“Propiedades antibacteriales del extracto

de Stevia rebaudiana contra

enterobacterias.”
Procesos Celulares Fundamentales 18 I.
Grupo BB: 58

Investigación por:
Alejandra Montiel Nava.
Héctor Manuel Reyes Ponce.
Ixin Marcos Cebada Arenas.
Yafah Jayim Martínez Zamora.

Asesoras:
Dra. Gabriela Garza Mouriño.
Dra. Marcela Ivonne Benítez Díaz Mirón.
Dra. María Elena Castellanos Páez.

1
“Propiedades antibacteriales
del extracto de Stevia
rebaudiana contra
enterobacterias.”

2
 Índice.

1.-Abstract…………………………………………………………………………..pág. 4

2.-Resumen………………………………………………………………………...pág. 5

3.- Introducción…………………………………………………………………….pág. 7

4.- Marco teórico…………………………………………………………………..pág.8

3.1.- Enterobacteria
3.2.- Escherichia colli

5.-Materiales y Métodos………………………………………………………….pág.17

6.- Resultados………………………………………………………………….....pág.21

7.- Discusión…………………………………………………………………........pág.22

8.- Conclusión…………………………………………………………………......pág.23

9.- Bibliografía……………………………………………………………………..pág.24

3
Abstract.
The main objective of this investigation, was to prove the antibacterial activity of
Stevia rebaudiana against the enterobacteriaceae E.coli. This paper takes up
information of investigations with Stevia as an antimicrobial alternative. Trough
experimental methods, some investigators are interesting on isolate active
biological compounds of this plant, that can be used to eliminate pathogenic
microorganism.
An extract was made using dried and crushed leaves of Stevia rebaudiana, variety
“Gavia E II”, and using ethanol as solvent. The tested concentrations were: 50
mg.m⁻¹, 100 mg.m⁻¹, 200 mg.m⁻¹. The concentration with better results was the
higher, so that suggest that even more concentrated extracts will be more effective.
This extract was tested against Escherichia coli, bacteria that can be found really
often on the ambient, and cause a variety of clinical diseases. A strain of E. coli
was obtained from water of the “Canal de Nativitas”, located on Xochimilco, Mexico
City, was isolated on the laboratory, later identified through biochemical tests, and
for last subjected to a treatment with the extract of Stevia rebaudiana , to be able to
evaluate the zone of inhibition and with this prove the antimicrobial properties of
Stevia rebaudiana, specifically against E. coli.
The results obtained put on evidence the potential of Stevia rebaudiana to
pharmaceutical use.

Key words: Stevia rebaudiana, Escherichia coli, enterobacteriaceae, antimicrobial,

antibacterial

4
 Resumen.

El principal objetivo de esta investigación, fue comprobar la actividad

antibacteriana de la planta Stevia rebaudiana contra la enterobacteria E.colli, el
cual se realizó llevando a cabo el proceso para la obtención e identificación de
bacterias, así como el proceso de extracción para la hoja seca y pulverizada de la
planta.

Este trabajo de revisión tuvo como objetivo, recopilar información sobre los
estudios realizados a la Stevia como una alternativa antibacteriana.

Se cree que la Stevia rebaudiana inhibe el crecimiento de ciertas bacterias.

Con base a métodos experimentales, investigadores están interesados en aislar
compuestos biológicamente activos de la planta Stevia rebaudiana, para la
eliminación de microorganismos patógenos.

Stevia rebaudiana pulverizada, de la variedad Gavia E ll, pasó por un proceso

para la obtención de Stevia deshidratada y posteriormente se obtuvieron tres
diferentes concentraciones de dicha Stevia seca y Etanol.

Escherichia Coli es una de las especies más relevantes del género Escherichia,
es conocida por ser responsable de una variedad de síndromes clínicos. Existen 4
principales cepas de E.coli causantes de diarrea.

Se realizó la obtención de la cepa de E.coli con agua del canal de Nativitas

Xochimilco, realizando el cultivo en cajas de Petri. Se identificó la bacteria por
medio de frotis y Tinción de Gramm para ser observada en el microscopio. Se
realizaron pruebas bioquímicas para completar la identificación de la bacteria, las
cuales demostraron que era Escherichia colli.

5
Los resultados obtenidos en concentraciones de 50 100 y 200 presentaron una
variación significativa, donde una mostró la mayor actividad contra el crecimiento
de las colonias Escherichia colli.

Palabras clave: Stevia rebaudiana, Escherichia colli, entero bacteria, anti-

microbiano.

6
 Introducción.

En la actualidad hay una constante y necesaria búsqueda de nuevos compuestos

químicos con innovadores mecanismos de acción antimicrobiana. Lo anterior
debido al alarmante aumento en la incidencia de enfermedades infecciosas,
aunado al desarrollo de resistencia por parte de microorganismos patógenos ante
los existentes antibióticos de uso clínico (Rojas et al 2003). Esto ha aumentado el
interés de la industria farmacéutica y la investigación científica en identificar
plantas con propiedades antimicrobianas, con el fin de poder transformarlas en
medicamentos mediante diferentes procesos químicos, para tratar o controlar
enfermedades infecciosas (Cowan 1999). Los principales tipos de compuestos
fotoquímicos que han sido identificados con esta capacidad son los taninos,
flavonoides y fenoles (Dorman 2000).

Una planta que ha sido utilizada durante mucho tiempo con fines terapéuticos, por
comunidades indígenas de Paraguay es, Stevia rebaudiana (Bakar 2014). Hoy en
día esta planta es ampliamente utilizada como edulcorante (Kolb 2009). Pero
también hay considerables investigaciones enfocadas a sus actividades
antimicrobianas, utilizando diversos solventes y métodos de extracción que han
resultado efectivos contra diversos microorganismos (Bakar 2014; Gosh
2008 Sathishkumar 2008; Takahashi 2001). Por lo que continuar identificando las
moléculas y los mecanismos de acción contra microbios presentes en la Stevia,
podría ser de gran utilidad clínica.

7
 Marco teórico.

La Stevia rebaudiana es una planta subtropical herbácea, perenne perteneciente

a la familia de las Asteráceas, que crece en el suroeste de Brasil y Paraguay
(Alfredo et al 2010). La S. rebaudiana tiene hojas elípticas, ovales o lanceoladas
(figura 1).

La flor es hermafrodita, pequeña y blanquecina (Shock et al 1982). La planta es

auto incompatible (protandria) por lo que la polinización es entomófila (figura 2)
(Monteiro et al 1982).

De modo que cobra un alto valor entre los vegetales nativos de otros países, entre
los principales productores de Stevia a nivel mundial son Japón, China, Corea,
Taiwán, Tailandia, Indonesia, Laos, Malasia y Filipinas; todos estos países
representan el 95% de la producción mundial (Tomita et al 1997) debido a que
contiene glucósidos de diperteno bajos en calorías, llamados comúnmente
esteviósidos cuyo poder edulcorante en estado puro puede ser 300 veces mayor
que el azúcar de caña (Álvarez-García et al 2005).

Aunque existe un consenso mundial sobre las ventajas de la Stevia para la salud
humana (Prakash et al 2008) y que su cultivo es un sistema altamente generador
de empleos rurales (Jarma, 2008; Espitia et al 2009), aún existen grandes vacíos
en el conocimiento de esta especie, principalmente en aspectos como la nutrición

8
y las variables ambientales (Gardana et al. 2010) como su relación con la síntesis
de sus moléculas edulcorantes (Jaitak et al 2008).

En efecto las bondades de la Stevia en el metabolismo, han demostrado

(Jeppesen et al.2002;Geuns et al. 2003) efectos positivos en la salud del hombre,
como anti-rotavirus (Takahasaki et al 2001) mejoramiento de la hipertensión
(Hsieh et al 2003) el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2 al estimular la
secreción de insulina actuando sobre las células del páncreas (Jeppesen et al
2002; Reziwanggu et al 2004) como también otras aplicaciones de uso
cosmetológico, mejorador de suelos, suplemento en dietas, entre otros (Jaitak et al
2008).

La composición química completa de las especies de Stevia aún no está

disponible (Goyal et al 2010). Periódicamente se descubren nuevos constituyentes
que van siendo estudiados y descritos en la literatura científica (Wolwer et al
2012).

Mediante estudios experimentales de la Stevia sin refinar, se obtuvieron resultados

que indican, que el extracto de hojas de Stevia actúa como bactericida sobre
Streptococcus mutans, responsable de las caries dentales. Mismo que inhibe el
crecimiento de bacterias, por lo cual se consideran sus propiedades
antibacterianas (Kujur et al 2010) y antivirales.

La mayoría de estudios han sido realizados para bacterias bucales, no

obstante, se han encontrado resultados importantes para el uso del extracto de
Stevia (Soderling et al 2008).

Por lo que se cree que la Stevia inhibe el crecimiento de ciertas bacterias. Algunas
personas incluso afirman que el uso de Stevia ayuda a prevenir la aparición de
enfermedades dentales, de S. mutans que es una bacteria anaerobia facultativa
que se encuentra normalmente en la cavidad bucal humana, formando parte de la

9
placa dental. Se asocia al inicio y desarrollo de la caries dental (Champers et al
2004).
La aplicación de la S. rebaudiana en el tratamiento de entero bacterias, fue
sugerida originalmente a partir de observaciones del efecto bactericida y anti-
rotavirus que se encontró a partir del uso del extracto de agua caliente de la
Stevia. (Tomita et al., 1997) fueron los primeros en reportar un efecto bactericida
de este extracto contra una amplia gama de bacterias patógenas transmitidas por
los alimentos, incluyendo la Escherichia coli, aunque el autor concluye que son
necesarios otros estudios en modelos animales para demostrar este efecto
(Realpe et al 2016).

Ha habido un gran interés en exploración y uso de antimicrobianos naturales,

como es el del extracto de las hojas de Stevia como compuestos de origen
vegetal para tratar diversas enfermedades (Komissarenko et al 1994).

Para la realización de estos estudios anti bacteriológicos, se tiene en común el uso

de hojas deshidratadas de Stevia y distintos solventes como el etanol, metanol y
acetona, dando mayores resultados, al mostrar un halo de inhibición de mm, con
el extracto de acetona y de etanol, aunque también se hicieron pruebas con un
extracto acuoso que mostró nulos resultados en todos los casos (Mohammadi-
Sichani et al 2012).

Por otro lado, también se refiere una baja potencia del esteviósido para esta
actividad por lo que se requiere evaluar otros componentes o derivados de la
Stevia que podrán tener mayor poder (Shiozaki et al 2006).

Con base a los diversos métodos experimentales los investigadores están

interesados en aislar compuestos biológicamente activos de la planta Stevia
rebaudiana, para la eliminación de microorganismos patógenos, debido a la
resistencia que los microorganismos han creado contra los antibióticos (Tepe et al
2005).

10
Un estudio realizado con Stevia contra Streptococcus mutans, (bacteria causante
de caries), fueron utilizados extractos de Stevia, en diferentes solventes y
concentraciones que se muestran en el siguiente cuadro (Tabla 1)(Mohammadi-
Sichani et al 2012)

Mostró que todos los extractos presentan una reacción, dependiente de la dosis
que aumenta con el grado de concentración. Los extractos de metanol, etanol y
acetona fueron muy efectivos contra S. mutans, pero el extracto acuoso no
muestra actividad. (Chatsudthipong y Muanprasat 2009).

Entre los cuatro extractos, el extracto de acetona probado tenía un mayor

potencial antibacteriano seguido de extracto de etanol y luego extracto de metanol.
Puesto que los extractos de acetona y etanol usados en las hojas de S.
rebaudiana mostraron la mayor actividad contra S. mutans, se logró concluir que
los metabolitos activos son más solubles y actúan como sustancias
antibacterianas (figura 3) (Soderling et al 2008).

11
Sobre todo la importancia a investigaciones sobre esta planta y su implicación
farmacológica de sus extractos, concluye en su mayoría, que han sido realizados
para bacterias bucales (figura 4) (Champers et al 2004).

12
Enterobacterias:

Las entero bacterias se ubican taxonómicamente en la familia Enterobacteriaceae,

siendo esta la única dentro del orden de las Enterobacteriales. Ewin y Edwards
(1986) dividen a la familia Enterobacteriaceae tomando en cuenta sus
características bioquímicas en siete tribus: Escherichiae, Edwardsielleae,
Salmonelleae, Citrobacteriaceae, Klebsielleae, Proteeae y Yersinieae. Cada tribu
está compuesta de uno o más géneros ( Pollack et al 1997 ).

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son Gram-negativos, no forman

esporas, son aerobios facultativos y generalmente tienen forma de bacilos (Mahon
et al 1995). Además, crecen óptimamente a 37°C, son oxidasa negativos, catalasa
variables y movilidad variable, cuando es positiva tienen flagelos, excepto
Tatumella (Macffaddin 2000). Crecen fácilmente en medios sintéticos y en medios
selectivos como el agar MacConkey o el agar Hektoen Enterico (HE).

Estos medios contienen uno o más carbohidratos, como la lactosa o la sucrosa,

que muestran la capacidad de las especies para fermentar carbohidratos
específicos. La fermentación es visible a través de un indicador de pH contenido
en el medio. (Hansen DS. et al 1998).

Salvo algunas excepciones, los organismos de Enterobacteriaceae habitan en el

tracto gastrointestinal de humanos y animales. En ocasiones actúan como
comensales, por lo que no causan daño al organismo que los hospeda, pero
también pueden ser causantes de numerosas infecciones oportunistas. Algunas
especies habitan libremente en el agua, la tierra, el drenaje y algunos son
fitopatogenos.(Gottschau A. et al 2003).

Los miembros de la familia Enterobacteriaceae se clasifican en dos grandes

categorías dependiendo de su patogenicidad en: patógenos oportunistas y
patógenos primarios (Mahon et al 1995). Los patógenos oportunistas

13
comúnmente son parte de la microbiota usual de los intestinos de humanos y
animales. Fuera de su lugar común pueden producir infecciones oportunistas extra
intestinales. Los patógenos primarios, son considerados patógenos verdaderos, ya
que no se encuentran como comensales en la microbiota intestinal, sino que
causan
infecciones al ser ingeridos en alimentos, agua contaminada y otras fuente
(Kolmos HJ. 2005).

14
Escherichia coli:

Escherichia coli se considera la especie más relevante del género Escherichia.

Fue descrita por Theodore Escherich. Es conocida por ser responsable de una
amplia variedad de síndromes clínicos. E. coli usualmente coloniza el tracto
intestinal de un recién nacido a pocas horas de haber nacido. Estas cepas
comensales raramente causan daño a su organismo hospedero, exceptuando a
hospederos inmunocomprometidos, o cuando las barreras intestinales se
encuentran dañadas. Sin embargo hay cepas de E. coli que han desarrollado
mecanismos de patogenicidad que les permiten adaptarse a nuevos nichos
(Hawley et al 2007).

Hay 4 principales cepas de E. coli identificadas como causantes de diarrea

(Hawley et al 2007).
E. coli enterotoxicogénica (ETEC). Es la principal causante de la llamada “diarrea
del viajero” así como de diarrea en niños, debido a una deficiente sanitización, o al
uso de heces humanas como fertilizante en los campos de cultivo. Esta cepa
produce dos toxinas en el intestino delgado de su hospedero, provocando pérdida
de líquidos y electrolitos, causando una diarrea no inflamatoria (Hawley 2007).

E.coli enteropatogena (EPEC). Causante de diarrea crónica. Producen una lesión

en la mucosa intestinal y dañan las vellosidades adyacentes. En cuestión clínica
se caracteriza por causar diarrea acuosa, en ocasiones con fiebre y vómito
(Hawley et al 2007).

E. coli entero hemorrágica (EHEC). Esta cepa se caracteriza por producir toxinas
Shiga, también conocidas como vero toxinas. Pueden causar diarrea acuosa,
diarrea sanguinolenta, colitis hemorrágica, síndrome hemolítico urémico (SHU) y
muerte (Hawley et al 2007).

15
E. coli enteroinvasiva (EIEC). Cepa capaz de invadir las células. Invade el epitelio
intestinal. Clínicamente se manifiesta con diarrea acuosa o sanguinolenta (Hawley
et al 2007).
De acuerdo con Koneman y Allen (2008), E. coli es uno de los organismos más
frecuentemente involucrados en la sepsis por gramnegativos, también es causante
de infecciones en las vías urinarias, neumonía y meningitis en recién nacidos. E.
coli se serotipifica con base en sus antígenos de superficie: O (somático) H
(flagelar y K (capsular).

16
 Materiales y métodos

Obtención del extracto de Stevia rebaudiana.

Se utilizó Stevia rebaudiana pulverizada, de la variedad Gavia E ll obtenida del
laboratorio de rotiferología UAM Xochimilco.

En un recipiente de plástico se pesaron 200 g de Stevia utilizando una balanza

digital Kaiser, (Figura 5 ), que fueron colocados en un matraz Erlenmeyer de 1
litro (Figura 6).

Se vertieron 600 ml de Etanol grado bebible en el matraz que contenía la Stevia

pulverizada, se cubrió la boca del matraz con parafilm y se agitó hasta que la
muestra se hidrato completamente (Figura 7).

Se colocó en un Shaker durante 24 horas. Posteriormente una vez que se

sedimento la Stevia, se decantó el extracto (Figura 8), se colocó papel filtro en un
embudo de cristal y se colocó en el matraz de 250 para evitar que el sólido se
pasara, obteniendo un total de 230 ml.

17
El líquido resultante fue depositado en un refractario de vidrio de tamaño grande y
forma rectangular y posteriormente se metió al horno hasta dejar secar la muestra
a una temperatura de 60 grados (Figura 9).

Se retiró del horno y se realizó el raspado de la muestra con una espátula(Figura

10), posteriormente se pesaron 0.5g y se puso en un tubo de ensaye, se
agregaron 5ml de Etanol grado bebible, se pesaron 0.750 g se puso en otro tubo
de ensaye y se agregaron 10 ml de Etanol grado bebible y se pesó 1g de la
muestra, se depositó en un tercer tubo de ensaye y se le agrego 10 ml de Etanol
grado bebible(Figura 11),los tres tubos se agitaron hasta disolver el sólido
obteniendo una muestra homogénea(Figura 12).

Seguidamente se formaron 12 discos de filtro Whatman con una perforadora, para

obtener las concentraciones de 50, 100 y 200 respectivamente.

18
Obtención de la cepa de E.coli
Se tomó una muestra de agua, del canal de Nativitas Xochimilco, y se realizó
el cultivo en cuatro cajas de Petri con Agar MacConkey. Las siembras se
cultivaron por duplicado empleando el método de estría cruzada con muestra pura
y con muestra diluida en solución salina inerte con una proporción de 1:10 con el
fin de obtener colonias aisladas(Figura 13).

Se incubaron las cajas en una estufa ( ), a una temperatura de 37° C durante

un periodo de 24 horas. De estas primeras colonias, se seleccionó una como
muestra única. Posteriormente se hizo una siembra con la colonia seleccionada
formando tres estriados al centro de la caja, colocando dos discos de filtro
impregnados del extracto de Stevia, utilizándose cada una de las concentraciones
por tercio de la caja, para nuevamente ser incubadas por 24 hrs a 37°C, con el fin
de comparar las propiedades antisépticas de cada concentración. Se midió el halo
de inhibición, formado alrededor de los discos de filtro con el extracto.

Para iniciar la identificación de la bacteria, por medio del frotis se aplicó el

procedimiento de tinción de Gramm(Figura 14) para ser observada en el
microscopio con un aumento 10x, 40x, 100x(Figura 15). Se sometió la bacteria a
las pruebas bioquímicas de catalasa, oxidasa, Indol, hierro triple azúcar (TSI),

19
Voges-Proskauer, rojo de metilo, citrato de Simmons para completar su
identificación (figura 16).

20
 Resultados.

Al evaluar los resultados en las pruebas bioquímicas se identificó a la bacteria

aislada como Escherichia coli.

Las concentraciones de 50 100 y 200 mg.m⁻¹ de extracto de Stevia rebaudiana

presentaron una variación significativa con respecto a que en la concentración de
50 mg.ml⁻¹en el cual se presentó un halo menor a 1mm mostrando una respuesta
negativa y sin presentar actividad en la inhibición del crecimiento bacteriológico,
puesto que en la concentración de 100 mg.ml⁻¹ se logró producir un halo de
aproximadamente 1mm, mostrando una respuesta positiva pero con muy baja
estimulación bactericida, y con respecto a la concentración de 200 mg.ml⁻¹, se
percató de la presencia de un halo de entre 2 y 3 mm aproximadamente(Figura
17), observándose una respuesta positiva con la mejor inhibición bacteriológica
sobre las colonias de E. coli, bacteria que fue obtenida del cultivo e identificada
por pruebas bioquímicas, mismas que fueron observadas en el microscopio de
acuerdo a características morfológicas identificadas por la tinción(Figura 18).

El extracto de S. rebaudiana, sí mostró actividades antisépticas, sin embargo esto

fue considerable únicamente en la concentración de 200 mg/ml .

21
 Discusión.

Periódicamente se descubren nuevos constituyentes de S. rebaudiana que van

siendo estudiados y descritos en la literatura científica (Wolwer et al 2012).
Estudios experimentales recientes, han afirmado que el extracto de hojas de
Stevia posee propiedades que inhiben el crecimiento de bacterias, por lo cual se
consideran sus propiedades antibacterianas y antivirales (Kujur et al 2010).
Aunque la mayoría de los estudios encontrados y consultados para esta
investigación fueron sobre bacterias bucales, autores afirman que es importante
estudiar los resultados del uso del extracto de Stevia (Soderling et al 2008).

El extracto probado en esta investigación fue menos efectivo que los extractos
utilizados en las investigaciones que sirvieron de referencia, aunque la mayoría de
los estudios consultados, fueron empleados para el tratamiento de bacterias de
otra especie, además del uso de distintos solventes, así como diferentes métodos
de extracción.

Tomita et al informaron actividad bactericida del extracto fermentado de agua

caliente de S. rebaudiana hacia E. coli y otras bacterias patógenas transmitidas
por los alimentos, aunque concluye que son necesarios más experimentos con
diferentes solventes (Tomita et al 1997).

Se considera importante profundizar los estudios experimentales en Stevia debido

a la resistencia que los microorganismos han creado contra los antibióticos (Tepe
et al 2005) para crear una alternativa médica al tratamiento de los mismos.

22
 Conclusión.

Los extractos de S. rebaudiana de concentraciones 50 mg.ml⁻¹ y 100 mg.ml⁻¹ en

etanol grado bebible mostraron una baja actividad antimicrobiana a diferencia de
la concentración de 200 mg.ml⁻¹ de extracto de S. rebaudiana en etanol grado
bebible, que mostró la mayor actividad contra el crecimiento de las colonias E. coli
(bacteria identificada). Se considera que son necesarios más estudios y pruebas
con otros solventes, para demostrar una mejor respuesta, ya que se considera a la
Stevia un ideal candidato a la investigación farmacéutica.

23
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