TEMA: DIVERSIDAD MICROBIOLOGICA DEL LODO ANAEROBIO DURANTE EL TRATAMIENTO DE

AGUAS DE PRODUCCION PETROLERAS VENEZOLANAS

RESUMEN

En esta investigación se compararon las abundancias microbianas presente en el lodo granular

de dos reactores anaerobios de manto de lodo con flujo ascendente (UASB); el primero
alimentado con aguas de producción de petróleo liviano (331.1 – 39.0ª API) provenientes de la
región zuliana (Venezuela) (APP) y el segundo de glucosa. En tal sentido se monitorearon las
poblaciones de bacterias fermentadoras de glucosa (BFG, bacterias acetogenicas (BAC)
metanogenicas (MET), bacterias sulfato – reductoras (BSR), bacterias nitrato – reductoras (BNR)
y heterótrofos, usando medios de cultivo selectivos. La densidad de los grupos microbianos
estuvo relacionada con los parámetro fisicoquímicos; PH, alcalinidad total, DQO,SO4,NO3; así
como los porcentajes de CH4 CO2 y de N2 en el biogás. Los resultados se exhiben diferencias
significativas entre la diversidad microbiana ambos reactores, con un proporción de
BFG>BSR>MET>BAC>BNR para el reactor con glucosa y de MET>BNR>BAC>BSR>BFG para las
APP .La abundancia de bacterias en el reactor con glucosa estuvo en el orden 108, mientras que
en el reactor con APP fue de 105 lo cual resulta de la composición orgánica mineral de los
afluentes. El resultado presentado aporta evidencias sobre la dinámica poblacional en lodos de
reactores anaerobio UASB durante el tratamiento de aguas de producción petrolera.

INTRODUCCION

Venezuela es uno de los países con las mayores reservas mundiales de petróleo. La preocupación
de la industria petrolera venezolana por el tratamiento y reutilización de dichas agua promueve
la búsqueda constante de tecnologías que proporciones alternativas viables para la degradación
de los contaminantes contenidos en ellas, entre los que se encuentran metales, hidrocarburos
fenoles, etc. lo mismos que impactan gravemente el ambiente.

La digestión anaerobia en reactores de manto de lodo con flujo ascendente (UASB) ha sido
evaluada satisfactoriamente a escala de laboratorio, como una alternativa real para el
tratamiento de estas aguas de producción petrolera mostrando la factibilidad técnica para su
biodegradabilidad anaerobia. Una gran variedad de microorganismos coexisten en el lodo de
estos reactores anaerobios y la combinación apropiada de los mismos es necesaria para una
eficiente transformación de la materia orgánica a gas metano. El objetivo de esta investigación
consistió en comparar las abundancias de los grupos bacterianos presentes en el lodo granular
de reactores (UASB) alimentados con APP y con glucosa (sustrato biodegradable) con la finalidad
de aportar herramientas en la predicción y optimización de la eficiencia de dichos sistemas de
tratamiento.

Desarrollo

Descripción de los reactores UASB

Para los ensayos se utilizaron reactores UASB a escala de laboratorio con un volumen útil de
4000 Ml, inoculados con 1200 mL de lodo granular anaerobio proveniente de un reactor UASB
de una industria cervecera de la localidad. Fueron alimentados a flujo continuo por 60 d
utilizando bombas peristálticas y aplicado un tiempo de retención hidráulica (THR) de 24 h, a
una temperatura de operación de 29+-2 ªC .Durante los primeros 7 d se empleó un afluente
sintético, preparado con glucosa (1 g/L)como fuente de carbono .Luego de este periodo de
aclimatación uno de los reactores se aliento con APP provenientes de la extracción de petróleo
liviano(31.1 39.9ª API) las cuales contenían una demanda química de oxigeno (DQO) de 712.83+-
146.87 mg/L, y el segundo reactores se continuo alimentando con el afluente sintético durante
todo el periodo experimental.

Parámetros fisicoquímicos

Diariamente se monitorearon los siguientes parámetros fisicoquímicos: temperatura, pH,

alcalinidad total y DQO., en efluente de los dos reactores UASB. Tres veces por semana se
analizaron las concentraciones de NO3 y SO4, así como los porcentajes de CH4,N2 y de CO2 en el
biogás .

Preparación de las muestras para análisis microbiológicos

Cuando se observó una estabilidad en los parámetros fisicoquímicos evaluados en los efluentes
finales de los reactores, se procedió a colectar muestras de lodo anaerobio para los análisis
microbiológicos. Se realizaron muestreos simultáneos del lodo ambos reactores cada semana
para un total de 6 muestras. En cada muestreo se recolectaban 3g de lodo anaerobio, de los
cuales se pesó 1 g de mientras para los análisis microbiológicos, este lodo fue homogenizado en
un mortero e inoculado con jeringas estériles y agujas hipodérmicas. Todos los procedimientos
aplicados durante la cuantificación de los grupos funcionales fueron realizados bajo condiciones
anaerobias empleando una cama de atmosfera a una temperatura interna de 35+ -2 ªC.

Cuantificación de los grupos funcionales de anaerobios

Estimándose un grupo probable de microrganismos por cada 100 g de muestra .Loa grupos
funcionales estudiados, así como los medios de cultivo empleados se especifican en la tabla 1.

Tabla 1.Grupos funcionales y medios de selectivos empleados durante la cuantificación de la diversidad

microbiológica del lodo anaerobio

Todos los medio de cultivo inoculados fueron incubados en condiciones anaerobias, el tiempo
de incubación para el conteo de heterótrofos fue de 10 d y para los grupos funcionales de
acuerdo al tiempo requerido por cada grupo.

Articulo Principal.
DIVERSIDAD MICROBIOLOGICA DEL LODO ANAEROBIO DURANTE EL TRATAMIENTO DE
AGUAS DE PRODUCCION PETROLERAS VENEZOLANAS

Discusión y análisis de resultados:

En la tabla 2 se muestran los valores de los parámetros fisicoquímicos evaluados durante la

operación de los reactores UASB. Estos datos muestras que las APP (afluente) no cumplen con
la normativa venezolana para descargas a cuerpos de aguas naturales. El comportamiento de
PH y de alcalinidad total durante el tratamiento fue relativamente estable y dentro de los
rangos adecuados para la biodegradación anaerobia de la materia orgánica contenida en las
APP.

Tabla 2.Valores medios de los parámetros fisicoquímicos evaluados en los reactores UASB alimentados con
glucosa y APP

En la digestión anaerobia de PH en general, amortiguado por el bicarbonato, dependiendo así

de la capacidad buffer expresada en alcalinidad total.

Por lo tanto es posible inferir que la diferencia entre el pH de los efluentes tratados sea debida
la composición de las APP, las cuales tienen una gran capacidad amortiguadora resultante de la
concentración de iones carbonatos y bicarbonatos.

En cuanto a la DQO la concertaciones medias de entrada (Afluente) se ubicaron en 997.18 +-

176.47 y 712.83 +- 146.87 mg/L para los reactores con glucosa y con APP.

Durante el tratamiento se obtuvieron porcentajes medios de remoción de materia orgánica,

medida como DQO de 83 % para la glucosa y de 75% para las APP tomando en cuenta su
compleja composición orgánica que incluye presencia de hidrocarburos aromáticos tóxicos
como el fenol.

Las concentraciones medias finales de DQO fueron 164.33 +- 48.74 y 199.10 +- 81.78 mg/L
respectivamente para los reactores alimentados con glucosa y con APP. Estos valores resultan
inferiores al máximo permisible de 350 mg DQO /L establecidos en la norma venezolana.

En la tabla 3 muestran los porcentajes medios de N2 CH4 y CO2 en el biogás de los reactores
UASB. La proporción de CH4 en el reactor con APP 86% fue mayor que la del reactor que presenta
la glucosa 76% lo cual denota la eficiencia de las fuentes de carbono presentes en las APP.

La producción de N2 fue la menor para la glucosa 8.75 +- 2.68% como respecto a las APP 13.54
+- 3.91 %, lo cual relaciona la abundancia de BNR en virtud de la reducción de NO3 por la vía
desasimilatoria (desnitrificacion) produciendo N2 como producto final.
Tabla 3.Valores medios porcentuales de la producción de nitrógeno metano y dióxido de carbono en los reactores
UASB alimentados con glucosa y APP

Las concentraciones medias de NO3 y SO4 a la salida y entrada de los reactores alimentados
con glucosa y APP así como su porcentaje de remoción durante el tratamiento aplicado se
presentan en la tabla 4.

El reactor APP mostro una alta remoción de NO3 (99.08 +- 0.27%) , mientras que el SO4 fue
removido más eficientemente en el afluente de la glucosa (47.69 +- 9.33%).

El orden de la abundancia de los grupos funcionales fue mayor par al glucosa 108 que par las APP
105 lo cual pudiera ser un indicativo de la inhibición del crecimiento debido a la presencia de
compuestos tóxicos en las APP.

Tabla 4.Distribucion porcentual de los grupos funcionales presentes en el lodo anaerobio de los reactores UASB
alimentados con glucosa y APP; BFC: bacterias fermentadoras de glucosa, BAC: bacterias acetogenicas, MET:
metanogenesis, BSR: bacterias sulfato-reductoras, BNR: bacterias nitrato – reductoras.

La abundancia de BAC fue de 10 y 9 % para los afluentes de la glucosa y APP. Los MET
representaron 57% para las APP y 10 5 para la glucosa .Estos resultados demuestran la eficiencia
de esto microorganismos en al utilización de productos hidrocarbonados presentes en las APP
como fuentes de carbono par su bioconversión a CH4 .Los BSR por su parte presentaron una
porción de 6% en las APP mientras que en el reactor alimentado con glucosa se ubicó en un 14%
.Las densidades poblacionales de BNR fueron de 27 y 5 % para los reactores con APP y glucosa
respectivamente. La producción de N2 fue de 13.54 +- 3.91 y 8.75 +- 2.68% para APP y glucosa.

Muestra los resultados del contero de heterótrofos anaerobios ACP fueron de 106 y 107 (glucosa
y APP) influye significativamente en el criamiento poblacional.

Artículo 2. Tratamiento anaerobio para la remoción de compuestos fenólicos e hidrocarburos

saturados

Materiales y métodos
Etapas de la investigación

Montaje del reactor UASB. Se utilizó un reactor con capacidad efectiva de 4 litros, acoplado con
un cilindro para colectar el biogás producido en el tratamiento. Fue inoculado con 1,2 litros de
lodo anaerobio tipo granular, extraído de un reactor del mismo tipo, utilizado para degradar
aguas residuales cerveceras. El reactor se montó en uno de los corredores laterales del DISA,
operando a temperatura ambiente; las variaciones de temperaturas exteriores estuvieron entre
27°C y 36°C, no hubo necesidad de colocar chaqueta de calentamiento al reactor. Las muestras
se preparaban semanalmente y se almacenaban en una cava refrigeradora a 4°C para su
conservación antes de su utilización.

Etapa de aclimatación del lodo biológico. El caudal de alimentación del agua residual fue de 2,78
mL/min, correspondiente a un TRH = 1 d (tiempo de retención hidráulico fijado para el estudio).
Luego de cuatro semanas de alimentar el reactor con solución nutriente mostrada en la Tabla 1,
se incorporaron los compuestos tóxicos al agua, variando la concentración de cada compuesto
fenólico desde 5 hasta 20 mg/L, incrementando a razón de 5 mg/L por cada semana de
funcionamiento del reactor, de manera que la biomasa pudiera aclimatarse a su presencia sin
sufrir trastornos; los hidrocarburos saturados fueron incorporados al agua residual a la
concentración de trabajo (20 mg/L).

Tabla 1. Composición nutricional del agua residual sintética

*Proporciona una DQO = 1.011 mg/L.

El esquema seguido para la incorporación de los compuestos tóxicos al agua residual, se muestra
en la Tabla 2. La etapa de aclimatación se consideró terminada una vez las condiciones del agua
a la salida del reactor UASB se mantuvieron relativamente estables (entendiéndose como
estabilidad que la remoción de materia orgánica, medida como DQO, permanece constante en
5 días consecutivos), lo cual ocurrió 16 semanas (112 días) después de haberse iniciado la
alimentación.

Tabla 2. Esquema seguido para la incorporación de compuestos tóxicos al agua residual y su influencia en la variación de la
Carga Orgánica Volumétrica aplicada al reactor UASB

* Para efectos de un mejor análisis, se designan las letras (a) a la (i) a los períodos en los cuales
se cambia la composición del agua residual mediante la adición de un nuevo componente o al
cambio en la concentración de los componentes previamente adicionados.

Tratamiento anaerobio del agua residual sintética. Una vez aclimatado el lodo, se continuó la
alimentación con el agua residual preparada según la composición nutricional de la Tabla 1 y
conteniendo 20 mg/L de cada tóxico mostrado en la Tabla 2. Diariamente se tomaron muestras
a la salida del reactor, para monitorear su comportamiento; así mismo se verificó la producción
de biogás durante el proceso. La operación del reactor UASB con el lodo aclimatado, comenzó a
partir de la semana 17 y se mantuvo hasta las 30 semanas.

Parámetros fisicoquímicos evaluados durante el estudio

Potencial de hidrógeno (pH). Su determinación se llevó a cabo siguiendo la metodología del
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (SM) [10] número 4500-H+ B
Método Electrométrico.

Alcalinidad total. Se determinó aplicando el método SM 2320 B Método Titulométrico [10].

Demanda Química de Oxígeno (DQO). Para su determinación se siguió la metodología SM

número 5220 C Método Titulométrico, Reflujo Cerrado [10].

Compuestos fenólicos. Su determinación se llevó a cabo aplicando la técnica de cromatografía

líquida de alta resolución con sus siglas en inglés HPLC, utilizando un cromatógrafo líquido
Hewlett Packard HP 1050, equipado con detector DAD modelo 1100, una columna C18 Hewlett
Packard Spherisorb con dimensiones de 125 × 10 mm y 5 µm de diámetro interno. El manejo de
los datos se realizó con el software HP ChemStation para LC Rev. A. 06. 01. 403. Como fase móvil
se usó una mezcla de Acetonitrilo-Isopropanol-Agua en proporción 28,5%:66,5%:5%. Las
longitudes de onda óptimas para la lectura de cada fenol fueron: fenol, 270,8 nm y 2-clorofenol,
2-nitrofenol y 2,4-dimetilfenol, 279,8 nm. Se aplicó un flujo isocrático de 0,8 mL/min [11],
resultando un tiempo total de corrida de 5,0 min.

Hexano y heptano. Su determinación fue realizada aplicando la técnica de cromatografía de

gases, recomendada por el Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater,
sección 6200, para el análisis de compuestos orgánicos volátiles [10]. Se usó un cromatógrafo
Agilent 6890 series GC System, operando bajo las siguientes condiciones: Horno a 40°C por 4
min, isotérmico; Inyector en modo split 10:1, a 200°C; volumen de inyección de 2 µL; Detector
de ionización por llama FID a 200°C; Gas de arrastre: helio a 30 mL/min; Columna: HP-5 5%
Phenyl Methyl Siloxane Capillary 30,0 m × 320 µm × 0,25 µm nominal; Flujo: 1,8 mL/min (30
cm/s).

La cuantificación de cada compuesto orgánico tóxico se llevó a cabo a través de la calibración

haciendo uso de estándares externos, trazando curvas de calibración para cada uno,
ajustándolas posteriormente a rectas con ecuaciones de la forma a=mC+b (siendo a el área bajo
el pico en el cromatograma y C la concentración del analito). El límite de detección (LDD) se
calculó mediante el método de regresión lineal [12]. La Tabla 3 muestra los valores de m, b, R2,
LDD y la ecuación utilizada para cuantificar cada compuesto tóxico.

Tabla 3. Valores de m, b y R2 y límites de detección de las ecuaciones ajustadas a la recta del tipo a=mC+b, para cada fenol
Porcentaje de metano en el biogás. Fue determinado aplicando la técnica de cromatografía de
gases, con la ayuda de un equipo Perkin Elmer Autosystem XL Gas Chromatograph, operando
bajo las siguientes condiciones: Horno a 40°C por 15 min, isotérmico; Inyector en modo split
100:1, a 250°C; Volumen de inyección de 200 µL; Detector TCD a 200°C; Gas de arrastre: helio;
Columna: Supel Q-Plot Fused Silica Capillary 30,0 m × 0,53 mm i.d.; Flujo: 3,5 mL/min.

Presentación y Discusión de Resultados

Etapa de aclimatación

El objetivo de esta etapa fue adecuar la biomasa del reactor a la presencia de los compuestos
orgánicos tóxicos, para de esta manera lograr su biodegradación.

El pH del afluente durante la aclimatación se mantuvo entre 7,56-8,32 unidades, mientras que
en el efluente presentó valores entre 5,68-7,63 unidades. Se observó una relativa inestabilidad
en este parámetro, tanto en el afluente como en el efluente del reactor, durante esta etapa. Por
su parte, la Alcalinidad Total del afluente varió entre 360,00-1160,00 mg/L CaCO3, mientras que
el efluente presentó valores comprendidos entre 420,00-868,42 mg/L CaCO3.

El comportamiento de la DQO en el tratamiento puede observarse en la Figura 1. Durante la

aclimatación del lodo biológico, el afluente del reactor UASB presentó valores entre 309,33-
5140,00 mg/L, respondiendo al aumento en la Carga Orgánica aplicada; en el efluente, la DQO
estuvo comprendida entre 10,86-1481,76 mg/L.

Los porcentajes de remoción en la DQO alcanzados en el tratamiento biológico se ilustran en

la Figura 2. En esta Figura puede observarse con claridad la inestabilidad existente en la
remoción de la DQO durante la etapa de aclimatación, debido a que durante esta etapa se
somete al lodo biológico a constantes incrementos en la Carga Orgánica (con valores
comprendidos entre 0,31-5,14 kg DQO/m3d). Sin embargo, los porcentajes de remoción
obtenidos se encuentran, en todos los casos, por encima del 60%.
El comportamiento de los fenoles e hidrocarburos saturados durante el tratamiento se resume
en la Tabla 4. En esta etapa, se observó una inestabilidad en el comportamiento de los
compuestos fenólicos en el efluente del reactor UASB, encontrando por ejemplo, a la salida del
reactor, para el 2-nitrofenol concentraciones entre 1,12 mg/L y 15,76 mg/L. Esto se debe a que
durante la aclimatación, se varían constantemente las concentraciones de cada compuesto
(ver Tabla 2), haciendo variable la respuesta del reactor biológico, en su biodegradación.

Tabla 4. Remoción de compuestos fenólicos e hidrocarburos saturados durante el tratamiento en el reactor UASB

Al final de la etapa de aclimatación las concentraciones de los compuestos estuvieron más

estables encontrándose así, valores promedios de 14,51 mg/L de fenol, 0,38mg/L de 2-
clorofenol, 6,48 mg/L de 2-nitrofenol y 4,56 mg/L de 2,4 dimetilfenol, lo cual permitió considerar
esta etapa como culminada. Así mismo, fue posible comprobar la adecuación del lodo para la
biodegradación de los compuestos fenólicos e hidrocarburos saturados utilizados en el estudio,
a las concentraciones de trabajo, reflejada en la remoción que se logró de cada tóxico por el
tratamiento aplicado.
CONCLUSIONES

La elevada remoción de materia orgánica medida como DQO obtenido para APP (75.77 +- 7.40
%) indica que la digestión anaerobia, media el uso de reactores UASB es un tratamiento viable
para la disminución de fracciones orgánicas la eficiencia de remoción para la glucosa fue de
83.86 +- 4.41 %.

Los resultados muestran diferencias significativas entre las densidades de los grupos
microbianos evaluados en ambos reactores con una proporción de BFG>BSR>MET>BAC>BNR
para la glucosa y de MET>BNR>BAC>BSR>BFG para APP, obteniéndose además una producción
de metano de 86.35+- 3.58% para APP y de 75.64 +- 3.75 % para la glucosa, lo cual evidencia el
dominio de los MET en el reactor alimentado con APP. Las características fisicoquímicas de los
efluentes de los reactores garantizaron el desarrollo de una comunidad microbiana mixta para
degradar los sustratos orgánicos presentes.

La abundancia de los distintos grupos microbianos en el lodo de los reactores estuvo en función
de las características nutricionales de los afluentes (glucosa Vs. APP).de igual manera la
composición de los medios de cultivo empleados determino la magnitud de los heterótrofos
mesofilos anaerobios cuantificados siendo mayor para le agar conteo.

El tratamiento del agua residual en el reactor UASB, con un tiempo de retención hidráulico de
24 horas, no logró una remoción satisfactoria de los compuestos fenólicos ni de la DQO, por lo
cual se requiere la aplicación de un tratamiento posterior que permita alcanzar concentraciones
en el efluente, menores a las permitidas por la legislación ambiental venezolana vigente, para la
descarga a cuerpos de aguas naturales.

Referencias

 Ahring B., Schmidt J., Whinther-Nielsen M., Macario A., Conway

 American Public Health Association
 Booned. Johnson R.Liu Diffusion Of The Interspecies Electron Carries
 Brewer J.A.New Petri Dish And Technique For Use The Cultivation Of On Anaerobes And
Microaerophiles.
 Chen Y Cheng J Creamer Inhibition Of Anaerobic Digestion Process
 Organización Internacional del Trabajo-OIT. Enciclopedia de salud y seguridad en el
trabajo. Ministerio de Trabajo y Asuntos Sociales. Subdirección General de
Publicaciones, 1998.