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MICROBIOLOGÍA I

INFORME DE LABORATORIO II

TEMA:

Medios de cultivo y técnicas de siembra

Salomé Paredes

Darwin Quilumbaquín

Andrea Tafur

Tatiana Wampash

GRUPO #1/3 NIVEL

ING.BIOTECNOLOGIA DE LOS RECURSOS NATURALES

29/05/2018

Quito- Ecuador
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INTRODUCCIÓN:

Los medios de cultivo es uno de los procedimientos que realizamos en esta práctica de

microbiología

Un cultivo es una técnica de laboratorio que consta de un gel o una solución que contiene los

nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el

crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas.

Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones generalmente

se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados

pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido.

También se considera como

Una solución acuosa en donde se encuentran disueltas sales minerales que aportan los

elementos esenciales Macronutrientes (N, P, K, S. Ca y Mg) y Micronutrientes (Fe, B, Mn,

Zn, Cu, Mo, y Co). Normalmente es imprescindible una fuente de carbono, generalmente la

sacarosa, debido a la escasa actividad fotosintética de los tejido in vitro. Además, el medio

puede ser enriquecido con Aminoácidos, Vitaminas y Reguladores del Crecimiento. Los

medios de cultivo se preparan a partir de soluciones concentradas 10 o 100 veces (Soluciones

Madre o Stock). En la solución madre se pueden mezclar varias sales minerales siempre que

no se produzcan problemas de precipitación. (Murashige y Skoog, 1962)

OBJETIVOS

General
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Realizar un medio de cultivo para el desarrollo de los microorganismos in vitro con los

diferentes materiales encontrados en el laboratorio de microbiología.

ESPECIFICOS:

- Aplicar el método aséptico de siembra y comprender la importancia del mismo.

- Observar las diferencias morfológicas que existen entre las colonias bacterianas de la misma

especie, de diferentes especies y sembradas en diferentes medios de cultivo.

- Conocer las diferentes condiciones en las que se cultivan las bacterias, dentro de esto, conocer

los diferentes tipos de medios de cultivos que se utilizarán en el transcurso del curso y entender

su aplicabilidad.

- Obtener un cultivo puro de diferentes microorganismos para el proceso de identificación de


los mismos.

MARCO TEÓRICO

PARTE I: MEDIOS DE CULTIVO

El cultivo de microorganismos requiere de medios apropiados que cumplan con requisitos

nutricionales específicos para su desarrollo. Un medio de cultivo es una solución de varios

nutrientes requeridos por los microorganismos. Dentro de los requerimientos básicos están:

agua, carbono, energía, nitrógeno, minerales, factores de crecimiento y concentración de ion

hidrógeno.

Los medios de cultivo utilizados en microbiología se los puede clasificar de acuerdo a las

siguientes características.

1. Consistencia:

• Medios de cultivo sólido: Hechos con una concentración de polisacárido solidificante

extraído de algas rojas al 1.5% (Agar). Ejemplo: Agar Sangre, Agar McConkey, TSI.
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• Medios de Cultivo semisólido: con una concentración de agar al 0.7%. Ejemplos:

Medio SIM.

• Medios de Cultivo líquidos: no contienen agar y son los llamados caldos nutritivos como

BHI (Brain Herat Infusión), Caldo nutritivo, etc.

2. Selectividad de Crecimiento:

• Medios enriquecidos: Son capaces de promover el crecimiento de una amplia variedad

de microorganismos, tanto Gram positivos como Gram negativos. Ejemplo: Agar Mueller

Hinton, Agar Sangre, Agar Chocolate.

• Medios Selectivos: La adición de distintos componentes al medio le da selectividad

sobre un grupo de bacterias. Ejemplo: Agar McConkey, en el cual la adición de sales biliares

y cristal violeta inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, haciéndolo selectivo para el

aislamiento de Enterobacterias.

• Medios específicos: diseñados para el aislamiento e identificación de microorganismos

específicos. Ejemplo: Medio TCBS para Vibrio cholerae.

• Medios diferenciales: Diseñados para la identificación de diferentes grupos de bacterias

de acuerdo a sus propiedades metabólicas. Ejemplo: Agar Sangre en la identificación de Gram

positivos de acuerdo a la capacidad de las bacterias de producir hemólisis parcial o total.

CONDICIONES DE CRECIMIENTO: El crecimiento de un cultivo bacterias depende en gran

medida de los requerimientos nutricionales y metabólicos de la bacteria en estudio, así como

de diversas condiciones ambientales necesarias por cada microorganismos.

Disponibilidad de Oxigeno:

• Cultivo Aerobio. Utilizado en la identificación de la mayoría de bacterias patógenas.

• Cultivo Anaerobio: De gran utilidad en la identificación de anaerobios estrictos como

Clostridum botulinum
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• Cultivo con microambiente de CO2: Usado para el crecimiento de bacterias

microaerófilas, especialmente Gram positivos. Con este fin se utilizan dispositivos

especialmente diseñados como la Jarra Gaspack.

Temperatura: La temperatura óptima de la mayoría de microorganismos patógenos es 37ºC.

Sin embargo existen bacterias que logran un crecimiento óptimo a temperaturas mayores o

menores.

pH: Controlado en el mismo medio por sistemas tampón. Impiden que los productos del

metabolismo bacteriano inhiban el crecimiento de los microorganismos cultivados.

INDICACIONES GENERALES PARA LA REALIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

1. Pesa en la balanza la cantidad exacta de medio requerido para el volumen que planeas

preparar.

2. Coloca el medio de cultivo en un erlenmeyer, y afora con agua destilada hasta llegar al

volumen deseado.

3. Cubre el cuello del envase con papel aluminio.

4. Recuerda que el volumen que prepares no debe exceder el 70% de la capacidad total del

envase.

5. Disuelve completamente el medio. Puedes utilizar el horno microondas durante algunos

minutos para asegurarte de que tu medio está completamente disuelto.

6. Autoclava el medio

7. Una vez autoclavado, deja enfriar el medio hasta que sea tolerable al tacto.

8. Rotula las cajas Petri y colócalas en grupos de 3-5 cajas.

9. Desinfecta el mesón de trabajo con abundante alcohol.

10. Enciende el mechero y procede a repartir el medio.

11. Al acabar cada grupo de cajas, flamea el cuello del envase.


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12. Trabaja siempre junto al mechero y evita hablar cuando repartas medio.

PARTE II: MÉTODOS DE SIEMBRA

Cuando se transfiere microorganismos de un medio a otro se denomina subcultivo. Esta técnica

es básica y se utiliza de rutina para preparar y mantener cultivos, así como para realizar

procedimientos microbiológicos.

Los microorganismos están siempre presentes en el aire y en la superficie de los mesones de

laboratorio y pueden ser causa de contaminación externa de nuestros cultivos. Para evitar esto,

es esencial utilizar el método aséptico de transferencia de microorganismos.

Técnica de estriado: Esta técnica permite el aislamiento del microorganismo de interés en un

medio de cultivo selectivo y diferencial. Esto se consigue estriando un inóculo sobre la

superficie del medio de cultivo sólido con ayuda de un asa de inoculación. Los

microorganismos son esparcidos y su concentración en el asa decrece, tanto que puede crecer

una sola colonia aislada en las últimas estriaciones. Durante la técnica de estriación, la densidad

celular disminuye, dando lugar a que células individuales se depositen de forma separada en la

superficie del medio del agar. Si las células que se han aisladas correctamente, crecen solo

colonias que pertenecen al tipo celular original.

PATRÓN DE CRECIMIENTO EN LOS MEDIOS DE CULTIVO

Reconocer diferentes morfologías de crecimiento de las bacterias en medios de cultivo es un

paso usualmente crucial en los procesos de identificación de microorganismos. Las bacterias

muestran a menudo distintas morfologías, color y textura en medios de cultivo. Las categorías

básicas de crecimiento incluyen, forma de la colonia, forma del margen, elevación, color y

textura.
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La forma de las colonias puede ser descritas como circulares, irregulares o puntiformes. El

margen puede ser entera (liso, sin irregularidades), ondular (ondulado), lobulada (lóbulos),

filamentosa, o rizoide (ramificado como raíces).

De acuerdo a la elevación de las colonias, se incluyen plana y elevada, convexa, pulvinado

(muy convexa), y umbonate (elevada en el centro). La textura de la colonia puede ser húmedo,

mucoso, o seco. La producción de pigmentos es otra característica útil y se puede combinar con

propiedades ópticas tales como opaco, translúcido, brillante o mate.

MATERIALES
CANTIDAD
DESCRIPCION
POR CURSO POR GRUPO
Asa de siembra 10 2
Hisopos estériles 5 frascos (25 1 frasco
hisopos c/u)
Cetrimide agar (en caja petri) 10 2
Mueller Hinton Agar 10 2
MacConkey Lactosa Agar 10 2
Manitol Salado Agar 10 2
EMB Agar 5 1
Aspersor con alcohol al 70% 5 1
Cepa Pseudomona aeruginosa en caja con Agar 2
nutritivo.
Cepa Pseudomona aeruginosa en caja con Agar 2
Cetrimida.
Cepa S.aureus en caja con agar nutritivo 2
Cepa S.aureus en caja de Agar Manitol. 2
Cepa S.aureus en caja de Agar sangre 2
Cepa Klebsiella en caja con agar nutritivo 2

Cepa Klebsiella en caja con MacConkey Lactosa 2

Agar
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Cepa Salmonella en caja con agar nutritivo 2

Cepa Salmonella en caja con MacConkey 2

Lactosa Agar

Cepa S.epidermidis en caja con agar nutritivo 2

Cepa S.epidermidis en caja con agar manitol 2

salado

Cajas de fósforos 2

REACTIVOS
CANTIDAD
DESCRIPCION
POR CURSO POR GRUPO
Alcohol al 70% Necesario para Necesario para
los aspersores los aspersores

EQUIPOS
CANTIDAD
DESCRIPCION
POR CURSO POR GRUPO
Incubadora a 37C 1
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PROCEDIMIENTO
Método de siembra

 Observe el diagrama en el que se describe el método aséptico de agotamiento por

estriación (Ver figura 1). Utilizando este método realice la siembra desde los cultivos

de Pseudomona, Salmonella, Klebsiella, S.aureus, S.epidermidis como se describe a

continuación.

Microorganism MacConk Muell Cetrimi Manit EM Aga

os ey Lactosa er Hinton da ol Salado B r

sangre
(MKL) (MH) (MS)

Pseudomona X

S.aureus X X X X

S.epidermidis X

Salmonella X X

Klebsiella X X

 Observe detalladamente los cultivos bacterianos que se les proporcionarán así como los

medios estériles con los que va a trabajar (Mueller Hinton, MKL, Cetrimida, EMB y

Manitol Salado).

 Tomar la caja con el cultivo bacteriano que va a utilizar.

 Marcar e identificar las cajas/tubos a los que va a transferir, poner número de grupo,

fecha y microorganismo utilizado.


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 Tomar un hisopo estéril y realizar el inóculo primario, luego con el asa de metal estéril

realizar el inóculo secundario, terciario y cuaternario.

 Esterilizar el asa luego de casa inóculo y proceder a realizar la siembra según lo indicado

en los diagramas utilizando el método aséptico

 Una vez finalizada la transferencia, esterilizar el asa y colocarla en un lugar seguro.

 Incubar a 37 grados centígrados por 18-24 horas.

 Asegúrate que las tapas de las cajas petri estén hacia abajo.

 Observar los resultados al día siguiente y graficar en la tabla de resultados.

Figura 1 Método de siembra por estrías en medios de cultivo sólidos.


Fuente: Leboffe.J y Pierce.E., 2011.

Figura 2 Técnica de agotamiento por estriación.


Fuente: Leboffe.J y Pierce.E., 2011.
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Figura 3 Medio de cultivo estriado correctamente.


Fuente: Leboffe.J y Pierce.E., 2011.

RESULTADOS ESPERADOS
Se identificará la diferencia entre los medios de cultivo utilizados, y el crecimiento o

inhibición de cada microorganismo en los mismos de acuerdo a su composición. Basándose en

la literatura los resultados esperados corresponden a:

 Salmonella: presenta crecimiento en MH, MKL.

 Klebsiella: presenta crecimiento en EMB, MKL.

 S.aureus: presenta crecimiento en MS, MH.

 Pseudomona: presenta crecimiento en Cetrimida.

 S.epidermidis: presenta crecimiento en MS.

Adicionalmente en los medios de cultivo que se presente crecimiento se identificará las

características morfológicas de las mismas de acuerdo a lo establecido en el marco teórico.

Se evaluará si se realizó correctamente el método de aislamiento de microorganismos, por

medio de la identificación clara de cada uno de los inóculos realizados durante la siembra.
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CONCLUSIONES

 El desarrollo de colonias formadas a partir de las diluciones seriadas presenta

características que difieren en forma, borde, elevación, superficie y estructura interna,

lo cual es notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del

medio en el cual dichas colonias se desarrollan.

 El crecimiento de un cultivo bacterias depende en gran medida de los requerimientos

nutricionales y metabólicos de la bacteria en estudio, así como de diversas condiciones

ambientales necesarias por cada microorganismos.

 El cultivo de Salmonella obtuvo más concentración de colonia, es decir obtuvo un

crecimiento bacteriano elevado.

 Se pudo observar diferencias morfológicas de las siembras de las mismas especies.

RECOMENDACIONES

Para conocer los diferentes tipos de cultivos de bacterias es necesario tener todos los

medios de cultivos, ya que por falta de cultivo no se pudo realizar una siembra, en este

caso la seudomona.

También es necesario hacer las practicas con sus debidos implementos para empezar la

actividad, para evitar el contacto con los medios de cultivo.


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Bibliografía
MURASHIGE, T. ; SKOOG, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with

tobacco tissue cultures. Physiol. Plant, 15: 473-497.

NAVARRO, L. 1979. Microinjerto de ápices caulinares in vitro para la obtención de

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Prescott, Lansing M. Harley, John P. Klein, Donald A. (2009). Microbiología. Mc Graw Hill
Interamericana. Madrid. España.
Madigan M., Martinko, J. Parker J. (2007). Brock Biología de los Microorganismos. ISBN:
84-486-0261-7. Pentice-Hall. Madrid. España.
Leboffe.J y Pierce.E. (2011). A photographic Atlas for the Microbiology Laboratory. 4th
edition. MORTON. USA.
Merck (2012). Microbiology Manual. 12th Edition.
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