probabilidad de identidad ( YO) de los loci de microsatélites 6 utilizado en el P.
sextuberculata Prueba de paternidad.
Lugar Número de
alelos
Discusión
Paternidad múltiple es un sistema de
apareamiento común en las poblaciones
naturales de reptiles como las tortugas.
Muchos estudios de tortugas marinas (Harry
y Briscoe 1988, Parker et al. 1996,
FitzSimmons 1998, Bollmer et al. 1999,
Kichler et al. 1999, Crim et al. 2002, Hoekert
et al. 2002, Moore y la bola de 2002, Irlanda
et al. 2003, Lee y Hays de 2004, Jensen et al.
2006, Zbinden et al. 2007) han demostrado la
clara presencia de paternidad múltiple.
Referencia
Sin embargo, hay pocos estudios sobre los
sistemas de apareamiento de las especies de
agua dulce.
La existencia de paternidad múltiple ya ha
sido reportado en el río del Amazonas la
tortuga Podocnemis (P.expansa: Valenzuela
2000;P. unifilis:Fantin et al. 2008; P.
erythrocephala: Fantin et al. 2010).
Valenzuela (2000) de 100% múltiple
paternidad en 2 nidos de una P. expansa la
población de Colombia usando ocho loci
microsatélites. Pearse et al. (2006) estudiaron
la misma especie que Venezuela utilizando
siete loci microsatélites y sólo se encuentra
10,3% paternidad múltiple en 32 nidos. La
gran diferencia en la tasa de paternidad
múltiple entre estas poblaciones sugiere que
puede haber variación en los patrones de
paternidad entre el tamaño de muestra muy
pequeño en el estudio anterior.
La variación en la frecuencia de paternidad
múltiple también se ha demostrado en
estudios del sistema de apareamiento de las
poblaciones de tortuga marina incluyendo
Chelonia mydas ( 92%: Alfaro-Núñez et al.
2015; 61%: 75%: Pearse et al. 2001; Lee y
Hays 2004; 9%: FitzSimmons 1998) y
Caretta caretta ( 31%: Moore y la bola 2002;
33%: Harry y Briscoe 1988), así como
Tortuga de agua dulce, Chrysemys picta (
0%: McTaggart 2000; 13%: Pearse et al.
2001; 33%: Pearse et al. 2002).
Algunos autores sugieren que la tasa de
paternidad múltiple se encontró en las
poblaciones diferentes factores, una escasez
tal de recursos, que es probable que reduzca
la densidad de población y por lo tanto el
número de cópulas (ENGQVIST 2011). A
mayor densidad, hay más posibilidades de
encuentros que resultan en el apareamiento
(Taylor et al. 2014). La proporción de sexos
también será un factor importante;
poblaciones con proporciones de sexos
hombres sesgada son más propensos a
presentar múltiples paternidad (Crim et al.
2002).
Teniendo en cuenta la situación vulnerable de
PAG. sextuberculata poblaciones, los
estudios genéticos que se centran en el
comportamiento reproductivo de esta especie
contribuyen en gran medida a la creación de
programas de conservación de esta especie y
su gestión adecuada. Este último debe tratar
de aumentar el número de hombres que
potencialmente fertilizar los huevos (Alfaro-
Núñez et al. 2015), para proporcionar
mayores tasas de paternidad múltiple y en
consecuencia para mantener o aumentar
intrapoblacional variabilidad genética (Sugg
y Chesser 1994, Chesser y Baker 1996).
En nuestro estudio, se analizaron los datos de
microsatélites de seis loci utilizando el
Método mínimo de conteos de alelos (Myers
y Zamudio 2004) y KINALYSER (Berger-
Wolf et al. 2007). El objetivo fue analizar un
número estándar de crías por nido (que varía
de 8 a 12 individuos), con el fin de minimizar
o neutralizar el efecto potencial de tamaño de
la muestra sobre la tasa de paternidad
múltiple encontrado. Para resolver
incertidumbres tales como la presencia de
múltiples pares con alelos comunes, se utilizó
loci de microsatélites altamente polimórficos.
Cuando se compara con los estudios
anteriores sobre el género Podocnemis,
estudiamos un mayor número de loci de
microsatélites (9 loci través de los dos sitios
de estudio), que se considera adecuado, y
determinar la frecuencia de paternidad
múltiple en P. sextuberculata, de acuerdo con
los cálculos de probabilidad tanto para IC y
QC.
Concluimos, pues, que la paternidad múltiple
está presente en P. sextuberculata en la
mayoría de los nidos de las dos poblaciones
estudiadas. Se observó el mismo patrón de
comportamiento de apareamiento en las dos
poblaciones estudiadas, sin embargo, los
datos ambientales que permitiría la
comparación entre no se recogieron
localidades tales como temperatura de la
arena y la frecuencia de precipitaciones.
Este estudio sugiere que las estrategias de
manejo y conservación de P. sextuberculata
poblaciones deben tener en cuenta el sexo
operativa paternidad múltiple. Nuevos
estudios centrados en otras especies del
género y en diferentes poblaciones de esta
especie va a ser muy útil para dilucidar las
estrategias para el mantenimiento del
rendimiento reproductivo saludable en
tortugas de río.
Expresiones de gratitud
Agradecemos a proyecto de tortugas “Pe-de-
Pincha” para ayudar con la recolección de
muestras. Esta investigación fue apoyada por
subvenciones # 557090 / 2005-9 (I. Farías
PPG7 /

CNPq; T. Hrbek - fondos de puesta en
marcha de la Universidad de Puerto Rico-Río
Piedras). Este estudio forma parte de un
Ph.D. tesis presentada por Cleiton Fantin en
el Programa de Biotecnología de la
Universidad Federal del Amazonas; C. Fantin
fue apoyado por una Ph.D. beca de la
SUFRAMA
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