TÉCNICA DE CULTIVO EN PLACA

ASIGNATURA: Microbiología general

INTEGRANTES:
 Doroteo Rojas, Helen
 Cruz Ayala, Alexandra
 Díaz de la vega Herrera, Waldo
 Rimarache Ortiz, Irvin
 Alarcón Quispe, Cesar
PROFESORA: Kelly Vivanco Montoya
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INTRODUCCIÓN

Los microorganismos son seres vivos que solo pueden visualizarse con el
microscopio, se encuentran en todos lados: en el suelo, agua, superficies
corporales.
El cultivo de microrganismos consiste en proporcionarles las condiciones
físicas, químicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de
forma controlada.
En general, podemos distinguir cultivos líquidos, semi sólidos y sólidos en
función de las características del medio y cultivos discontinuos y continuos
en función de la disponibilidad de nutrientes en el medio.
Un cultivo conteniendo una sola especie de células, no adulteradas, se
llama cultivo puro Para aislar y estudiar microorganismos en cultivos puros,
se requieren una serie de instrumentos básicos de laboratorio y la
aplicación de técnicas especificas

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OBJETIVO
 Lograr que el participante sea capaz de cuidar y mantener sus
cultivos puros.
 Realizar el sembrado de los microorganismos en total asepsia.
 Interpretar los resultados del análisis microbiológico de los
alimentos.

MARCO TEÓRICO
Cultivar un microorganismo significa promover intencionalmente el
desarrollo de éste en medios de cultivo y condiciones de laboratorio
controladas. La población de microorganismos desarrollada en un medio se
denomina cultivo. Cuando éste contiene una sola especie de
microorganismo, se denomina cultivo puro o axénico, cuando contiene más
de una especie de microorganismos se denomina cultivo mixto. Un cultivo
tipo contiene una especie conocida de microorganismos y es conservada
en el laboratorio para realizar diversos ensayos y estudios.
Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de
una sola célula. Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los
medios naturales -por ejemplo, en el suelo, agua, o en el cuerpo humano-
existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes
especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene artificialmente
en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar
precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas
partes, en la naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y
recipientes usados en los experimentos. Estos microorganismos no
deseados o contaminantes deben ser eliminados de un cultivo para que
éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo axénico es
inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio
sólido o líquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un
solo microorganismo del resto y se podrá multiplicar en condiciones
favorables. Un clon está constituido por una población de células
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descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo

suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un
medio sólido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el
mismo tubo o matraz, debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de
otra manera el crecimiento y sobrevivencia no pueden continuar. En esta
transferencia se deben considerar dos aspectos básicos referentes a: no
introducir microorganismos indeseables (contaminantes) y concentración o
carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Para impedir la contaminación de los cultivos, es necesario tener plena
conciencia de la ubicuidad de los microorganismos, lo que determina que
el aíre y todas las superficies estén densamente pobladas por
microorganismos, de este modo en la transferencia de una muestra
microbiológica a otro recipiente, se deben tener una serie de cuidados que
eliminen los riesgos de contaminación. Estos incluyen el área de trabajo, el
lavado de las manos, la esterilización de todos los utensilios y medios de
cultivo a emplear y realizar la transferencia del microorganismo en una
zona estéril, la que se obtiene trabajando cerca de la flama del mechero. Al
conjunto de procedimientos realizados para prevenir o evitar la
contaminación se le llama técnica aséptica; el seguimiento cuidadoso y
detallado de la misma evita accidentes tales como:
La contaminación y pérdida del cultivo en estudio
La salida y dispersión de microorganismos del cultivo, lo que ocasionaría la
contaminación de utensilios, productos y del personal. Este último aspecto
es particularmente importante cuando se trabaja con cultivos de
microorganismos patógenos.
Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del
principiante consiste en tomar muestras grandes, lo que es innecesario.
Una colonia de bacterias del tamaño de la cabeza de un alfiler contiene
varios millones de microorganismos, es obvio que con una cantidad
pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente
para efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas:
hisopo, pipeta (para uso microbiológico son terminales y la parte superior o
boquilla debe estar protegida con filtro de algodón), pipeta pasteur, cable

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de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto en forma de: aguja,

asa, espátula y/o gancho.
INOCULACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Flamee el asa o aguja por unos segundos en forma vertical.
Quite el tapón del tubo y manténgalo en la misma mano en que tiene el
asa o aguja para inoculación. Flamee la boca del tubo y tome una pequeña
porción de inóculo.
Flamee nuevamente la boca del tubo que tiene el espécimen que va a
trasferir y tápelo.
Quite el tapón del tubo que va a inocular y proceda de acuerdo de acuerdo
al medio de cultivo:
Caldo: Basta con tocar el medio con el asa o aguja, si es poco caldo inclínelo
de manera que no introduzca en el tubo el mango del asa o aguja.
Medio semisólido por lo general para este medio se usa la aguja de
inoculación la cual se introduce dentro del medio hasta aproximadamente
¾ partes de profundidad. En un solo movimiento.
Medio sólido inclinado, se lleva el asa o la aguja hasta donde empieza el
declive y se sube haciendo un movimiento de zigzag sobre la superficie
dibujando así una serie de estrías.
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de
inoculación, hisopos, pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse
previamente. La utilización de estos dispositivos, así como de los diferentes
medios de cultivo tiene aplicaciones específicas. Por ejemplo: los medios
líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con tapones de
algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido
mediante un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el
inóculo se deposita dentro del caldo o medio líquido. En este tipo de
cultivos los microorganismos presentan un desarrollo particular que se
manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las ventajas
que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos
acelerando la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en
este tipo de cultivos, las poblaciones se encuentran suspendidas y es fácil
homogenizarlas, lo que permite estandarizar la concentración del inóculo.

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La desventaja que presentan, e que en ellos e difícil detectar

contaminación a simple vista.
En el estudio de cultivos bacterianos algunos de los criterios que se
emplean para caracterizarlas incluyen: tamaño, morfología celular, forma
de agrupación, reacción a la tinción de Gram, formación de esporas,
movilidad, presencia de inclusiones de reserva y características culturales
en medios líquidos y sólidos en los que presentan patrones de desarrollo
en cuanto a la forma, tamaño, elevación y color de las colonias.
CULTIVO EN PLACA
Si las bacterias se pueden separar por dilución y después se ponen en un
medio sólido para que den lugar a colonias, estas tendrán una medida,
forma, color y textura dependiendo de cada microorganismo lo cual
proporcionará una valiosa ayuda en su identificación.
El método de estría cruzada consiste en la dilución de un cultivo mediante
el estriado en la superficie de un medio sólido, en una caja Petri. Los
microorganismos se van quedando al hacer las estrías en diferentes partes
de la superficie del medio de tal forma que en un momento dado quedarán
células individuales o bien unidades formadoras de colonias, que al
multiplicarse darán lugar a una colonia. Las placas estriadas se usan
fundamentalmente para aislar cultivos puros en muestras que contienen
flora mixta, también es útil para el estudio de la morfología colonial y
propiedades hemolíticas de las bacterias.

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MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES IMAGEN

Pipetas

Placas petri

Asa de siembra

Tubos de ensayo

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Mechero

Botella de vidrio

Reactivos
REACTIVOS IMAGEN

Agar Mac Conkey

Agar Plate count

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PROCEDIMIENTO
Aislamiento de placa por estrías
Elegimos el inoculo o muestra a sembrar.

Esterilizar el asa a utilizar

Cargar el asa y rayar la superficie del cultivo de una placa Petri de forma
que cada pasada sea menor el número de células depositadas.

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Llevar el medio a la incubadora previamente sellado con papel aluminio.

Hacer la lectura de 18-48 h (medio Mac Conkey)

Aislamiento por dilución en medio solido

TÉCNICA POR MASIFICACIÓN O SIEMBRA INCORPORADA
Colocar 1ml de muestra (peptano) en una placa Petri

Añadir 20 ml de medio de cultivo (Plate count) fundido a 45°

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Luego mover 5 veces en sentido horario y 5 veces en sentido anti horario,

una vez de arriba abajo y una vez a los costados.

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TÉCNICA POR EXTENSIÓN O EN SUPERFICIE

Diluir el medio de cultivo (Plate count) en la placa Petri
Hacer secar el medio
Diluir 1 ml de la muestra (caldo nutritivo) en el centro de la placa y se
extiende sobre el medio y se hace secar para posteriormente llevar a
incubar.

De esta forma los microorganismos se distribuirán de forma homogénea en el

medio de cultivo,
RESULTADOS permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el
Y CONCLUSIONES
medio.

Según:(fuente: BIO-231 PRACTICA 3 2-12-13)

Aislamiento de colonias discretas de un cultivo mixto:
Las técnicas usadas para aislar colonias discretas requieren que el número
de organismos en el inóculo sea reducido, de modo que, luego de la
inoculación, las células individuales estén lo suficientemente lejanas unas
de otras en la superficie del agar y se efectúa, de dicha manera, la
separación de las diferentes especies presentes. Uno de las técnicas usadas
para lograr la dilución deseada se conoce como Método de Rayado de
Placas o siembra por estrías.
En este método se “unta” una cantidad del cultivo en la superficie de un
plato de agar. Vamos a describir el método de 4 cuadrantes para el rayado:

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a. Coloque un asa de cultivo en el agar. Flamee el asa (inoculador) y

enfríelo tocando una porción no usada del agar cercano a la periferia del
mismo, y páselo varias veces a lo largo del área o cuadrante 1.
b. Flamee el asa de nuevo y enfríela, gire el plato de Petri 90⁰. Toque con el
asa una esquina del cultivo en el área 1 y arrástrelo varias veces a través
del área 2. El asa no debe entrar de nuevo al área 1.
c. Flamee el asa de nuevo y enfríela, gire el plato de Petri 90⁰. Repita el
paso b en el Área 3.
d. Sin flamear de nuevo, repita el paso c, comenzando en una esquina del
Área 3 y arrastrándola al Área 4. No deje que el asa toque las áreas 1 a 3.

Aislamiento de Cultivos puros a partir de preparaciones de rayado de placas

o siembra por extensión:
Cuando se desarrollan colonias discretas, bien separadas, en la superficie
del medio nutritivo, cada una puede ser tomada con una aguja de
inoculación y transferida a un tubo de agar inclinado.
Cada uno de estos cultivos representa el crecimiento de una única especie
bacteriana y se llama cultivo puro o stock.

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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ALUMNA: Doroteo Rojas Helen

EMB
Se puede observar en la placa que ésta presenta brillo metálico de color verdoso, del cual
podría estar produciendo un crecimiento de Escherichia coli y Citrobacter spp. Ya que estos
presentan un característico brillo metálico cuando se da su crecimiento.

También se podría dar la presencia de cepas que utilizan la lactosa ya que poseen un centro
oscuro con periferia azulada o rosada. También este medio es propicio para el crecimiento de
Salmonella y Shiguella.

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Mac Conkey
Se observa en la placa la presencia de pequeñas colonias en los alrededores de placa y casi al
centro de la placa, identificándolas por los putos rosados que se puede observar en la imagen.

Estos colonias rosadas nos brinda información de que hay presencia de bacterias como
Escherichia coli.

Ojo: hay partes de la placa que presenta puntos de color rosa pálido esto significa que se
inoculó de manera inadecuada.

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ALUMNO: DIAZ DE LA VEGA HERRERA WALDO

Resultados
Mac conkey:

Forma de colonia Circular

Superficie Lisa
Elevación convexa
Bordes Ondulada
Color Rojizo
Opacidad Opaco
Consistencia Mucoso
Contaminación regular

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FUENTE: MacConkey, A.T. 1900. Note on a new medium for the growth and differentiation of
the Bacillus coli communis and the Bacillus typhi abdominalis. The Lancet, Part II:20.

Se observa varias coloniasde color rosa a rojizo dando a aentender que

puede haber presencia de E. coli y para ser mas precisos por sus
consistencia mucosa estaríamos frente a auna colonia Enterobacter,
Klebsiella.

EMB

Forma de colonia Irregular

Superficie Lisa
Elevación Elevada
Bordes Ondulada
Color Amarillento
Opacidad Opaco
Consistencia Mucoso
Contaminación escasa

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 TÉCNICA DE CULTIVO EN PLACA

FUENTE: Farmer III, J.J. 2003. Enterobacteriaceae: introduction and identification. In:
Murray, P. R., E. J. Baron, J.H. Jorgensen, M. A. Pfaller, and R. H. Yolken (ed.). Manual of clinical
microbiology, 8th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.

Se puede notar que hay una gran colonia inclora con un aparicion de
puntos pero que mantiene el color ambar caracteristico se la bacterias
como la Salmonella o la Shigella.
ALUMNO: RIMARACHE ORTIZ IRVIN FELIX
RESULTADOS
MACONKEY
FORMA DE COLONIA
IRREGULAR, REDONDAS

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SUPERFICIE
RUGOSA

ELEVACIÓN
PULVINADA

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BORDES
ONDULADO

COLOR
BRILLANTE

OPACIDAD
OPACO

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CONSITENCIA
SECO

CONTAMINACIÓN
REGULAR

Lactosa positivo (consume el carbohidrato lactosa lo cual acidifica el medio y el

indicador rojo de fenol cambia rojo-rosado, por ello las colonias se ven de ese color)

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RESULTADOS
EMB

FORMA DE COLONIA
CIRCULAR

SUPERFICIE
LISA

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TÉCNICA DE CULTIVO EN PLACA

ELEVACIÓN
CONVEXA

BORDES
ENTERO

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COLOR
MATE

OPACIDAD
OPACO

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CONSITENCIA
SECO

CONTAMINACIÓN
ESCASA

La diferenciación entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y

aquellos que son incapaces de hacerlo, está dada por los indicadores eosina y azul de
metileno; éstos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas.
Las colonias de esta bacteria varían según el medio de cultivo donde crezcan, en este
caso el medio de cultivo es Agar Eosina Azul de Metlileno abreviado EMB

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CONCLUSIÓN

 En esta práctica se logró aprender las diferentes técnicas de cultivo

en placa aprendidas hasta el transcurso del curso.

 Se logró aprender a realizar algunos de los métodos que existen para

cultivar bacterias y de esta manera observar sus características tanto
macroscópicas como microscópicas y también la interpretamos.

 Se logró con éxito la siembra de microorganismos aunque tuvimos

un erros en una placa la cultivamos de cabeza.

 Se concluye que cada una de estas bacterias tiene particularidades

diferentes debido a la observación que se hizo de sus características
macroscópicas, luego se realizó su respectiva interpretación
teniendo en cuenta sus conceptos. Al final se pudo identificar los
tipos de asas al momento que se realizó la siembra.

CUESTIONARIO
1. ¿cuándo sería necesario utilizar técnicas asépticas para inocular
un tubo de medio líquido con polvo?

Las condiciones de asepsia, las da siempre que sean necesarios en

microbiología así es; no importa el momento.
Las técnicas de asepsia están diseñadas para prevenir la entrada de
patógenos en el organismo. La filtración del aire, la luz ultravioleta, las
mascarillas, guantes y batas y la esterilización de instrumentos son medidas
para conseguir la asepsia. Para sembrar cualquier medio de cultivo hay que
adoptar condiciones de asepsia tanto para tomar el inóculo como
depositarlo en el medio, estas condiciones implican flamear el asa, dejarlo
enfriar luego abrir tubo, flamearlo y luego sembrar.

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2. Describa la cabina de anaerobiosis.

Una cámara de anaerobiosis es un sistema anaerobio completo que
permite realizar muestras, aislamiento e identificación de las bacterias
anaerobias sin exposición al aire. Puede estar construido de varios
materiales como acero, plástico acrílico o fibra de vidrio.
Es económica para operar porque permite el uso del medio en placas
convencionales y el costo de los gases es mínimo.
La mezcla gaseosa empleada para reemplazar al aire contiene un 85% de
nitrógeno, 10% de hidrogeno y 5% de dióxido de carbono.
Un compartimento en un extremo de la cámara contiene dos portillas, una
que conduce al exterior y la otra al interior del compartimiento. Los
especímenes se ponen en el compartimento, la portilla exterior es cerrada,
y el aire en el compartimento se evacua y se substituye por la mezcla de
gas.
La portilla interior entonces se abre para introducir el espécimen en la
cámara principal cuando las presiones se igualan. Una de las cámaras más
recomendadas es la de Forma Scientific.

Cámara de anaerobiosis

3. ¿A qué se denominan inoculadores multipuntos? De ejemplos

Se denominan a aquellos inoculadores que van a aumentar el número de
unidades formadoras de colonias.
Ejm: Inoculador multipuntos Denley A400

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4. ¿Para qué sirven los indicadores de anaerobiosis? Mencione

cada uno de ellos.
Para comprobar que hay una condición de anaerobiosis en las jarras o
cámaras de anaerobiosis.
Hay de tipo bacteriológico y químico; los bacteriológicos consisten en
introducir en la jarra un cultivo de un aerobio estricto; si éste crece, indica
un fallo en el establecimiento de la atmósfera de anaerobiosis, el
inconveniente de estos indicadores es que los resultados no son conocidos
hasta el final del período de incubación. Por ello, son más usados los
indicadores químicos, los cuales se decoloran cuando están reducidos.
En el mercado existen indicadores químicos como son las tiras de azul de
metileno y tiras de resazurina. El azul de metileno es de color azul cuando
está oxidado y la resazurina es de color rosa.

5. ¿Por qué es importante evitar romper o dañar el medio durante

la siembra?

Claro es importante no dañar el medio en la cual se siembra, ya que si esto

ocurre no tendríamos el resultado que esperamos de nuestro inóculo y
nuestra muestra esperada sería un fracaso.

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REFERENCIAS BIBLIOGRAFIAS
 Biología de microorganismos – Michael T. Madigan, John Martinko,
Jack Parker – Editorial Pearson.
 Introducción a la Microbiología – Gerard J. Tortora – Editorial Medica
Panamericana.
 http://es.slideshare.net/rebecaoloarte/tecnicas-de-siembra-de-
microorganismos.
 http://es.slideshare.net/naya110/laboratorio-tecnicas-de-siembra.
 https://www.youtube.com/watch?v=2mb8iShAEwY
 http://www.higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2026.pdf
 http://www.omniascience.com/scholar/index.php/scholar/article/vie
w/1/2

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