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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN BIOTECNOLOGÍA AVANZADA


(CIBA - IPN)

Posgrado En Tecnología Avanzada

"EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRACTOS DE CINCO


PLANTAS MEDICINALES DE LA REGIÓN DE CUETZALAN, PUEBLA, SOBRE UNA
LÍNEA CELULAR DE CÁNCER CERVICOUTERINO"

Tesis que para obtener el grado de


Maestro En Tecnología Avanzada
Presenta:

Q.F.B. María del Carmen Guadalupe Avelino Flores

Tepetitla de L. Tlaxcala, septiembre de 2005


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DIRECTORA DE TESIS:
DRA. MARTHA DOLORES BIBBINS MARTÍNEZ
(CIBA-TLAXCALA, IPN)

CO-DIRECTOR DE TESIS:
DR. JULIO ROBERTO REYES LEYVA
(CIBIOR-IMSS, METEPEC)

ASESORES DE TESIS:
DR. ARTURO NAVARRO OCAÑA
(UNAM)
DR. FRANCISCO RUÍZ TERÁN
(UNAM)
DR. EDUARDO SAN MARTÍN MARTÍNEZ
(CICATA-LEGARIA, IPN)
M. en C. CLAUDIA MONTALVO PAQUINI
(CIBA-TLAXCALA, IPN)

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AGRADECIMIENTOS

A Dios por ser la razón de mi existencia, por ser la constante de mi vida y por ser todo en
todo, gracias…..mi amado Señor.

A la Dra. Martha D. Bibbins Martínez y al Dr. Julio R. Reyes Leyva por la confianza, el
afecto, el apoyo y el conocimiento brindados a lo largo de todo este tiempo.

A mis revisores de tesis: Dr. Arturo Navarro Ocaña, Dr. Francisco Ruíz Terán, Dr.
Eduardo San Martín Martínez y M. en C. Claudia Montalvo Paquini; por haber dedicado
su tiempo y atención a la presente tesis y hacerme de manera amable y comprensiva las
correcciones pertinentes.

Al biólogo José Luís Contreras, responsable del Herbario de la BUAP, por su amable
colaboración en la clasificación taxonómica de los especimenes.

Al CIBIOR-IMSS, Metepec; por permitirme realizar los ensayos de actividad citotóxica en


sus instalaciones.

A la cooperativa TOSEPAN-TITATANISQUE de Cuetzalan, por abrirnos las puertas para


la obtención de especimenes; en especial al Sr. Epifanio García López por estar
dispuesto siempre a ayudarme y a compartir conmigo su experiencia y calidad humana.

A mis maestros y compañeros del CIBA y CIBIOR, por lo mucho que he aprendido de
ellos, por la ayuda y convivencia que hicieron este trabajo más fácil y llevadero.

A mis padres, por el amor que me expresan día a día a través de su apoyo, comprensión,
cariño, confianza, respeto y todo lo demás para lo que no tengo palabras. Los amo.

4
A mi familia (hermanos, cuñadas, sobrinos), porque gracias a su amor, compañía y
ayuda, llenan mi vida de alegría y movimiento, por hacerme feliz cada momento, mil
gracias. Los amo.

A mis amigos, de aquí, de allá, de hace mucho o recientes (cuyos nombres no escribo
por no creerlo necesario) por el tiempo en el que compartimos ideas, consejos, alegrías y
tristezas y porque a pesar de la distancia y las ocupaciones continúan a mi lado, los
quiero mucho.

Se que estas palabras son muy cortas para expresar la importancia que cada ser,
persona y acontecimiento han tenido y seguirán teniendo en mi vida y en mi crecimiento
tanto personal como profesional, así que a todos y por todo, simplemente: GRACIAS.

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RESUMEN

En este trabajo se seleccionaron 5 plantas empleadas en la medicina tradicional de


Cuetzalán, Puebla, se produjeron extractos acuosos e hidroalcohólicos y se evaluó su
capacidad de inhibir la proliferación de células SiHa derivadas de cáncer cervicouterino.
Las cinco plantas evaluadas fueron: Costus pulverulentus (Caña de venado), Sechium
sp. (Espinoso), Tabernaemontana sp. (Cojón de gato), Verbesina persicifolia (Huichin) y
Vernonia patens (Ocma). Para los experimentos se utilizaron dos tipos de cultivos de las
células: a) en forma de monocapas de células adherentes alimentadas con medio líquido
y b) en forma de colonias tumorales cultivadas sobre medio semisólido. Los extractos
acuosos de C. pulverulentus, Sechium sp, V. persicifolia y V. patens aumentaron la
proliferación de las células en monocapa, siendo el del V. patens el más activo (48% a la
dosis de 10 µg/ml); el extracto acuoso de Tabernaemontana sp, inhibió 16% la
proliferación celular a la dosis máxima probada (100 µg/ml). Los extractos
hidroalcohólicos de las cinco plantas inhibieron el crecimiento celular, siendo Sechium sp
y V. persicifolia los que tuvieron la mayor actividad a la menor concentración (IC50 de 16.5
µg/ml y 27.7 µg/ml, respectivamente). Los extractos acuosos de V. patens y
Tabernaemontana sp se probaron en cultivos de colonias tumorales en medio semisólido
mostrando resultados similares a los observados en los cultivos adherentes (111% y 13.6
respectivamente).

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ABSTRACT

In this work five plants used for the traditional medicine of Cuetzalan, Puebla, were
selected, aqueous and hydroalcoholic extracts were produced and their capacity to
inhibiting the proliferation of SiHa cells derived of cervical cancer was evaluated. The
five evaluated plants were: Costus pulverulentus, Sechium sp, Tabernaemontana sp,
Verbesina persicifolia and Vernonia patens. The assays were performed with two types
of SiHa cells cultures: a) SiHa cells monolayer was cultured with liquid medium and b)
SiHa cells tumoral clones were cultivated on semisolid medium. Addition of the C.
pulverulentus, Sechium sp, V. persicifolia and V. patens aqueous extracts increased
proliferation of SiHa cell monolayers; V. patens. induced the highest activity (48% at 10
µg/ml) in comparison with other extracts. Tabernaemontana sp aqueous extract inhibited
16% cell proliferation at the maximal concentration (100 µg/ml). In contrast, the
hydroalcoholic extracts of the same plants inhibited cellular multiplication. Sechium sp
and V. persicifolia extracts showed the biggest activity at their smallest concentrations
(IC50 value of 16.5 and 27.7 µg/ml, respectively). V. patens and Tabernaemontana sp
aqueous extracts were used on tumoral clones of SiHa cells cultured on semisolid
medium, results were similar to that obtained with monolayer cultures; (111 and 13.6%,
respectively).

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GLOSARIO

Inmunomodulador. Sustancia que influye en la respuesta inmune, ya sea estimulándola


o deprimiéndola.
Apoptosis. Muerte celular programada, que no involucra mecanismos de inflamación,
donde las células aparecen como fragmentadas y rodeadas por membrana celular.
Cáncer. Conjunto de enfermedades caracterizadas por la proliferación sin control de
células que han perdido su función y que pueden emigrar a tejidos circundantes o
distantes.
Cáncer Cervicouterino. Tipo de cáncer en el cérvix o cuello del útero que es en su
mayoría causado por la presencia de virus del papiloma humano (VPH) de alto riesgo.
Células germinales. Células reproductivas (espermatozoide y óvulo).
Células SiHa. Línea celular humana de cáncer cervicouterino, posee de una a cinco
copias de VPH tipo 16.
Etnobotánica. Ciencia que estudia las interrelaciones entre el hombre y su medio
vegetal, en un espacio y tiempo determinados.
Etnomedicina. Rama de la Etnobotánica que se encarga de estudiar el valor medicinal
de las plantas para el hombre.
Extracto crudo. Extracto que contiene la totalidad de los principios activos extraídos del
material vegetal con un solvente o una mezcla de solventes.
Farmacología. Ciencia que estudia las actividades de las sustancias químicas
(específicamente de las empleadas para tratamiento, prevención y diagnóstico) en los
seres vivos.
Fitoquímica. Estudio y caracterización de las sustancias químicas presentes en la
composición de los vegetales.
Índice de citotoxicidad 50 (IC50). Dosis de un compuesto a la que la viabilidad celular se
reduce en un 50 % con respecto al testigo.
Marcadores tumorales. Enzimas, proteínas y hormonas anormales producidas por las
células tumorales como el antígeno carcinoembrionario, la alfafetoproteína, entre otros.

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Metástasis. Migración o diseminación de las células cancerosas desde su origen
primario a otros tejidos donde crecen como tumores secundarios.
Microtúbulos. Estructuras celulares formadas por la proteína tubulina, importantes en el
citoesqueleto y en la división celular.
Mutación. Cambio estable en la estructura del DNA de un gen.
Neoplasia. Tejido nuevo, proceso que cursa con la proliferación excesiva o anormal de
células.
Neutropenia. Disminución en la cuenta normal de neutrófilos circulantes, se dice que en
valores menores a los 1500 neutrófilos/mm3
Oncogén. Gen cuyo aumento en la expresión puede provocar la transformación tumoral.
Quimiotaxonomía. Relación existente entre las plantas pertenecientes a un mismo
grupo taxonómico con respecto a su producción de metabolitos secundarios.
Virus oncogénico. Virus cuya infección puede inducir la transformación maligna de las
células, pueden ser virus DNA o virus RNA.
Té, infusión o tisana. Se preparan vertiendo agua caliente sobre hojas, flores, tallos y
raíces, donde la planta no debe ser hervida debido a la pérdida o alteración de esencias
y principios activos.
Cocimientos. Consiste en cocer hirviendo la combinación de las diferentes partes
vegetales, donde se pueden incluir semillas, raíces y cortezas. Se recomienda para
extraer el máximo de los componentes no volátiles.
Pomadas y ungüentos. Formas de aplicación externa, donde la parte activa vegetal se
encuentra incluida en un vehículo o excipiente generalmente graso.
Cataplasmas. En este tipo de preparación, la planta puede colocarse fresca
directamente sobre la zona afectada, o bien en polvo con algún vehículo como harina o
salvado.
Tinturas. La planta triturada se mantiene en alcohol de caña, vino o solución
hidroalcohólica durante diez o quince días, bien tapada, protegida de la luz.
Baños. La preparación de los baños se realiza a partir del cocimiento de una o varias
plantas, aplicándose en las zonas afectadas.

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ÍNDICE

Página
1. Marco Teórico 14
1.1 Investigación Etnobotánica en plantas medicinales. 14
1.1.1 La Etnobotánica y su importancia. 14
1.1.2 Formas de preparación de las plantas medicinales. 15
1.2 Metodología para la investigación de actividades antitumorales. 16
1.3 Cáncer. 19
1.3.1 Mecanismos celulares involucrados en el desarrollo del cáncer. 19
1.3.2 Factores genéticos y ambientales que pueden originar el cáncer. 20
1.3.3 Incidencia del cáncer en el mundo y en México. 21
1.3.4 Cáncer cervicouterino. 23
1.3.5 Tratamiento del cáncer cervicouterino. 23
1.4 Características de las plantas seleccionadas para este estudio. 24
1.4.1 Caña de venado. 24
1.4.2 Cojón de gato. 25
1.4.3 Espinoso. 27
1.4.4 Huichin y Ocma. 28

2. Planteamiento del problema. 31

3. Justificación. 32

4. Objetivos. 33
4.1 Objetivo general. 33
4.2 Objetivos específicos. 33

5. Hipótesis. 33

6. Material y métodos. 34
6.1 Selección del material a evaluar. 34
6.2 Recolección y manejo de ejemplares. 34
6.3 Obtención de los extractos. 35
6.4 Determinación de las condiciones óptimas de experimentación. 35
6.4.1 Cuantificación celular con azul tripano. 36
6.4.2 Curva de crecimiento celular. 36
6.4.3 Ensayo para la evaluación de viabilidad celular. 36
6.4.3.1 Curva de concentración celular contra densidad óptica. 36
6.4.3.2 Curvas dosis-respuesta para sulfato de bleomicina y etanol. 37
6.4.4 Cultivo celular en medio semisólido para la formación de colonias
tumorales. 37
6.5 Pruebas para determinar la actividad biológica de los extractos. 39
6.5.1 Ensayos para la evaluación de la actividad antiproliferativa. 39
6.5.2 Ensayo para evaluar la actividad de los extractos en la formación de
colonias tumorales. 40
6.6 Análisis estadístico. 41
6.7 Cálculo de los Índices de citotoxicidad al 50% (IC50). 41

7. Resultados. 42
7.1 Selección del material a evaluar. 42
7.2 Extractos obtenidos. 44
7.3 Condiciones óptimas de experimentación en cultivos celulares. 44
7.3.1 Curva de crecimiento de células SiHa. 44
7.3.2 Determinación de la viabilidad celular con MTT y curva de concentración
celular contra densidad óptica. 45

10
Página
7.3.3 Curva dosis-respuesta para sulfato de bleomicina . 45
7.3.4 Curva dosis-respuesta para etanol. 46
7.3.5 Formación de clonas tumorales en un medio semisólido. 47
7.4 Efecto sobre la proliferación celular. 48
7.4.1 Extractos acuosos. 48
7.4.2 Extractos hidroalcohólicos. 50
7.4.3 Efecto de los extractos acuosos en la formación de colonias tumorales. 54

8. Discusión de resultados. 57
8.1 Extractos acuosos. 57
8.2 Colonias tumorales. 58
8.3 Extractos hidroalcohólicos. 58

9. Conclusiones. 62

10. Trabajo a futuro. 63

11. Bibliografía. 64

Anexos. 74
I. Encuesta. 74
II.Plantas medicinales recomendadas por la Cooperativa Tosepan-Titatanisque. 75
III. Formulaciones. 78

11
RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS

Figuras:
1. Interrelación entre los diversos proyectos de investigación en el descubrimiento de nuevos agentes
contra el cáncer
2. Proceso de carcinogénesis
3. Incidencia del cáncer en hombres y mujeres mexicanos
4. Procedimiento para la selección de colonias tumorales
5. Aislamiento de colonias tumorales
6. Ensayo para la evaluación de la actividad antiproliferativa de los extractos
7. Ensayo para evaluar la actividad de los extractos en el desarrollo de las colonias tumorales
8. Caña de venado (Costus pulverulentus)
9. Espinoso (Sechium sp.)
10. Cojón de gato (Tabernaemontana sp.)
11. Huichin (Verbesina persicifolia)
12. Ocma (Vernonia patens)
13. Curva de crecimiento en células SiHa
14. Curva dosis-respuesta para sulfato de bleomicina
15. Curva dosis-respuesta para etanol
16. Clonas formadoras de colonias tumorales
17. Monocapas de clonas formadoras de colonias tumorales
18. Actividad de los extractos acuosos en la proliferación de las células SiHa (MTT y azul tripano)
19. Actividad de los extractos hidroalcohólicos en la proliferación de las células SiHa
20. Morfología de las células tratadas con los extractos acuosos
21. Morfología de las células tratadas con los extractos hidroalcohólicos
22. Actividad de los extractos acuosos de Tabernaemontana sp. y V. patens en el desarrollo de las
colonias tumorales de células SiHa
23. Morfología de las colonias tumorales tratadas con los extractos acuosos de Tabernaemontana sp. y
V. patens.

12
Tablas:
1. Principios activos extraídos con un solo solvente
2. Eventos bioquímicos responsables de la actividad anticancerígena
3. Mortalidad en México con referencia al cáncer
4. Distribución de los principales tipos de cáncer
5. Actividades farmacológicas de plantas pertenecientes al orden Zingiberal
6. Actividades farmacológicas de la familia Apocynaceae
7. Actividades farmacológicas de la familia Cucurbitaceae
8. Actividades farmacológicas de la familia Compositae
9. Actividad biológica reportada para el género Verbesina
10. Actividades biológicas identificadas para el género Vernonia
11. Concentraciones de sólidos presentes en los extractos obtenidos
12. Viabilidad de células SiHa, después de la administración de sulfato de bleomicina
13. Concentraciones de IC50 de los extractos hidroalcohólicos en la proliferación de células SiHa

13
1. Marco Teórico

1.1 Investigación etnobotánica en plantas medicinales

1.1.1 La Etnobotánica y su importancia


Desde la antigüedad, el hombre ha empleado a la naturaleza como fuente de
innumerables recursos; en especial de las plantas, las cuales tienen un gran número de
aplicaciones industriales y de manera muy significativa aplicaciones curativas.
La etnobotánica es una ciencia que estudia las relaciones existentes entre el
hombre y las plantas en un contexto cultural; es decir, a través del tiempo y en un
espacio determinado; una de las ramas de interés de la etnobotánica es la
etnomedicina, que intenta recobrar la medicina tradicional de los pueblos indígenas. En
la actualidad, la medicina tradicional se reconoce como un recurso de atención primaria
a la salud para el sector más pobre de los países (aunque también es empleada por
aquellos sectores de mayor capacidad económica); así como fuente de conocimientos y
sabiduría popular, se estima que del 25 al 50 % de las drogas que provienen de las
farmacopeas no occidentales son eficaces empíricamente (Cifuentes y col., 1990). En
atención a lo anteriormente mencionado, la Organización Mundial de la Salud (OMS)
declaró en la reunión de Ginebra del 28 de noviembre de 1977 la necesidad de evaluar
sistemas tradicionales de salud e incorporar elementos diagnósticos y terapéuticos
dentro del marco de estrategias de atención primaria a la salud, a través de estudios
etnobotánicos y de investigación fitoquímica y farmacológica en los diferentes países
miembros (Documento 16. Promoción y desarrollo de la medicina tradicional). Dicha
declaración, promueve la investigación que sobre plantas medicinales se desarrolla en
los diferentes países con una gran tradición etnomédica. Es importante tomar en cuenta
las recomendaciones de la misma organización (Conferencia de Alma, Ata, 1978),
acerca del adecuado manejo tanto de la medicina moderna como de la tradicional
(Cifuentes y col., 1990).

14
1.1.2 Formas de preparación de las plantas medicinales
Prácticamente todas las partes de la planta pueden emplearse para curar: la raíz, el
tallo, la corteza, las hojas, las flores, el fruto, la resina o goma y la leche o látex; estos
productos vegetales se emplean en forma de cocimiento, té o tisana, polvos,
ungüentos, emplastos, gotas, sahumerios; mascados, comidos y bebidos en forma de
tinturas. Se reconoce de entre todos éstos a las tisanas, cocimientos, pomadas,
ungüentos, cataplasmas, tinturas y baños como los de uso más corriente (Cifuentes y
col., 1990; Valdez, 1998; Saldierna y col., 2001). Es importante la forma y tipo de
solventes empleados para la preparación de los extractos, así como el tipo de
extracción que de ellas se realiza, ya que de esto dependen los posibles principios
activos que se extraerán y como consecuencia las actividades que de ellos se deriven,
la tabla 1 nos muestra el tipo de compuestos químicos que se obtienen cuando el
material vegetal se extrae con un sólo solvente.

Tabla 1. Naturaleza química de compuestos extraídos con un solo solvente

Agua Etanol Metanol Cloroformo Diclometano

Antocianinas Taninos Antocianinas Terpenoides Terpenoides


Almidones Polifenoles Terpenoides Flavonoides
Taninos Poliacetilenos Saponinas
Saponinas Flavonoles Taninos
Terpenoides Terpenoides Xantoxilinas
Polipéptidos Esteroles Totaroles
Lecitinas Alcaloides Cuasinoides
Própolis Lactonas
Flavonas
Fenonas
Polifenoles

Compuestos obtenidos comúnmente obtenidos con un solo solvente


Tomada de M. M. Cowan “Plant Products as Antimicrobial Agents. Clinical Microbiology
Reviews. Vol. 12, No. 4 (1999)

15
1.2 Metodología para la investigación de actividades antitumorales
En la actualidad, cerca de 120 agentes terapéuticos de estructura conocida aislados de
90 especies son utilizados para propósitos comerciales, estos son empleados para el
tratamiento de infecciones (microbianas, parasitarias, virales), desórdenes cardíacos,
hormonales, y para el cáncer; el 74 % de estos 120 agentes han sido descubiertos a
través de investigaciones basadas en listados etnomédicos (Cordell y col., 1991;
McChesney, 1993; Beutler y col., 1995; Cowan, 1999). La selección de las plantas
puede llevarse a cabo por: una investigación al azar dentro del reino vegetal, donde las
especies disponibles son investigadas a pesar de no tenerse conocimientos previos
acerca de ellas; tomarse en cuenta la taxonomía (quimiotaxonomía), donde las plantas
pertenecientes a algún género o familia de interés por los compuestos químicos que
producen son evaluadas; basándose en el conocimiento etnomédico, es decir, a través
del uso medicinal que se les da y en obediencia a bases de datos como NAPRALERT,
USDA EBL Database, DIALOG, etc. (Farnsworth y col., 1983; Cordell y col., 1991;
McChesney 1993).
Para la investigación de principios activos extraídos de plantas con aplicación
terapéutica ante el cáncer se recomienda seguir una serie de estrategias dentro de un
programa de investigación bien establecido, dicha investigación requiere de un esfuerzo
multidisciplinario de expertos en diferentes campos (McChesney 1993). El Instituto
Nacional del Cáncer en Estados Unidos (NCI) resume estas estrategias en 5 proyectos:
Proyecto 1. Adquisición de la muestra; para lo cual se requiere de una fuente natural
confiable, análisis de bases de datos, la recolección, clasificación taxonómica y
literatura especializada. La elección de la especie a evaluar puede basarse en las
metodologías anteriormente mencionadas. Es muy importante verificar de manera
preferente la autenticidad del material que va a ser evaluado, evitando así alguna
confusión debida al uso de nombres comunes en las diferentes comunidades, para lo
que se requiere de una carta de identificación botánica.
Proyecto 2. El material vegetal recolectado tras un proceso de secado, se somete a la
extracción con diferentes solventes, obteniéndose un extracto crudo (completo).

16
Proyecto 3. Evaluación in vitro de los extractos crudos empleando ensayos a corto
plazo, estos resultados deben correlacionarse con los del proyecto 5. La confirmación
de la actividad biológica a través de réplicas es extremadamente importante antes de
invertir en el fraccionamiento y purificación de sustancias sin actividad.
Proyecto 4. Pruebas de inhibición de la carcinogénesis de los extractos crudos, sus
fracciones y compuestos purificados en cultivos de órganos o modelos animales.
Proyecto 5. Síntesis y modificación de los principios activos aislados después de los
proyectos anteriores, una vez que haya sido elucidada su estructura química,
preparando una serie de compuestos derivados y observando la relación entre
estructura y actividad (McChesney, 1993; Pezzuto, 1995). También debe evaluarse la
toxicidad de los compuestos, su aplicación en tratamientos clínicos, su comercialización
y estudios agronómicos si es que se desea establecer el cultivo del vegetal. La figura 1
nos muestra la interrelación existente entre cada uno de los cinco proyectos
anteriormente expuestos.

Proyecto 1
Selección,adquisición,
e información acerca
de la planta
Proyecto 2 Proyecto 5
Extracción y Síntesis
aislamiento
Proyecto 3
Bioensayos
in vitro
Proyecto 4
Cultivo de órganos y
bioensayos in vivo

Figura 1. Interrelación entre los proyectos propuestos para la investigación de


nuevos productos naturales contra el cáncer. Es importante el desarrollo de los
bioensayos in vitro antes de proseguir con los proyectos 3 y 5. Tomado de Pezzuto,
1995.

Finalmente, es importante destacar que una vez determinada la utilidad de los


extractos, así como la elucidación de los principios activos debe también identificarse el
mecanismo de acción bioquímica a través del cual se lleva a cabo su actividad. Esta

17
actividad puede deberse a una inhibición de la progresión del ciclo celular, a un efecto
hormonal o antihormonal, según el tipo de cáncer de que se trate. La tabla 2 muestra
los principales eventos bioquímicos involucrados en las actividades antitumorales.

Tabla 2. Eventos bioquímicos que pueden determinarse para estudiar la actividad


de compuestos anticancerígenos, recomendaciones del Instituto Nacional del
Cáncer de Estados Unidos (Cordel y col., 1991).

Actividad a través de vías no específicas Efectos en el ADN


• Actividad carcinostática • Inhibición de la ADN polimerasa
• Inhibición de metástasis dependiente de DNA
• Inhibición de la promoción tumoral • Inhibición de la ARN polimerasa
• Recuperación de las células dañadas dependiente de ADN Efectos en el ADN
• Actividad antitumoral • Efectos de rompimiento en el ADN
• Inhibición de virus inductores de tumores • Efectos de intercalación en el ADN
• Promoción de la respuesta antitumoral • Inhibición/estimulación de la ADN metilasa
Alteración de vías de comunicación celular • Inhibición de las ADN polimerasas
• Estimulación de adenilato ciclasa • Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos
• Inhibidores del factor de crecimiento • Inhibición en la síntesis de purinas
epidermoide Antimitóticos
• Inhibición de la fosforilación de histonas • Actividad antimitogénica
Alteración de la resistencia a drogas • Actividad antimitótica
• Inhibición de la bomba de Ca +2 • Actividad antitubulina
• Incremento en la permeabilidad de la • Efecto sobre los microtúbulos
membrana Efectos sobre el ARN
• Inhibición de la reparación del DNA • Interacción con ARN
Citotoxicidad en líneas celulares tumorales • Inhibición de la ARN polimerasa (I, II, o III)
• Citotoxicidad en el ciclo celular • Inhibición de la síntesis de ARN
• Actividad citolítica Efectos hormonales
• Actividad citotóxica • Inhibición en la síntesis de colesterol
• Actividad antiproliferativa • Decremento en la unión a los receptores
Síntesis de proteínas hormonales
• Inhibición de la peptidil-transferasa • Inhibición de la esteroidogénesis
• Inhibición factores de iniciación de la • Actividad moduladora de la testosterona
cadena polipetídica
• Inhibición de la síntesis proteica

18
Existen diferentes modelos para evaluar la actividad antitumoral de productos naturales,
encontramos los cultivos celulares, en los que las células se hacen crecer en presencia
de los extractos o de los principios activos a corto o largo plazo, al final del cual puede
medirse la actividad de los mismos determinando el índice de citotoxicidad 50 (IC50), lo
que puede realizarse de diferentes maneras: cuenta con hemocitómetro de células
viables teñidas con algún colorante vital, medición de apoptosis celular por evaluación
de la integridad del ADN mediante southern blot o tinción nuclear con fluorocromos,
evaluación de la expresión de algunos metabolitos importantes, expresión de proteínas
a través de electroforesis o bien actividad enzimática (Badu y col., 1995; Price y col.,
1997; Kurokawa y col., 1999; Kuo y col., 1999; Quintero y col., 1999; Alfaro y col.,
2000). También pueden probarse los extractos en modelos animales (generalmente
ratas) implantadas con algún tumor sólido o no para posteriormente serles
administrados los extractos completos o bien fracciones de los mismos y con el paso
del tiempo medir el volumen y peso del tumor implantado, así como algún otro
parámetro que permita corroborar el estado fisiológico de los animales (Badu y col.,
1995; Palani y col., 1999). El NCI recomienda que la investigación realizada, inicie con
la experimentación in vitro, para lo cual se requieren pocas cantidades de material
vegetal y sobre todo, permite hacer observaciones preliminares para continuar con el
fraccionamiento y su aplicación en los modelos animales cuyo costo es mayor.

1.3 Cáncer

1.3.1 Mecanismos celulares involucrados en el desarrollo del cáncer


El término de Cáncer abarca a más de una centena de enfermedades caracterizadas
por el crecimiento anormal y sin control de células en diferentes partes del cuerpo
(Moss, 1998). Las células tumorales suelen derivarse de alguna que ha sufrido cambios
en su material genético debido mutaciones o bien a la incorporación del material
genético de algún virus oncogénico, y que como resultado no responde a los
mecanismos normales de control del ciclo celular (Pacheco, 2001).
Las células normales crecen y se diferencian a través de una compleja gama de
señales bioquímicas; de tal forma que las células nuevas son capaces por sí mismas de

19
interrumpir su crecimiento y diferenciarse en el tipo celular que les corresponde de
acuerdo a su herencia genética. Cuando las células pierden su capacidad de respuesta
adecuada continúan dividiéndose sin limitaciones originando así las neoplasias
(Maldonado y col., 1996). Las células tumorales, aumentan su proliferación,
incrementan su tendencia a invadir formándose metástasis (Figura 2), tienden a
optimizar los procesos anabólicos implicados en la proliferación tales como la síntesis
de DNA y RNA, economizando las funciones catabólicas (catabolismo de pirimidinas);
también pueden sintetizar proteínas fetales consideradas como marcadores tumorales
como el antígeno carcinoembrionario (DiSaia y col., 1999; Lodish y col., 1999). De
manera natural, las células que han sufrido un daño en su material genético son
susceptibles de corrección, de lo contrario sufren una muerte celular programada mejor
conocida como apoptosis, donde a diferencia de la necrosis no hay liberación del
contenido citoplasmático y por consiguiente no genera inflamación, el DNA es
degradado al igual que algunas proteínas y se producen cuerpos apoptóticos (Torriglia
y col., 1999; Pacher, 2000).

1.3.2 Factores genéticos y ambientales que pueden originar el cáncer


El cáncer tiene un origen multigenético y multifactorial; es decir se requiere de la
combinación de diversos factores ambientales y genéticos para que pueda
desarrollarse. Los agentes ambientales que participan en la generación del cáncer
pueden agruparse en tres categorías: las radiaciones ionizantes (rayos U.V., rayos X y
rayos gama, principalmente) que lesionan el ADN; las sustancias químicas que son
responsables de hasta el 80% de los cánceres humanos, dentro de estas encontramos
los derivados policíclicos aromáticos (dimetilbezantraceno, benzopireno y tres metil
colantreno), así como algunos metales (Ni, Cd, Co, Pb, Be), estos tienen un efecto
directo al unirse covalentemente a los ácidos nucleicos o bien requieren de ser
metabolizados (Pacheco, 2001); y, los virus oncogénicos que pueden integrar parcial o
totalmente su genoma al genoma de la célula hospedero (virus ADN o virus ARN con
retrotranscriptasa), el mecanismo empleado por estos virus ocurre cuando son
portadores de genes inductores de cáncer (oncogenes) o bien a través de
protooncogenes que al ser activados se convierten en genes cancerosos, algunos

20
ejemplos de virus oncogénicos son: virus del papiloma humano (HPV), virus de Epstein-
Barr, Hepadnavirus y virus de la leucemia de linfocitos T humanos, entre otros (DiSaia y
col., 1999; Howley y col., 2000).

Figura 2. Estadios o etapas principales en


el proceso de carcinogénesis, tras la
lesión que sufre la célula y el cambio
genético (mutación), esta comienza a
dividirse rápidamente sin control, una vez
formado el tumor, las células pueden
migrar generando metástasis.

1.3.3 Incidencia del Cáncer en el mundo y en México


El cáncer es una de las principales causas de muerte a nivel mundial; en la
mayoría de los países ocupa el segundo lugar después de las enfermedades
cardiovasculares (Moura y col., 2002). La incidencia de cáncer varía de una población a
otra; el más frecuente es el de seno, seguido por el de colon y recto y el de pulmón a
nivel mundial (O´brien y col., 2001); sin embargo el cáncer cervicouterino es el de
mayor importancia en las mujeres de los países subdesarrollados.

21
En México, el cáncer es también la segunda causa de muerte después de las
enfermedades cardiovasculares. El número de decesos por este padecimiento se ha
incrementado en las últimas décadas (tabla 3), tan sólo en el 2002 ocurrieron 58,360
decesos, es decir, un promedio de 159 muertes diarias por cáncer (Abdulllaev y col.,
2004); el cáncer es más frecuente en mujeres que en hombres (Figura 3) y el primer
lugar lo ocupa el cáncer cervicouterino (tabla 4). La OMS reporta que México ocupa el
primer lugar en mortalidad por cáncer cervicouterino (en mujeres mayores de 25 años),
por lo que se considera actualmente como un problema de salud pública y se necesitan
métodos de detección oportuna y tratamientos más eficaces (Martínez y col., 2004).

Tabla 3. Mortalidad en la población de México 1960 - 2000

Año Población Total de No. Índice total Índice de Porcentaje


muertes muertes por número muertes de muertes
por cáncer de muertes por cáncer por cáncer

1960 36,046,000 402,545 12,516 1,116.7 34.7 3.1

1970 48,958,341 485,656 18,415 991.9 37.6 3.8

1980 66,846,833 434,165 26,427 649.5 39.5 6.1

1990 81,249,645 412,214 41,168 507.3 49.3 9.7

2000 97,483,412 443,127 56,188 454.5 57.6 12.7

Índice de mortalidad para 100,000 habitantes. Fuente: Abdullaev y col., 2004

Tabla 4. Distribución por topología de los


principales cánceres en hombres y
mujeres en México, 1995. Fuente:
Registro Histopatológico de neoplasias
malignas en México (RHNMM), 1995.
Cuello uterino 21.5 %

Mama femenino 10.6 %

Próstata 5%

Figura 3. Porcentaje de incidencia de Estómago 3.9 %


cáncer en hombres y mujeres en México,
1995. Fuente: Registro Histopatológico de Ganglio linfático 3.7 %
neoplasias malignas en México (RHNMM), 22
1995.
1.3.4 Cáncer Cervicouterino

Como su nombre lo indica este tipo de cáncer se desarrolla en el cérvix o cuello del
útero de las mujeres, se asocia fuertemente con la presencia del virus del papiloma
humano, principalmente los tipos 16 y 18, aunque existen otros tipos oncogénicos
menos frecuentes, y existen también aquellos que sólo promueven el crecimiento de
neoplasias no malignas; además de la presencia viral, el CaCu, presenta otros factores
de riesgo como son el tabaquismo, la edad temprana en las relaciones sexuales, un
número alto de parejas sexuales y desnutrición, principalmente (Eifel y col., 2000;
Moura y col., 2002). El papilomavirus es un virus de ADN capaz de integrar su genoma
en el genoma de la célula infectada, al integrarse se inactiva la región de los genes
E1/E2, que mantienen bajo control la expresión de dos oncogenes virales E6 y E7. El
producto proteico de E6 se une al producto proteico del gen celular p53 promoviendo de
esta manera su degradación, p53 es un supresor de tumores, es responsable de
detener el ciclo celular para la reparación de ADN dañado y de llevar a la célula a
apoptosis. La proteína de E7 se une e inactiva a diferentes proteínas celulares,
incluyendo pRB (gen de susceptibilidad a retinoblastoma), esto detiene el ciclo celular
en la fase S de síntesis de ADN, lo que induce proliferación excesiva de las células que
han integrado al ADN viral (DiSaia y col., 1999; Howley y col., 2000; Bernard, 2004).

1.3.5 Tratamiento del cáncer cervicouterino.


Cabe mencionar que la prevención es la principal medida para el combate del cáncer
cervicouterino; se ha asociado la calidad de la alimentación con el desarrollo y
progresión de este cáncer, los nutrientes de importancia son: ácido fólico, ácido trans-
retinoico y -caroteno (Pezzuto, 1993; Allegra y col., 2000). Dependiendo del estadio en
el que se encuentre, es el tipo de tratamiento a ejercerse, cuando el cáncer se
encuentra en sus etapas iniciales, el tratamiento es quirúrgico, en casos muy severos y
avanzados se recurre a la histerectomía y a la aplicación de radioterapia y
quimioterapia (Tenorio, 1993). Con relación a la aplicación de quimioterapia, se han
investigado alrededor de 27 moléculas de estructura química conocida para el
tratamiento del CaCu (9 alcaloides, 7 saponinas, 3 heterociclos nitrogenados no
alcaloides, 3 sesquiterpenos, 2 quinonas, 1 flavona, 1 carotenoide y 1 proteína), sólo

23
cuatro se emplean en la terapeútica clínica: adriamicina (antraciclina microbiana),
bleomicina (glicopéptido microbiano), mitomicina C (alcaloide pirrolizado microbiano) y
la vincristina (alcaloide de origen vegetal), (Moura y col, 2002). No existe ninguna
publicación que avale la terapéutica de este cáncer mediante formulaciones o
recomendaciones de medicina tradicional.

1.4 Características de las plantas seleccionadas para este estudio


Las siguientes plantas se seleccionaron de las muchas que se emplean medicinalmente
en Cuetzalan del Progreso. La selección de estas plantas se hizo tomando en cuenta su
uso tradicional, su quimiotaxonomía y algunas propiedades biológicas reportadas en la
bibliografía.

1.4.1 Caña de venado (Costus pulverulentus). Del orden Zingiberal y familia


Costaceae, es también conocida como caña de jabalí, es una hierba cuyo tallo es
semejante a la caña, en la punta de la misma brota una mazorca de color amarillo-
rojizo; se emplea de manera tradicional para el espanto, el paño y la diarrea; los
especimenes pertenecientes a esta familia se distribuyen en las zonas tropicales,
principalmente en los bosques lluviosos. Algunos zingiberales (tabla 5) son empleadas
como medicina, agentes edulcorantes y fuente de colorantes; se han reportado
compuestos no polares como curcuminoides, pironas y gingeroles que poseen
actividades antifúngicas, antioxidantes, insecticidas, y antiinflamatorias (Martínez, 1979;
Cifuentes, y col., 1990; Flora Medicinal de México, 1994; Habsa, y col., 2000). En un
estudio, se evaluó la actividad antimicrobiana de trece especies zingiberales, de las
cuales, cuatro pertenecen al género Costus (C. discolor, C. megalobractea, C. spiralis,
C. villosissimus), se prepararon extractos polares (metanólicos) y no polares
(diclorometano) a quienes después de ser evaporados se les midió su actividad contra
Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus multirresistente, Pseudomonas aeruginosa,
Candida albicans y Aspergillus ochraceous; la mayor actividad la presentaron los
extractos no polares, Alpinia rafflesiana mostró mejor actividad antimicrobiana y el
extracto metanólico de C. discolor fue el único activo contra A. ochraceous (Habsa y
col., 2000). Costus spicatus, se ha utilizado tradicionalmente en Brasil para el

24
tratamiento de problemas en la vejiga y uretra, así como para expulsar piedras renales,
además se han identificado saponinas esteroidales que causan hemólisis ligera y
flavonas glicosidadas obtenidas de las hojas que han inhibido la producción de óxido
nítrico por macrófagos, en base a esto. En extractos acuosos de los tallos se
identificaron tres fracciones de polisacáridos neutros de glucosa, que poseen actividad
antiinflamatoria e inmunomoduladora ya que estimulan la fagocitosis y modifican la
permeabilidad capilar en el inicio de la inflamación (Pereyra da Silva y col., 2003).

Tabla 5. Actividades reportadas para plantas pertenecientes al orden


Zingiberal.
Actividad Especie Referencia
Antiinflamatoria C. spicatus Pereyra da Silva y col., 2002
Antimicrobiana A. rafflesiana Habsa y col., 2000
Inmunomoduladora C. discolor

1.4.2 Cojón de Gato (Tabernaemontana alba mill). Perteneciente a la familia


Apocynaceae, esta planta es característica de centro y sur América (Beek, y col., 1984).
Conocida también como huevo de perro, es un arbusto de aproximadamente 3 m de
altura, hojas largas y brillantes, flor amarilla; fruto comestible en forma de testículo de
perro o gato. Las hojas se emplean para la picadura de la araña capulín y el látex para
la curación de los granos (mezquinos) (Martínez, 1979; Beek y col., 1984; Cifuentes y
col., 1990; Flora Medicinal de México, 1994). La familia Apocynaceae se ha reportado
como fuente de importantes agentes medicinales (tabla 6), específicamente de indol
alcaloides, alcaloides quinolínicos, triterpenos y esteroides (Beek y col., 1984; Cardoso
y col., 1998; Lien y col., 1998; Kam y col., 2001; Whelan y col., 2003). Miembros de esta
familia e incluso del mismo género han sido evaluados para observar sus propiedades
medicinales, entre estos están: Catharanthus roseau, utilizada inicialmente para el
tratamiento de la diabetes mellitus y de la que actualmente se extraen los antitumorales
vinca alcaloides (vinblastina y vincristina), (Moss, 1998; Moura y col., 2002), Nerium
oleander, planta ornamental de las zonas tropicales y subtropicales, cuyo extracto
acuoso caliente es comercializado por la medicina tradicional china para el fallo

25
congestivo cardíaco, pero que de forma tradicional se emplea para los epiteliomas, el
herpes, psoriasis, entre otras; la fracción no polar fue probada para identificar su
actividad citotóxica sobre la línea celular BRO de melanoma humano, siendo su IC50 de
1.6 µg/ml, tal parece que los responsables de dicha actividad fueron los glicósidos
cardíacos oleandrín y oleandrigenín (Newman y col., 2001); Willughbeia
cochinchinensis, empleada en la medicina tradicional thaiwanesa cuyos extractos
acuoso y alcohólico se probaron en células de cáncer de pulmón (COR-L23),
adenocarcinoma de colon (LS-174T), adenocarcinoma de mama (MCF-7 y
keratinocitos (SVK-14), siendo más activo el extracto alcohólico sobre la línea COR-L23
con un 48 % de sobrevivencia (Itharat y col., 2004). Con respecto a plantas del mismo
género han sido investigadas T. catharinenesis y T. divaricata; de la primera se
comprobó la actividad de tres fracciones del extracto acuoso en cáncer de mama (SK-
BR-3), su mayor actividad fue del 66.3 % de citotoxicidad; análisis químicos de las
fracciones indican que su naturaleza es de alcaloides indol terpénicos (Almeida y col.,
1999); el extracto metanólico de T. divaricata suprimió la proliferación de células
mesangiales activadas con dos interleucinas (IL-1B y IL-6), siendo su IC50 de 50 µg/ml
(Kuo y col., 1999).

Tabla 6. Principales actividades farmacológicas de sustancias extraídas de la familia


Apocynaceae.

Actividad Especie Referencia


Antitumoral C. roseau Moss, 1998; Moura y col., 2002
N. oleander Newman y col., 2001
T. catharinenesis Kuo y col 1999
T. divaricada Almeida y col., 1999., Kuo y col 1999
W. cochinchinensis Itharat y col., 2004

26
1.4.3 Espinoso (Sechium edule (Jacq.) Swartz). Perteneciente a la familia
Cucurbitaceae y conocida también como chayote, es una planta comestible subtropical,
trepadora, pubescente, de hojas cordadas, de raíz acuosa (camote) de color café claro.
El tronco de la guía es semileñoso y posee flores pequeñas amarillentas y dispersas;
fruto ovoide con espinas. Se emplea en la medicina popular para bajar la presión
sanguínea, como diurético y para las piedras del riñón al combinarse con matasano
(Mártínez, 1979; Cifuentes y col., 1990; Flora Medicinal de México, 1994; Diré y col.,
2003). Algunos miembros de esta misma familia (tabla 7) han demostrado poseer
actividad antitumoral, tal es el caso de Cucurbita andreana, de la que después de ser
extraída con agua y metanol se obtuvieron cuatro triterpenos tetracíclicos altamente
oxigenados llamados cucurbitacinas, que redujeron la proliferación de líneas de cáncer
de colon (HCT-116), mama (MCF-7), pulmón (NCI-H460) y sistema nervioso central
(SF-268) a dosis de 0.4 µM, siendo la cucurbitacina B la de mayor actividad (desde un
96% - 87% de inhibición) (Jayaprakasam y col., 2003).
La formulación herbolaria de Muthu Marunthu ha sido empleada para el tratamiento del
cáncer, está compuesta de ocho diferentes plantas, de las cuales Collarocarpus
epigaeus Hk.f (Cucurbitaceae) representa el 5 %; el extracto acuoso de esta fórmula se
administró oralmente a ratas trasplantadas con células tumorales y se midió el tamaño y
peso del tumor con respecto al tiempo, observándose una disminución en el desarrollo
tumoral de casi 50 % en las ratas tratadas (Palani y col., 1999). Específicamente
hablando de S. edule, existen dos reportes acerca de su actividad biológica, en uno se
extrae el fruto con solución salina y se le administra oralmente a ratas que han
consumido también marcadores radiactivos detectables en plasma, así se demostró que
el chayote es capaz de alterar el marcaje radiactivo ya que genera metabolitos
radiactivos con propiedades oxidantes (Feliciano y col., 2003); en el otro, se obtienen
extractos alcohólicos de esta planta y se prueba su actividad antimicrobiana contra
Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa negativa,
Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactie (gram positivos) por ensayo de
difusión en disco, encontrándose las mayores actividades para los extractos alcohol-
agua al 90 % (semillas) y al 80 % (hojas), las dosis mínimas inhibitorias son de 8.32-
16.64 µg/ml y 4.16 - 8.32 µg/ml respectivamente (Ordoñez y col., 2003).

27
Tabla 7. Propiedades farmacológicas de la familia Cucurbitaceae
Actividad Especie Referencia
Antitumoral C. andreana Jayaprakasam y col., 2003
C. epigaeus Palani y col., 1999
Antimicrobiana S. edule Ordoñez y col., 2003
Oxidante S. edule Diré y col., 2003

1.4.4 Huichin y Ocma (Verbesina persicifolia y Vernonia patens HBK,


respectivamente. Familia Compositae o Asteraceae). El Huichin, es una planta de 2
– 3 m de alto, de hojas ásperas, flores amarillas, frutos con manchas negras y blancas.
Florea todo el año; se emplean las hojas para la diabetes, úlceras y llagas en la piel. La
Ocma es un arbusto de 5 – 8 m de altura, tallo delgado y de color café sin espinas,
hojas verdes cuando son maduras y verde limón las más tiernas, siendo además
blandas y de forma ovalada con vellosidades; flores pequeñas de color blanco; su uso
medicinal es para ahumar a los niños pequeños y llorones; para los piquetes de víbora,
los desórdenes menstruales, la caída del cabello, la disentería y la coagulación
(Martínez, 1979; Cifuentes y col., 1990; Flora Medicinal de México, 1994; Campos y
col., 2003). La familia Compositae (tabla 8) es reconocida como una de las principales
dentro de la medicina tradicional de todo el mundo, se han investigado sus actividades
terapéuticas como la hepatoprotectora, colagoga, antiinflamatoria, hipoglucemiantes,
gastroprotectora, inmuno-moduladora y citotóxica, entre otras, observándose una
marcada propiedad antiinflamatoria en el caso de Calendula officinalis,
Chrysanthemum spp, Artemissia rupestris L. y la inmunomoduladora en Echinacea spp.
La mayoría de las actividades farmacológicas son atribuidas a la presencia de
flavonoides, sesquiterpenos, triterpenos, saponinas y sinafil alcoholes (Marculescu y
col., 2001; Marukami y col., 2001; Yoshikawa y col., 2001; Ukiya y col., 2001; Halike y
col., 2002; Barrett, 2003; Whelan y col., 2003). Con respecto a la actividad antitumoral
de esta familia, los taxanos (docetaxel y paclitaxel), empleados clínicamente para el
tratamiento de algunos cánceres son extraídos de Taxus brevifolia y T. baccata (Da
Rocha y col., 2001); la fracción metanólica de los extractos alcohólicos de las partes

28
aéreas de Mikania hirsutissima generó 11 compuestos que mostraron actividad
citotóxica en células de leucemia (L 1210) a una dosis de 25 µg/ml (Ohkoshi y col.,
1999). En Rusia, se evaluaron 45 plantas por su actividad antiproliferativa en la misma
línea celular (L 1210), como resultado los extractos de cloruro de metileno de once
plantas asteraceas fueron activos entre el 80 - 100 % a una dosis de 10 µg/ml, la
naturaleza química de los extractos fue principalmente de taninos, terpenos, flavonas,
saponinas y glucósidos (Goun y col., 2002).
Un estudio similar en Brazil demostró la actividad citotóxica de los extractos acuosos y
orgánicos de Baccharis coridifolia, B. ochracea, Eupatorium macrocephalum, E.
pedunculosum y Stenachaenium riedelli sobre tres líneas celulares de glioblastoma
humano ( HT29, NCI-H460 y U373) a dosis menores de 5 µg/ml (Monks y col., 2002);
de las flores de Chrysanthemum morifolium y Ligularia nelumbifolia, se han aislado
triterpenos dioles y sinafil alcoholes activos sobre cáncer de colon, de pulmón,
melanoma, sistema nervioso central, ovario, riñón, nasofaringe y leucemia (Ukiya y col.,
2002; Zhao y col., 2002).

Tabla 8. La familia Compositae es una de las de mayor riqueza farmacológica, incluyendo la


actividad antitumoral; a continuación se presentan algunas plantas de importancia y sus
actividades.

Actividad Especie Referencia


Inmunomoduladora Echinacea spp Barrett, 2003; Halike y col., 2002;
Antiinflamatoria Artemissia rupestris L. Marculescu y col., 2001;
Calendula officinalis Marukami y col., 2001;
Chrysanthemum spp; Ukiya y col., 2001; Whelan y col., 2003;
Yoshikawa y col., 2001
Antitumoral T. brevifolia Da Rocha y col., 2001
T. baccata
M. hirsutissima Goun y col., 2002
B. coridifolia, B. ochracea, Monks y col., 2002
E. macrocephalum
E. pedunculosum, S. riedelli
C. morifolium, L. nelumbifolia Ukiya y col., 2002; Zhao y col., 2002

29
El género Verbesina (tabla 9), ha sido investigado por la actividad antiinflamatoria e
hipotensiva (V. turbacensis y V. caracasana, respectivamente) de extractos
metanólicos, de estos se ha podido aislar cinamatos y derivados de guanidina (Lobitz y
col., 1998; Botta y col., 2003).

Tabla 9. Actividades farmacológicas reportadas para el género Verbesina


Actividad Especie Referencia
Antiinflamatoria V. caracasana Botta y col., 2003;
Hipotensiva V. turbacensis y Lobitz y col., 1998
Molusquicida V. clausseni Mendes y col., 1999

Del género Vernonia se ha realizado una mayor investigación, en lo referente a su


citotoxicidad, V. anthelmintica inhibió la proliferación de dos líneas celulares de cáncer
de mama (MCF7 y MDA-MB-231) a dosis menores de 2.5 µg/ml del extracto
hidroalcólico (Lambertini y col., 2004). Otras actividades comprobadas in vitro e in vivo
para el género Vernonia se resumen en la tabla 10.

Tabla 10. Actividades terapéuticas investigadas para el género Vernonia.


Actividad Especie Referencia
Analgésica V. cinerea Less Iwalewa y col., 2003
Antiinflamatoria V. cinerea Less. Mazumder y col., 2003; Iwalewa, et al., 2003
V. anthelmintica Willd Pires y col., 2002
Antipirética V. cinerea Less. Iwalewa y col., 2003
Citoprotectora V. lasiopusand Dahanukar y col., 2000
V. galamensis
Hipotensora V. polyanthes Less. Da Silveira y col., 2003
Relajante V. condensata Campos y col., 2003
muscular

30
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La OMS reporta que México ocupa el primer lugar en muertes por cáncer
cervicouterino, por lo que se considera a este como un problema de salud pública. Los
esquemas terapéuticos empleados para el tratamiento de este problema de salud son
caros y la mayoría ocasionan en las pacientes severos efectos colaterales que
menguan la calidad de vida de las mismas; aunado a esto se ha observado que muchos
pacientes pueden presentar resistencia a los quimioterápicos, por lo que se requiere de
la investigación de nuevos principios activos que puedan ser útiles en tales casos.

31
3. JUSTIFICACIÓN

Debido a que el cáncer constituye un problema de salud pública en México, siendo la


segunda causa de muerte en el año 2001, y observándose un incremento del 64.7% en
el número de casos con predominio del sexo femenino (en especial a la incidencia del
cáncer cervicouterino); a que el costo de los tratamientos es elevado, con un gran
número de efectos colaterales que pueden minar la calidad de vida de los pacientes y a
que puede presentarse resistencia a los mismos; se hace necesaria la investigación de
nuevos principios activos que puedan brindar mayores ventajas que los ya establecidos,
se suma a esto la importancia del rescate de la medicina tradicional y el desarrollo que
puede generar su empleo y comercialización para mejorar las condiciones de vida de
comunidades rurales como en Cuetzalan del Progreso en el estado de Puebla.
Por lo anterior, se realizó este trabajo de investigación cuyo principal objetivo
fue la evaluación de plantas utilizadas en la medicina tradicional de Cuetzalan que
puedan contener principios activos útiles en el tratamiento de uno de los cánceres más
frecuentes en la mujer, el cáncer Cervicouterino.

32
4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general


Evaluar la inhibición que sobre la proliferación y el desarrollo de colonias tumorales de
células SiHa tienen los extractos acuosos e hidroalcohólicos obtenidos de cinco plantas
empleadas en la medicina tradicional de Cuetzalan.

4. 2 Objetivos específicos
1.- Seleccionar con base en los conocimientos tradicionales y bibliográficos plantas con
potencial actividad antitumoral.
2.- Producir extractos etanólicos y acuosos de C. pulverulentus, Sechium sp.,
Tabernaemonatna sp., Verbesina persicifolia y Vernonia sp.
3.- Evaluar el efecto de los extractos acuosos sobre la proliferación y viabilidad de
monocapas de células SiHa.
4.- Evaluar el efecto de los extractos hidroalcohólicos en la proliferación y viabilidad de
monocapas de células SiHa
5.- Evaluar el efecto de los extractos acuosos en la formación y proliferación de colonias
tumorales de células SiHa.

5. HIPÓTESIS

Los extractos acuosos e hidroalcohólicos de C. pulverulentus, Sechium sp,


Tabernaemontana sp, V. persicifolia y V. patens poseen actividad antiproliferativa sobre
la línea celular SiHa derivada de cáncer cervicouterino.

33
6. MATERIAL Y METODOS

6.1 Selección del material a evaluar


La selección de plantas se hizo con relación a lo recomendado por la bibliografía
(McChesney, 1993 y Pezzuto, 1995). Primero se realizó una revisión bibliográfica
acerca de algunas plantas que poseían actividad antitumoral o estaban en
investigación, de las cuales se destacó la familia, el género y la especie; mientras tanto,
se solicitó a las mujeres que forman parte de la cooperativa agropecuaria regional
Tosepan titataniske (Unidos venceremos) ubicada en Cuetzalan, un listado con las
plantas que ocupan de manera tradicional en el tratamiento de diversos padecimientos,
con los datos más relevantes (nombre común de la planta, su abundancia, forma de
reproducción y usos). Por otra parte, se revisaron estudios etnobotánicos anteriormente
realizados en la región (Martínez, 1979; Cifuentes y col. 1990; Flora Medicinal de
México, 1994) estos contienen el nombre común, nombre científico, familia, descripción,
usos, farmacología y composición química general de sus extractos. En base a lo
anterior, se determinaron tres criterios de selección que permitieron elegir a las plantas
a evaluar, los criterios fueron los siguientes:
a) empleo tradicional
b) quimiotaxonomía
c) actividad biológica

6. 2 Recolección y manejo de ejemplares


La recolección de los especimenes se realizó en dos diferentes estaciones del
año: otoño del 2002 y primavera del 2003; para cada ejemplar recolectado se elaboró
una ficha de información que contiene fecha de recolección, nombre común, lugar y
comunidad de recolección, descripción física, uso tradicional y forma de uso (anexo 1).
Una vez realizada la recolección, los ejemplares fueron etiquetados y secados en horno
a una temperatura menor de 40 º C; posteriormente se trituraron y se almacenaron en
frascos ámbar a temperatura ambiente.

34
Para realizar la clasificación taxonómica, los ejemplares fueron depositados en el
herbario de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP).

6. 3 Obtención de los extractos


5g de follaje seco y triturado fueron introducidos a cartuchos de papel filtro para
su extracción en un equipo soxleth, siguiendo un orden ascendente de polaridad (éter
de petróleo, acetato de etilo, etanol y agua, los tiempos y temperaturas de extracción
fueron para éter de petróleo: 12 h a 50 ºC; acetato de etilo: 12 h a 55 ºC; etanol: 24 h a
65 ºC; y agua: 6 h a 80 ºC.
El follaje seco y triturado se extrajo también por maceración. Para la maceración
la planta se puso en contacto con los solventes (éter de petróleo, acetato de etilo,
etanol y agua, en orden ascendente de polaridad) en un porcentaje peso volumen del
10% (30 g de planta en 300 ml de solvente), a temperatura ambiente, en oscuridad, y
agitación continua de 150 rpm en un agitador orbital (Betancourt y col., 1999). El
tiempo de maceración empleado para cada solvente fue de 24 h. Para la obtención de
tinturas hidroalcohólicas, las plantas se pusieron en contacto con una solución de etanol
al 70%, con agitación manual cada 48 h durante siete días (Saldierna y col., 2001). Los
extractos fueron filtrados a través de membranas con poro de 0.22 µm (Millipore) y
después de resuspenderlos, se tomaron alícuotas que fueron evaporadas para
determinar la concentración en miligramos por mililitro de sólidos presentes en el
extracto crudo.

6.4 Determinación de las condiciones óptimas de experimentación


Para verificar el efecto de los extractos sobre la proliferación se empleó la línea celular
SiHa, esta línea se aisló de una paciente de 55 años de edad con carcinoma escamoso
de cérvix, dichas células poseen de 1 a 500 copias de papilomavirus tipo 16 (Sharp y
col., 1999).
En todos los experimentos se utilizaron células SiHa cultivadas con medio minimo
esencial de Eagle (MEM) complementado con 5% de suero fetal bovino (SFB) a 37ºC
en una incubadora para cultivo celular con atmósfera húmeda y 5 % de CO2. Las

35
observaciones morfológicas se realizaron con un microscopio invertido de contraste de
fase y con un microscopio estereoscópico.

6.4.1 Cuantificación celular con azul tripano. El número de células se determinó en


un hemocitómetro (cámara de Neubauer). Las células de separaron de la monocapa
mediante tratamiento con tripsina al 0.25% y se resuspendieron en medio MEM; a
continuación se prepararon diluciones 1:10 con el colorante azul tripano, se mezclaron y
se colocó una muestra en el hemocitómetro. Al microscopio se observa una cuadrícula
formada por cuadros grandes y pequeños, el número de células presentes en los 4
cuadros grandes de los extremos, se multiplicó por 2,500 y por la dilución realizada; de
esta forma se obtuvo el número de células por mililitro (Correa y col, 2000).

6.4.2 Curva de crecimiento celular. Para determinar la curva de crecimiento se


emplearon tres concentraciones celulares iniciales de 10000, 30000 y 50000 células/ml.
Las células se sembraron en placas de cultivo de 24 pozos y se incubaron cinco días a
37ºC. Cada experimento se realizó por triplicado. Esta curva se realizó para verificar la
cantidad óptima de células que deberían ser sembradas al inicio de los experimentos y
el tiempo en el que alcanzaban su mayor índice de proliferación.

6.4.3 Ensayo para la evaluación de viabilidad celular. En este ensayo se determina


el número de células viables de acuerdo a su actividad mitocondrial, se basa, en la
reducción de sales monosódicas de tetrazolium a formazán por deshidrogenasas
mitocondriales (lactato deshidrogenasa); la coloración amarilla de las sales cambia al
azul de los cristales de formazán. La cantidad de formazán generado por la actividad de
las deshidrogenasas mitocondriales es proporcional al número de células vivas. El
proceso es descrito a continuación.

6.4.3.1 Curva de concentración celular contra densidad óptica


La sal MTT fue disuelta en buffer de fosfatos (PBS, pH 7.2-7.4) a una
concentración de 5 mg/ml y se almacenó a 0ºC, Diferentes concentraciones de células
(5000, 25000, 125000 y 250000) se colocaron en 90 µl de PBS con o sin 5% de suero

36
neonato bovino (SNB) y 10 µl de la solución de MTT en placas para cultivo celular de 96
pozos; muestras similares se incubaron a diferentes tiempos (1 h y 1.5 h) para
determinar el tiempo en el que había una adecuada formación de cristales de formazan.
Al finalizar el tiempo de incubación los cristales de formazán se disolvieron con 90 µl de
una solución de Tritón X-100 al 10% e isopropanol anhidro ácido (HCl al 0.1 N); la
lectura de la reacción se realizó en un espectrofotómetro para microplacas a una
longitud de onda de 570 nm para la lectura y de 630 nm como referencia (Quintero y
col, 1999). Este experimento se efectuó dos veces, cada una con cuatro réplicas.

6.4.3.2 Curvas dosis-respuesta para sulfato de bleomicina y etanol. Células SiHa


en medio MEM con 5 % de SFB (10000 células/200 µl) fueron incubadas a 37ºC, a las
24 h se le cambió el medio por medio fresco conteniendo diferentes concentraciones de
sulfato de bleomicina (0, 0.1, 1, 10, 100 µg/ml) o diferentes volúmenes de alcohol etílico
al 70 % (0, 0.1, 1, 10, 100 µl), después de 72 h de incubación se determinó la viabilidad
celular con MTT. Los experimentos para ambas curvas se realizaron en placas para
cultivo celular de 96 pozos por quintuplicado. La curva dosis-respuesta con bleomicina
se utilizó como testigo positivo de inhibición de la proliferación y de actividad citotóxica.
La curva dosis-respuesta con etanol se llevó a cabo para observar el efecto del etanol
sobre el crecimiento celular, ya que éste es utilizado como vehículo en los extractos
hidroalcohólicos.

6.4.4 Cultivo celular en medio semisólido para la formación de colonias tumorales


Primero se prepararon suspensiones de agarosa al 2% y de carboximetilcelulosa (CMC)
al 1.36% y 2.72% en agua ultrapura, se esterilizaron en autoclave a 121ºC, 15 libras de
presión, 15 min, se dejan enfriar y se mantienen a 4ºC hasta su uso. Al momento de
usarse, las soluciones de agarosa y CMC se colocan en un baño maría a 45ºC. Por
otra parte, se preparó medio de cultivo MEM a una concentración 2X con 10% de SFB,
se esterilizó por filtración (0.22 µm) y se mantuvo en baño maría a 45ºC. Pasos a seguir
al momento de realizar el experimento (modificado de Freshney, 1991; Figura 4):
1. Se mezclan 1 ml de agarosa con 1 ml de MEM 2x precalentados y se colocan en
cada pozo de una placa para microensayo de seis pozos y se deja solidificar.

37
2. Las células de una monocapa se resuspenden con tripsina, se lavan y se
cuentan como ya se mencionó. Se toma el volumen necesario para obtener
concentraciones finales de 10000, 50000 y 100000 células/2 ml. Las células se
diluyen en 1 ml del medio MEM 2X preparado previamente.
3. Las células en MEM 2x se mezclan con un volumen igual de CMC precalentada y
se colocan sobre la base de agar en las placas de 6 pozos. Las placas se
incuban en atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37ºC.
4. Las colonias se forman en la interfase entre el agar y la CMC
5. Se adicionó medio fresco cada tercer día

CMC al 2.72% + MEM 2X, 10 % SNB


Agarosa al 2 %

45 º C MEM 2X, 10 % SNB Mezcla 1:1 CMC - MEM

2 ml 100 000células SiHa

Mezcla 1:1 Agarosa - MEM 2 ml


4ºC

Se incuban a 37 º C, atm. con


5% CO2 por 8 días

Figura 4. Ensayo para la selección de clonas formadoras de colonias tumorales,


células SiHa se colocan en un medio semisólido con CMC (carboximetilcelulosa) y
medio MEM 2X, sobre una base de agarosa, también con medio MEM 2X, cada
tercer día se adicionan 500 µl de la mezcla MEM-CMC.

Las células se incubaron durante dos semanas hasta observar la formación de colonias
tumorales. Las colonias que podían observarse a simple vista se retiraron con la ayuda
de una micropipeta y se depositaron en otra placa bajo tres condiciones diferentes de
cultivo: mezcla 1:1 de MEM-CMC, mezcla 1:2 de MEM-CMC y MEM solo (Figura 5).

38
Suspensión celular
Focos tumorales

CMC + MEM MEM CMC + MEM


Base de agar 1:1 2:1 2X

Figura 5. Aislamiento de las colonias tumorales desde el medio semisólido, las


condiciones que les permitieron sedimentar y crecer en monocapa para cultivo
continuo fue el empleo de medio MEM suplementado con 5 % de SFB.

6.5 Pruebas para determinar la actividad biológica de los extractos


6.5.1 Ensayos para la evaluación de la actividad antiproliferativa. Se colocaron
10000 células/200µl por pozo en placas de 96 pozos y se incubaron con MEM al 5% de
SNB en atmósfera de CO2 (5%) a 37 ºC por 24 h, pasado este tiempo el medio se retiró
y fue sustituido por medio fresco con los extractos (acuoso o hidroalcohólico) de las
plantas seleccionadas, a diferentes concentraciones (0.1, 1, 10 y 100 µg/ml); los
extractos hidroalcohólicos también se probaron a 6.25, 12.5, 25, 50, 75 y 100 µg/ml
para poder determinar el índice de citotoxicidad 50 (IC50).. Después de un periodo de
incubación de 72 h, se cuantificó la viabilidad celular con MTT (Figura 6) y el número de
células con azul de tripano (sólo en los ensayos con extractos acuosos). Como testigos
negativos se colocaron células sin extracto, como testigos positivos de citotoxicidad se
emplearon células tratadas con sulfato de bleomicina (100 µg/ml) (Popota y col., 1998;
Betancurt y col., 1999; Kamuhabwa y col., 2000). Los experimentos se realizaron por
triplicado, cada uno con tres réplicas.

39
10,000 células SiHa

Cultivo por 24 h
MEM 5 % SFB, 37 ºC, 5
Placa de 96
% CO2
pozos

Evaluación de la actividad
metabólica por el ensayo
colorimétrico MTT y conteo de
células teñidas con azul de Cambio de medio: MEM con
tripán extracto por 72 h, 5 % SFB, 37
ºC, 5 % CO2
Figura 6. Esquematización de la prueba para evaluar la actividad de los extractos sobre
la proliferación celular, las dosis probadas fueron: 0, 0.1, 1, 10, y 100 µg/ml, en el caso
de los extractos hidroalcohólicos, se probaron también las dosis de 0, 6.25, 12.5, 25, 50,
75 y 100 µg/ml.

6.5.2 Ensayo para evaluar la actividad de los extractos en la formación de


colonias tumorales. 10000 células formadoras de colonias se colocaron en 500 µl de
la mezcla CMC-MEM 2x (1:1) que contenía diferentes concentraciones (0, 0.1, 1, 10, -
100 µg/ml) de los extractos acuosos de Tabernaemonana sp y V. patens; las
suspensiones celulares se colocaron sobre una base de agarosa-MEM 2x (500 µl)
previamente solidificado en placas de 24 pozos y se incubaron por 96 h a 37ºC en
ambiente de CO2. En este experimento se hicieron dos tipos de observaciones una
cualitativa, donde las colonias se fueron observando cada 24 h para ver el patrón de
proliferación y estado de las células y otra cuantitativa al finalizar las 96 h de incubación
para determinar el número de células en las colonias tumorales de cada pozo a través
del ensayo MTT. Se dispusieron también de células cultivadas sin extractos y células
tratadas con sulfato de bleomicina (100 µg/ml). Cada experimento se realizó por
triplicado (Figura 7).

40
Agarosa al 2 % CMC al 2.72% + DMEM 2X con
10 % SFB y
extracto

Mezcla 1:1 CMC y DMEM


45 º C DMEM 2X con con extracto (0, 0.1, 1, 10
10 % SFB y 100 µg/ml)

10 000 clonas tumorales 1 ml

Mezcla 1:1 de agarosa -DMEM 1 ml

4ºC

Se incuban a 37 º C, atmósfera con


5% CO2, por 96 h. Ensayo MTT

Figura 7. Ensayo realizado para probar el efecto de los extractos acuosos en el desarrollo
de las colonias tumorales, la concentración empleada fue de 10 000 clonas tumorales/ ml
de medio semisólido.

6.6 Análisis estadístico. Los resultados fueron analizados estadísticamente por la


Prueba de Tukey-Kramer que es una prueba de comparación múltiple de medias con
una p < 0.05.

6.7 Cálculo de los Índices de citotoxicidad al 50 % (IC50). El IC50, se obtuvo a través


de una línea patrón calculada por regresión lineal a partir de las curvas de dosis-
respuesta para cada extracto (viabilidad celular).

41
7. RESULTADOS

7.1 Selección del material a evaluar


El municipio de Cuetzalan del Progreso se encuentra ubicado a 450 msnm. 20º5’05”
latitud Norte y 96º30´42” longitud Oeste, el clima de esta región es, semicálido (el más
cálido de los templados) con temperatura promedio anual de 18-24ºC, húmedo con
lluvias todo el año con una precipitación media anual de 3,422.4 mm (INEGI, 2000). De
la cooperativa se obtuvo una lista de 91 plantas (ver anexo 2) de uso tradicional, en ella
se destacaron 4 plantas que mezcladas eran recomendadas para el tratamiento del
cáncer (árnica, espinoso, huichin y sábila), de estas, la sábila y el árnica no se
contemplaron para nuestro estudio porque ya existen investigaciones en este campo
(Kim y col., 1999; Quintero y col., 1999). Además, se efectuó una búsqueda
bibliográfica de las plantas de uso médico en la región; se preseleccionaron así catorce
de ellas; la recolección de los materiales biológicos se llevó a cabo en base al nombre
común de los ejemplares. Finalmente se seleccionaron sólo cinco plantas, de acuerdo a
su empleo tradicional, quimiotaxonomia, actividad farmacológica reportada por la
bibliografía y la composición química de sus extractos, siendo: Caña de venado, Cojón
de gato, Espinoso, Huichin y Ocma.

Figura 8. Caña de venado (C. Figura 9. Espinoso (Sechium sp.), de


pulverulentus), empleada tradicionalmente manera tradicional se emplea para
para el mal de orín, paño y diarrea. presión y los cálculos renales.

42
Sólo fue posible realizar la clasificación taxonómica hasta especie de Caña de venado
(Costus pulverulentus) con número de registro 12211 (Figura 8), Huichin (Verbesina
persicifolia) con número de registro 12130 (Figura 11) y Ocma (Vernonia patens) con
número de registro 12129 (Figura 12). Cojón de gato (Tabernaemonata sp.; Figura 10)
y Espinoso (Sechium sp.; Figura 9) sólo pudieron ser clasificadas hasta género debido
a que no se contó con ejemplares con flor.

Figura 10. Cojón de gato (Tabernaemontana Figura 11. Huichin (V. persicifolia),
sp.), empleada tradicionalmente para la empleada para la diabetes, élceras y
mordedura de capulín, los granos, y las llagas riñones

Figura 12. Ocma (V. patens), empleada


tradicionalmente para la diarrea y para los
niños llorones 43
7.2 Extractos obtenidos
Se obtuvieron extractos por maceración acuosos e hidroalcohólicos (tinturas)
para cada planta en estudio, de los que se probaron in vitro sólo el acuoso y el
hidroalcohólico. Las concentraciones de sólidos presentes en las maceraciones fueron:

Tabla 11. Concentración de los extractos vegetales obtenidos por maceración, la


determinación se realizó tras la evaporación de los solventes.
Planta maceración acuosa maceración hidroalcohólica
(mg/ml) (mg/ml)
C. pulverulentus 8.70 mg/ml 14.36 mg/ml
Sechium sp. 2.56 mg/ml 13.6 mg/ml
Tabernaemontana sp. 9.63 mg/ml 10.8 mg/ml
V. persicifolia 12.60 mg/ml 22.96 mg/ml
V. patens 5.25 mg/ml 16.3 mg/ml

7.3 Condiciones óptimas de experimentación en cultivos celulares.


7.3.1 Curva de crecimiento de células SiHa. Como resultado de la cinética de
crecimiento, se pudo determinar que el tiempo al que las células presentaron la mayor
densidad poblacional es a las 96 h (Figura 13).

200000
Número de células

150000

100000

50000

0
0 24 48 72 96 120

Tiempo (hr)

Figura 13. Cinética de crecimiento en células SiHa, se puede


observar una mayor proliferación a las 96 h de incubación. Las
células fueron cuantificadas con azul tripano.

44
7.3.2 Determinación de la viabilidad celular con MTT y curva de concentración
celular contra densidad óptica. Las condiciones óptimas para la realización de estos
ensayos son la incubación de las células con MTT disuelto en PBS con 5% de SNB
durante una hora a 37ºC, tiempo en el cual existe la suficiente actividad mitocondrial
como para dar una señal detectable en el espectrofotómetro. También se determinó
que las mejores lecturas para el ensayo de MTT se obtienen a longitudes de onda de
550 nm utilizando el filtro de 620 nm como referencia. Los volúmenes de reactivos
empleados fueron: 90 µl de PBS con 5% de SNB, el 10% de este volumen de MTT
diluido en PBS, al finalizar el tiempo de incubación, los cristales de formazán se
disolvieron con 100 µl de isopropanol ácido. La curva de concentración celular contra
absorbancia mostró que un inóculo inicial de 5,000 células es suficiente para dar una
señal detectable en el espectrofotómetro; también se encontró que las concentraciones
celulares mayores (125,000 y 250,000 células) no mostraron un patrón de saturación de
color. Esto permitió realizar los ensayos en un rango de concentración celular amplio.

7.3.3 Curva dosis-respuesta para el sulfato de bleomicina. La bleomicina es un


glicopéptido antitumoral aislado de Streptomyces verticelius, que rompe al ARN y los
complejos ADN-ARN y es utilizada en el tratamiento de cáncer de cérvix, por lo tanto lo
empleamos como control positivo en los ensayos de citotoxicidad, la curva dosis-
respuesta muestra que la bleomicina (100 µg/ml) redujo 36.8% (p<0.05) la viabilidad
celular en comparación con el testigo no tratado (Figura 14, tabla 12).

120
% Viabilidad celular

100
80

60
40

20
0

0 0.1 1 10 100

Conc. (µg/ml)

Figura 14. Curva dosis-respuesta de Bleomicina, la dosis


efectiva fue la de 100 µg/ml y la IC50 de 124.4 µg/ml.

45
Tabla 12. Viabilidad de células SiHa, después
de la administración de bleomicina por 72 h.

Dosis (µg/ml) % Viabilidad celular


0 100
0.1 100
1 84
10 77.3
100 58.4

7.3.4 Curva dosis-respuesta para etanol. Como los extractos hidroalcohólicos fueron
administrados a las células utilizando etanol como vehículo, fue necesario demostrar
que la adición de diferentes volúmenes de alcohol etílico al 70 % sin extracto no
afectaba la multiplicación celular, pudo observarse que no hay efecto significativo
(p<0.05), (Figura 15).

0.150
O.D. 550

0.100

0.050

0.000
0 0.1 1 10 100

Etanol (µl)

Figura 15. Efecto de diferentes dosis de etanol sobre el crecimiento


de las células SiHa, las concentraciones empleadas son las mismas
que se emplean con el extracto, el tiempo de incubación fue de 96
h.

46
7.3.5 Formación de clonas tumorales en un medio semisólido.
Es común observar en los cultivos de células SiHa en monocapa grupos de células que
forman cúmulos (Figura 16-A, B); esto nos hizo pensar que estas células podrían ser
capaces de formar tumores, por lo que procedimos a cultivarlas en un medio semisólido
que asegurara la formación del tumor in vitro. La multiplicación en este medio es lenta y
se pueden observar diferentes fases en la formación de las clonas o colonias tumorales.
Entre las 24 y 48 h de incubación algunas células comenzaron a multiplicarse (Figura
16-C), a las 96 h se observaron clonas formadas por 10-20 células, mezcladas con
células aisladas (Figura 16 D); a las 192 h (8 días) cada colonia tumoral está formada
por más de 100 células y se observan al microscopio como racimos de uvas (Figura 16-
E); a los 15 días las clonas pudieron observarse a simple vista o con un microscopio
estereoscópico a bajo aumento (Figura 16-F).
Para facilitar su manipulación las clonas fueron separadas de las células que no
formaron colonias tumorales y se incubaron con medio líquido (MEM con 5% de SFB),
las clonas volvieron a sedimentarse y a proliferar formando una monocapa (Figura 17).

Figura 16. Clonas formadoras de


colonias tumorales, en A es el
crecimiento normal de las células
SiHa en monocapa; B es una
amplificación de A donde puede
verse una colonia tumoral. C-F es el
A B cultivo de dichas células en medio
semisólido (mezcla 1:1 de CMC-MEM
2X); después de 24 h de incubación,
A pueden observarse células que han
C empezado a dividirse, mientras otras
no lo hacen (C); en D, a las 96 h de
crecimiento hay colonias celulares
bien formadas; E muestra las
C D colonias tumorales después de 192 h
(8 días) de incubación y en F pueden
verse las colonias a los 15 días de
B D crecimiento. (A-E 200X; F 2X).

E F

47
A B

C
D D
C

Figura 17. A los 15 días de cultivo las colonias tumorales fueron


aisladas desde el medio semisólido (A) y transferidas a placas con
medio MEM, donde sedimentaron adhiriéndose a la superficie (B),
posteriormente las células se tripsinizaron y se mantuvieron en
cultivos adherentes (C), pueden observarse diferencias en el tamaño
y forma de las células entre las monocapas procedentes de colonias
tumorales y las del cultivo mixto (D). (200X).

7. 4 Efecto sobre la proliferación celular


7.4.1 Extractos acuosos. En contra de lo esperado 4 de los extractos acuosos
aumentaron la proliferación de células SiHa (C. pulverulentus, Sechium sp., V.
persicifolia, y V.patens); y sólo Tabernaemontana sp. disminuyó la proliferación,
evaluada mediante determinación de la actividad mitocondrial con MTT (p < 0.05) a las
72 h de tratamiento (Figura 18-A). Al determinar el número de células con azul tripano
(p < 0.05) (Figura18-B) los patrones de actividad fueron similares a los obtenidos con
MTT, pero los valores mostraron diferencias (fueron o más altos o más bajos), esto
posiblemente es debido a que las células que se toman como muertas con la tinción
con azul tripano si presentan actividad mitocondrial con el MTT.

48
A
180

160

140
% viabilidad celular

120

100
80

60

40
20

0 0.1 1 10 100 B

B Concentración (µg/ml)

180
160
% Número de células

140
120
100

80
60
40
20
0
0 0.1 1 10 100 B

Concentración (µg/ml)

Figura 18. Viabilidad celular determinada con MTT (A) y número de células
cuantificado con azul tripano (B) después del tratamiento por 72 h con los extractos
acuosos de: C. pulverulentus ( ), Sechium sp. ( ), Tabernaemontana sp.
( ), V. persicifolia ( ), V. patens ( ) y Bleomicina 100 µg/ml ( ).

49
El extracto acuoso de C. pulverulentus fue el de menor actividad, pues sólo incrementó
la proliferación celular en un 11% a la dosis máxima (Figura 18-A); las células tratadas
con este extracto no mostraron alteraciones morfológicas (Figura 20-B).
El extracto acuoso de Sechium sp mostró diferente actividad dependiendo de la
concentración probada, de tal manera que las dosis comprendidas entre 0.1 y 10 µg/ml
estimularon el crecimiento celular, alcanzando un 43 % de aumento con 10 µg/ml; no
obstante a 100 µg/ml disminuyó la proliferación en un 11% (Figura 18-A), las células no
presentaron cambios apreciables al microscopio (Figura 20-C). Cuando se empleó azul
de tripano para observar el efecto, la dosis de 10 µg/ml incrementa la proliferación en
10%, pero al aumentar a 100 µg/ml esta decae en 25% (Figura 18-B).
El extracto acuoso de Tabernaemontana sp. fué el único que mostró un efecto
inhibitorio constante en todas las dosis evaluadas, aunque el porcentaje de inhibición
fue bajo (16%) a la dosis máxima (100 µg/ml) (Figura18-D). Las células tratadas con
este extracto se hacen redondas y se desprenden de la superficie del pozo (Figura 20-
D), el IC50 calculado para este extracto fue de 337.9 µg/ml. Cabe destacar que con el
azul tripano, la actividad reportada se incrementa hasta un 50% de inhibición con la
concentración de 100 µg/ml.
El extracto acuoso de V. persicifolia. incrementó en el 30% con respecto al testigo la
reproducción celular a la dosis de 100 µg/ml (Figura 18-A), la morfología celular
aparece sin modificaciones (Figura 20-F).
El extracto acuoso de V. patens indujo la máxima actividad proliferativa, incrementando
48% la proliferación celular a la dosis de 10 µg/ml (Figura 18-A); las células aparecen al
microscopio sin alteración alguna (Figura 20-G).

7.4.2 Extractos hidroalcohólicos


Los extractos hidroalcohólicos sí presentaron actividad antiproliferativa significativa (p <
0.05) incluso a menores concentraciones respecto a la bleomicina, dicha actividad fue
entre los 10 y 100 µg/ml (Figura 19). El efecto de los extractos fue evaluado únicamente
con MTT, las dosis de IC50 para cada extracto se enumeran en la tabla 13; el daño
celular puede observarse en la Figura 21-B a G.

50
A B
120 120

% viabilidad celular
100 100
% viabilidad celular

80 80

60 60

40 40

20 20

0 0
0 0.1 1 10 100 B 0 6.25 12.5 25 50 75 100 B

Concentración (µg/ml) Concentración (µg/ml)

Figura 19. Viabilidad celular después de 72 h de exposición a los extractos


hidroalcohólicos: C. pulverulentus ( ), Sechium sp. ( ), Tabernaemontana sp.
( ), V. persicifolia ( ), V. patens ( ) y Bleomicina a 100 µg/ml
( ). A, muestra dosis logarítmicas de 0 – 100 mg/ml, el rango de dosis que mostró la
actividad fue después evaluado a dosis intermedias, lo que puede observarse en B.

C. pulverulentus. En el primer grupo de ensayos el extracto hidroalcohólico mostró


actividad antiproliferativa entre las dosis de 10 y 100 µg/ml (Figura 19-A), en el segundo
grupo presentó esta misma actividad disminuyendo la viabilidad celular en un 52.1 % a
la dosis de 100 µg/ml (Figura 19-B), el IC50 calculado fue de 90.2 µg/ml (tabla 13), las
células tratadas con las dosis menores de este extracto no mostraron diferencias
significativas (p<0.05) con respecto al control; sin embargo cuando la dosis se aumentó
a 75 µg/ml y 100 µg/ml, la morfología celular cambió, presentándose células
redondeadas y otras con la membrana citoplasmática rota, por lo que el contenido
celular fue liberado al medio de cultivo (Figura 21-B).
Sechium sp. La mayor actividad de los extractos hidroalcohólicos probados fue la de
esta planta, ya que desde la dosis de 12.5 µg/ml presentó una apreciable reducción de
la proliferación, hasta llegar a una reducción del 90 % cuando se empleó la dosis de
100 µg/ml (Figura 20-B); la IC50 calculada desde la regresión lineal es de 16.5 µg/ml
(tabla 13). Se puede observar la presencia de cuerpos esféricos oscuros, delimitados
por membrana y asociados en grupos (Figura 21-C).

51
Tabernaemontana sp. Alcanzó un máximo de inhibición de 88.3 % a 100 µg/ml (Figura
19 B), la gráfica de dosis-respuesta reveló un IC50 de 54.8 µg/ml (tabla 13). Las células
tratadas muestran cambios en la morfología normal, la mayoría de ellas se encuentran
fragmentadas en pequeños sacos rodeados de membrana celular (Figura 21-D).
V. persicifolia. Mostró actividad desde la dosis de 12.5 µg/ml, y fue el más efectivo de
todas las plantas a la dosis de 100 µg/ml, disminuyendo la viabilidad celular hasta el 91
% (Figura 19-B), las células se mostraron redondeadas y desprendidas del fondo del
pozo (Figura 21-E, F). El cálculo del IC50 reveló la dosis de 27.7 µg/ml (tabla 13).
V. patens. Redujo el crecimiento celular hasta un 84. 2 % cuando se aplicó a 100
µg/ml, sin embargo una actividad inhibitoria importante la comenzó a tener a partir de
los 25 µg/ml (Figura 19-B); algunas células se observaron desprendidas de la
monocapa, mientras que otras se hallaron con la membrana celular rota (figura 21-G).
El IC50 para este extracto fue de 69.1 % (tabla 13).

Tabla 13. Concentraciones de IC50 determinadas para los extractos


hidroalcohólicos.

Planta % de Inhibición a dosis de IC50 (µg/ml)


100 µg/ml
C. pulverulentus 52.1 90.2
Sechium sp. 89.9 16.5
Tabernaemontana sp. 88.3 54.8
V. persicifolia 91 27.7
V. patens 84.2 69.1

52
A B C D

E F G H
Figura 20. Células SiHa tratadas con los extractos acuosos de C. pulverulentus (B); V.
persicifolia (F) y V. patens (G) no muestran cambios aparentes en la morfología celular;
mientras que los cultivos tratados con Sechium sp. (C) y Tabernaemontana sp (D y E, 10 y
100 µg/ml respectivamente) muestran una menor densidad y desprendimiento celular. En A
y H se muestran los testigos negativo (sin extracto) y positivo (bleomicina 100 µg/ml)
(200X).

A
A B C D

E F G H

Figura 21. Actividad citotóxica de los extractos hidroalcohólicos en células SiHa. A y H


muestran los testigos negativo (sin extracto) y positivo (bleomicina 100 µg/ml). Los cultivos
tratados con los extractos de C. pulverulentus (B); Sechium sp. (C); Tabernaemontana sp.
(D); V. persicifolia (E y F, 75 y 100 mg/ml) y V. patens (G) muestran una notable reducción
en la densidad debido a la muerte celular (200X).

53
7.4.3 Efecto de los extractos acuosos en la formación de colonias tumorales
En base a los resultados obtenidos en la proliferación celular, aquellas plantas cuyos
extractos mostraron una actividad más marcada y definida, fueron seleccionadas para
evaluar el efecto de sus extractos acuosos en el desarrollo de colonias tumorales,
siendo estas Tabernaemontana sp. y V. patens, la primera porque actúa inhibiendo la
proliferación celular y la segunda porque la promueve. El comportamiento de los
extractos sobre las colonias tumorales, fue semejante al que desarrollaron sobre las
células en monocapa, en este caso se hicieron dos tipos de observaciones una
cualitativa, donde las colonias se fueron observando cada 24 h para ver el patrón de
proliferación y estado de las células, al finalizar las 96 h de incubación se hizo además
la cuantificación del número de células presentes en los focos en cada pozo a través
del ensayo MTT.

Tabernaemontana sp. A las dosis menores que se probaron, el extracto de esta planta,
parece no tener un efecto, de hecho la dosis de 1 µg/ml presenta un incremento en el
desarrollo celular del 27 %, las colonias incrementan su tamaño; sin embargo a la dosis
de 100 µg/ml, se halla una reducción de la proliferación de 13.6 % (Figura 22), a las 24
h de haber sido aplicado el extracto, existe multiplicación celular, pero conforme el
tiempo de exposición aumenta se observa que las células que forman a las colonias
mueren presentando una morfología en forma de sacos vacíos, puede observarse
también que a esta concentración prácticamente todas las células que conforman al
foco son dañadas por el extracto, también es importante destacar que el extracto actúa
de afuera hacia dentro del foco, afectando inicialmente a las células de la periferia para
posteriormente matar a las centrales. Algunas células son afectadas por el extracto
durante las primeras 48 h de exposición y presentan una coloración diferente a las que
no se afectan (Figura 23-C), estas pueden seguirse reproduciendo, sin embargo al
finalizar el tiempo del experimento se observan muertas (Figura 23-D).

54
250

% viabilidad celular
200

150

100

50

0
0 0.1 1 10 100 B
µg/ml

Figura 22. Viabilidad celular observada en las


colonias tumorales al ser expuestas por 96 h a los
extractos acuosos de: Tabernaemontana sp.
( ), V. patens ( ) y Bleomicina
( ). MTT.

V. patens. El efecto del extracto acuoso de esta planta en la proliferación de las clonas
tumorales, si bien sigue un patrón semejante al hallado en las células en monocapa se
incrementa, ya que el número de células es 111 % mayor al del testigo; de la dosis 0.1 -
1 µg/ml, el efecto no parece tan importante, sin embargo después de los 10 µg/ml la
actividad se incrementa considerablemente (Figura 22). Al igual que en la monocapa,
no se observan diferencias morfológicas en las células, sin embargo si puede verse que
la reproducción de las clonas a partir de las 48 h (Figura 23-E) es mayor y que las
colonias alcanzan un mayor tamaño (Figura 23-F).

55
Figura 23. Efecto de los
extractos acuosos de
Tabernaemontana sp. (C y D) y
V. patens (E y F) a diferentes
tiempos de exposición (48 y 96
h, respectivamente) en el
desarrollo de las colonias
A B tumorales. En A observamos al
testigo negativo y en B el efecto
de la bleomicina, ambos a las
96 h. Puede observarse en C
poco desarrollo de las colonias
además de células que se ven
dañadas por el extracto; en D
muchas células han muerto
C D tanto individualmente como en
colonia. En E se observa una
mayor proliferación con respecto
a C, mientras que en F, las
colonias se han desarrollado a
tal grado que es difícil
diferenciarlas. La concentración
evaluada fue de 100 µg/ml.
E F (200X).

56
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En este estudio se evaluó la actividad sobre células SiHa de extractos acuosos e


hidroalcohólicos de las cinco plantas seleccionadas.

8.1 Extractos acuosos


Cuatro de los extractos acuosos actuaron como inductores de la reproducción celular,
siendo el de V. patens el de mayor actividad, puesto que incrementó la proliferación de
las células en un 48 %. El agua es un solvente polar que extrae principalmente
antocianinas, polisacáridos, taninos, saponinas, terpenoides, polipéptidos y lecitinas
(Cowan, 1999), de estos compuestos, los terpenoides son sustancias que pueden
actuar como: inhibidores del crecimiento de otras plantas, insecticidas, atractores de
insectos polinizadores y hormonas (como ejemplo el ácido abscícico, ácido giberílico,
entre otros.), (Brielmann, 1999) debido a que muchos terpenoides actúan como
hormonas vegetales, puede pensarse que también actúen en las células como factores
de crecimiento, razón por la cual estos extractos acuosos pudieron promover la
reproducción celular, en otras investigaciones se ha observado este mismo tipo de
patrón para extractos acuosos (Whelan y col., 2003; Itharat y col., 2004).
El único extracto acuoso que presentó actividad antiproliferativa, fue el de
Tabernaemontana sp., esta planta esta clasificada dentro de la familia Apocynaceae,
extractos acuosos de algunos miembros de esta familia y género han sido evaluados en
líneas celulares de diferentes tipos de cáncer. El extracto acuoso de Tabernaemontana
sp., utilizado en el presente estudio, tuvo una IC50 de 337.9 µg/ml (0.337 mg/ml), lo que
mostraría una mayor actividad con respecto al extracto obtenido de T. catharinensis,
cuya IC50 para una de sus fracciones fue de 2.5 mg/ml (Almeida y col., 1999), pero
mucho menor que el reportado para la fracción no polar del extracto acuoso de N.
oleander, cuya IC50 fue de 1.6 µg/ml (Newman y col., 2001); esta diferencia puede
deberse al proceso de extracción, ya que para N. oleander la extracción fue realizada
en caliente y en nuestro estudio a temperatura ambiente, además cabe mencionar que
esta extracción fue la final de una serie de extracciones con otros solventes en orden
ascendente de polaridad (éter de petróleo, acetato de etilo, etanol y finalmente agua) lo

57
que pudo ocasionar pérdida o disminución en la concentración de algunos principios;
por otra parte las líneas celulares empleadas pueden presentar diferentes
susceptibilidades al tipo de compuestos contenidos en los extractos, además
dependiendo de los parámetros medidos por el método de evaluación empleado
pueden originar variaciones en el cálculo de la actividad.
Un caso especial en nuestro trabajo, lo representa el extracto acuoso de Sechium sp.,
ya que los resultados obtenidos difieren según el método de evaluación; por MTT
observamos que a la concentración de 10 µg/ml la reproducción celular aumenta en 43
%, mientras que cuando se incrementa a 100 µg/ml el efecto es contrario, es decir,
reduce la proliferación celular en 11 %; cuando el efecto es evaluado con la tinción de
azul tripano, a 10 µg/ml la reproducción celular se incrementa en 13 % y a 100 µg/ml se
reduce en 34.2 %. Estas mismas variaciones con ambas metodologías se presentan
para Tabernaemontana sp, ya que con MTT se observa una reducción celular del 16 %
a 100 µg/ml, mientras que con azul tripano se empieza a observar afectación de las
células desde la concentración de 1 µg/ml y cuando se emplean 100 µg/ml la inhibición
de la proliferación es del 50 %. Estas diferencias pueden deberse a que cuando las
células son conducidas a apoptosis, las mitocondrias siguen activas (Alfaro y col., 2000;
Pacher, 2000); sin embargo, estas células al ser contadas al microscopio ya no se
toman como vivas.
8.2 Colonias tumorales
En las colonias tumorales, el extracto de V. patens a la concentración de 100 µg/ml tuvo
un mayor efecto en la proliferación celular (111 %) en comparación a lo observado en
las células en monocapa (48 %), tomando en cuenta que la colonias crecen en
suspensión, la superficie de contacto que estas tienen con el medio (extracto) es mayor
y por lo tanto podría tenerse una mayor estimulación.
Para el extracto de Tabernaemontana sp. se obtuvieron resultados semejantes tanto
para las clonas tumorales como para las monocapas, siendo la inhibición de la
proliferación celular de 13.6 % y 16 % respectivamente a la dosis de 100 µg/ml. Dadas
las características de resistencia observadas en las clonas a lo largo de los
experimentos, podría pensarse que estas células no se ven tan afectadas por una
mayor difusión del extracto hacia su interior y por lo tanto no se potencia su efecto.

58
8.3 Extractos hidroalcohólicos
El etanol puede extraer taninos, polifenoles, poliacetilenos, flavonoles, terpenoides,
esteroles, alcaloides y própolis (Cowan, 1999); y entre estos compuestos, muchas
lactonas sesquiterpénicas, saponinas triterpénicas, taninos, polifenoles y alcaloides,
han demostrado que inhiben la reproducción celular (Brielman, 1999; Scarpato y col.,
1998; Marles y col., 1995; Ikeda y col., 2003). En nuestro estudio, todos los extractos
hidroalcohólicos inhibieron la proliferación celular, los más efectivos fueron los de
Sechium sp. (Cucurbitaceae), V. persicifolia (Compositae) y Tabernaemontana sp.
(Apocynaceae) y es muy probable que su actividad se deba a la presencia de los
compuestos anteriormente mencionados.
El extracto hidroalcohólico de Sechium sp. (Cucurbitaceae) mostró la mejor actividad
antiproliferativa de todos, siendo su IC50 de 16.5 µg/ml; otros miembros de la familia ya
han sido valorados y los compuestos activos aislados son triterpenos tetracíclicos
(cucurbitacinas) en Cucurbita andreana (Jayaprakasam y col., 2003), y proteínas
inhibidoras de ribosomas en S. edule, Momordica charantia, y Luffa cylindrica (Wu y
col., 1998; Ibrahim y col., 1999; Poma y col., 1999), no podemos comparar en cuanto a
efectividad de extractos, puesto que estos ya son compuestos puros; sin embargo cabe
destacar que las cucurbitacinas fueron extraídas con una mezcla de metanol-
diclorometano (1:1, v/v) de los frutos de C. andreana, lo que daría un valor de polaridad
cercano a nuestros extractos hidroalcohólicos; a diferencia, las proteínas inhibidoras de
ribosomas se extrajeron con agua de las semillas, razón por la cual no podríamos
pensar que fueran igualmente responsables de nuestros resultados. Los modelos
experimentales también difieren del nuestro.
Para C. pulverulentus de la familia Costaceae (orden Zingiberal) se obtuvo un IC50 de
90.2 µg/ml, en nuestro estudio esta planta fue la que presentó la dosis de IC50 mayor;
el NCI establece que en los ensayos in vitro las dosis de IC50 a seleccionar sean
menores o iguales a los 100 µg/ml (Pezzuto, 1995), razón por la cual C. pulverulentus
sería la planta de menor actividad. En el orden Zingiberal se han reportado
curcuminoides, pironas gingeroles, y compuestos fenólicos que poseen actividades
antifúngicas, antioxidantes, insecticidas, bactericidas, inmunoestimulantes,

59
antiinflamatoria y de diferenciación celular (Martínez, 1979; Cifuentes, y col., 1990; Flora
Medicinal de México, 1994; Habsah, y col., 2000; Luk y col., 2002), además en C.
spicatus se han aislado de los rizomas saponinas esteroidales y de las hojas flavonoles
glicosidados (Pereyra da Silva y col., 2002) que por orden y género podrían estar
presentes también en nuestros extractos siendo responsables de la actividad citotóxica;
sin embargo, no existen otros reportes acerca de la actividad antitumoral de plantas
pertenecientes a este orden o género.
Con respecto a V. persicifolia y V. patens que pertenecen a la familia Compositae se
tuvieron IC50 de 27.7 µg/ml y 69.1 µg/ml, respectivamente; esta familia se considera
dentro de las principales en la medicina tradicional a nivel mundial (Whelan y col.,
2003), algunas de sus actividades terapéuticas son atribuidas a la presencia de
flavonoides, sesquiterpenos, triterpenos, saponinas y sinafil alcoholes (Marculescu y
col., 2001; Marukami y col., 2001; Yoshikawa y col., 2001; Ukiya y col., 2001; Halike y
col., 2002; Ukiya y col., 2002; Zhao y col., 2002; Barrett, 2003). El género Verbesina, ha
sido investigado por la actividad antiinflamatoria, hipotensiva y antimolusquicida
(Lobitz y col., 1998; Mendes y col., 1999; Botta y col., 2003); pero no es posible la
comparación de nuestros resultados, ya que no se encuentran reportes de actividad
citotóxica de este género en la bibliografía. En comparación con otros estudios
realizados con miembros de esta familia (y género en el caso de V. patens) V.
persicifolia y V. patens tuvieron IC50 mayores. Los extractos alcohólicos de Mikania
hirsutissima presentaron IC50 de 25 µg/ml en células de leucemia L 1210, (Ohkoshi y
col., 1999); los extractos acuosos y orgánicos de Baccharis coridifolia, B. ochracea,
Eupatorium macrocephalum, E. pedunculosum y Stenachaenium riedelli presentaron
IC50 menores a 5 µg/ml sobre las líneas celulares HT29, NCI-H460 y U373 de
glioblastoma humano, (Monks y col., 2002). Goun y colaboradores en el 2002
reportaron que las extracciones con cloruro de metileno de 11 plantas asteraceas
presentaron IC50 menores a 10 µg/ml en la línea celular L 1210. El extracto metanólico
de Vernonia anthelmintica impidió la proliferación de keratinocitos a dosis de IC50 de
21.6 µg/ml (Pires y col., 2002), mientras que el extracto hidroalcohólico inhibió la
proliferación de las líneas celulares MCF7 y MDA-MB-231 (cáncer de mama) a dosis
menores de 2.5 µg/ml (Lambertini y col., 2004).

60
La familia Apocynaceae es fuente importante de indol alcaloides, alcaloides
quinolínicos, triterpenos y esteroides (Beek y col., 1984; Cardoso y col., 1998; Lien y
col., 1998; Kam y col., 2001; Whelan y col., 2003). En este estudio se observó que
Tabernaemontana sp. (Apocynaceae) tuvo un IC50 de 54.8 µg/ml, su actividad fue
semejante a la reportada para el extracto metanólico de T. divaricata que suprimió la
proliferación de células mesangiales a un IC50 de 50 µg/ml (Kuo y col., 1999). Así
mismo es similar al extracto alcohólico de Willughbeia cochinchinensis, (inhibición del
52 % a 50 µg/ml) en la línea celular COR-L23 (pulmón); sin embargo fue mayor cuando
dicho extracto fue probado en las células LS-174T (adenocarcioma de mama) y MCF-7
(adenocarcinoma de colon), donde W. cochinchinensis tuvo el 7 % y 26 % de inhibición
respectivamente a la dosis de 50 µg/ml (Itharat y col., 2004), lo que nos demuestra la
resistencia que las diferentes líneas celulares pueden tener hacia cierto tipo específico
de principios activos y por consiguiente de extractos.
Finalmente, podemos decir que las diferencias observadas entre nuestros resultados y
los reportados por la bibliografía pueden deberse a la presencia de diversos factores,
entre ellos, la familia y género de las plantas, el método de extracción, el origen del
extracto y el tipo de línea celular en el que se probó (Cordel y col., 1991; McChesney,
1993; Pezzuto, 1995).

61
9. CONCLUSIONES

1. Pudo observarse que las infusiones de Sechium sp (espinoso) y V. persicifolia


(huichin) recomendadas por la cooperativa para el tratamiento del cáncer no frenaron la
reproducción celular al ser probadas en estos modelos; sino al contrario incrementaron
la proliferación de las células.

2. Sólo el extracto acuoso de Tabernaemonta sp. mostró actividad antitumoral, con un


IC50 de 337.9 µg/ml.

3. Todos los extractos hidroalcohólicos inhibieron la proliferación celular de las células


SiHa.

4. Los extractos hidroalcohólicos de Sechium sp, V. persicifolia y Tabernaemontana sp.


tuvieron una mejor actividad, ya que sus dosis de IC50 fueron las menores (16.5 µg/ml,
27.7 µg/ml y 54.8 µg/ml respectivamente).

62
10. TRABAJO A FUTURO

1. Evaluación del efecto de los extractos hidroalcohólicos en el desarrollo de las


colonias tumorales de células SiHa.
2. Obtención de especimenes con flor de Tabernaemontana sp. y Sechium sp. que nos
permitan su clasificación taxonómica hasta especie.
3. Evaluación de la toxicidad de los extractos en la proliferación de líneas celulares de
origen no tumoral.
4. Determinación de los niveles de replicación viral y de expresión de los oncogenes
virales E6/E7 en líneas celulares de cáncer cervicouterino.
5. Evaluación de la actividad de los extractos crudos in vivo, tanto sobre el desarrollo de
tumores trasplantados como en el funcionamiento normal de los organismos.
6. Empleo de otras metodologías que permitan determinar el mecanismo a través del
cual los extractos actúen, como lo sería la medición de apoptósis, efecto citolítico y
síntesis de proteínas.
7. Realización del fraccionamiento dirigido de aquellos extractos que reporten mejor
actividad antitumoral, tentativamente los extractos hidroalcohólicos de Sechium sp., V.
persicifolia y Tabernaemontana sp., para determinar el o los principios activos
responsables de dicha actividad.
8. Determinación de la influencia de los extractos y sus fracciones en la expresión
celular de antígenos tumorales.
9. Evaluación del efecto de los extractos y sus fracciones en las propiedades tumorales
de adherencia, invasión y metástasis.

63
11. BIBLIOGRAFÍA

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72
ANEXOS

I. ENCUESTA

1. Fecha:_____________________

2. No. de muestra: ______________

3. Nombre de la
Comunidad:_____________________________________________________

4. Nombre común de la planta:________________________________________

5. Descripción física:
Rastrera ( ) Hierba ( ) Arbusto ( )
Árbol ( )

c/ semilla ( ) s / semilla ( ) c /camote( )

Otros:______________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________

6. Uso médico tradicional:____________________________________________

7. Descripción de usos:______________________________________________

8. Modo de preparación:______________________________________________

9.Otros:________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________

73
II. LISTADO DE PLANTAS MEDICINALES RECOMENDADAS POR LOS MIEMBROS
DE LA COOPERATIVA TOSEPAN - TITATANISQUE, CUETZALAN DEL
PROGRESO, PUEBLA.

Planta Cantidad ¿Cómo se reproduce? ¿Para qué sirve?


1. Ajenjo abundante mata bilis (té)
2. Ajo abundante / poco semilla tos, bronquitis
3. Ala de murciélago poco camote, guía riñones (té)
4. Albahacar abundante vara mal aire, cólico menstrual
5. Árnica poco semilla lavar heridas, desinflamar, artritis y
cicatrizar
6. Asoñate por rollo vara mal de aire y limpias
7. Astzomiate abundante rama ojeadas
8. Balletilla abundante Vara / semilla lavar heridas, dolor de estómago
(tomada), cicatrización, hemorraqgias,
para la gastritis (agua de uso con
Huichin)
9. Berbena abundante semilla bilis
10. Bugambilia abundante vara tos (te)
11. Cabello de elote abundante semilla dolor de riñón
12. Cacaloxochit poco tallo dolor de riñón, colitis
13. Calahuala abundante camote riñones y mal de orín
14. Caña de venado mucho raíz riñones y mal de orín
15. Caña morada semilla riñones y mal de orín (tomado)
16. Cebolla abundante semilla hemorragia de menstruación (hervida
con sal), tos, dolor de oído
17. Cohuopaxihuit abundante raíz y semilla desparasitante para lombrices
18. Cuetexiquit abundante raíz y semilla calambres, bilis
19. Chanclan abundante rama recaídas
20. Chilillo por rollo vara sarna
21. Durazno semilla curar heridas y baños
22. Encino pedacitos de corteza semilla enjuagues bucales
23. Epazote abundante semilla y vara desparasitante, control de plagas,
sazonar comidas
24. Espinosilla abundante vara fiebre, gripa, tos, recaídas

74
Continuación

25. Espinoso abundante cáncer (té con sábila, huichin y árnica)


Planta Cantidad ¿Cómo se reproduce? ¿Para qué sirve?
26. Estafiate abundante rama dolor de estómago, susto
27. Hierbabuena abundante vara y raíz desparasitante, dolor de estómago,
cólicos, partos, sazonar comida, tos,
gripa, diarrea (con canela), lechada
28. Hierba de cáncer abundante rama heridas
29. Hierba dulce abundante vara hemorragia, cólico menstrual
30. Hoja de aguacate abundante semilla mal de aire (hojas), inflamación,
paperas (huesos molidos)
31. Hoja de café abundante semilla calmar nervios, presión
32. Hoja de guayabo abundante semilla diarrea
33. Hoja de limón abundante semilla calmar nervios
34.Hoja de maracuyá abundante semilla calmar nervios
35. Hoja de naranja abundante semilla calmar nervios
36. Hoja santa abundante vara infección y empacho (se unta manteca y
bicrbonato y se pone sobre el
estómago), para granos (hervida)
37. Huele de noche abundante semilla susto y baño general
38. Huichin poco / abundante vara curar heridas, infecciones (té),
desinflamar, fiebre, riñones, cáncer
39. Ixote poco tallo diabetes (té con raíz), gotita para mal de
oído
40. Jarilla abundante rama bilis
41. Jengibre poco camote descongestionar vías respiratorias (té),
dolor de reumas (untado en
aguardiente)
42. Laurel semilla congestiones
43. Lengua de siervo poco guía riñones, mal de orín
44. Limón abundante semilla para las heridas
45. Malba poco semilla desinflamar
46. Maltantzin abundante / poco vara / raíz susto (untado y en té), pelotillas
morado, blanco, (tomado)
chino
47. Manzanilla poco / abundante semilla dolor de estómago (té), vista,
desinflamar, tos (con hierbabuena),
lavativa (con bicarbonato para niños),

75
Continuación

susto
Planta Cantidad ¿Cómo se reproduce? ¿Para qué sirve?
48. Mejorana poco vara cólicos, resfriado del estómago
49. Menta por ramito plantita diarrea y cólicos
50. Mirto abundante rama dolor de oído y cabeza, bilis, baño para
parturientas
51. Mozote, Mozote abundante semilla susto
morado
52. Muite poco / abundante tallo / rama alferecía
53. Nopal nopal diabetes
54. Ocma abundante semilla disentería
55. Omequelite abundante vara, raíz y semilla quemadas, después del parto, tos,
resfriado, baños, detener hemorragia
nasal (tallado), vapores vaginales
56. Orégano abundante vara / semilla bronquitis (té), mal de ojo (con sauco,
aguardiente y chipotle untado))
57. Pagua poco semilla paperas (se muele el hueso y se echa
en aguardiente)
58. Peonia poca camote alferecía en té con rosa blanca
59. Pimienta abundante semilla bronquitis
60. Pimienta abundante semilla bronquitis
61. Plátano gineo poco camote alforre de los niños
62. Poleón
63. Raíz de milpa semilla curar la abrecia
morada
64. Ravita
65. Romero por ramita vara para somar
66. Rosa de Castilla abundante tallo fiebre (té), purga, dolor de cabeza,
limpiar la vista y derrame en los ojos
(gotitas de pétalos)
67. Ruda abundante rama bilis, detención, tos, aire, cólicos
68. Sábila poca camote desinflamar, erisipela, cicatrización,
principios de cáncer, diabetes (con
nopal), caída de pelo
69. Sacapala poca guías susto (baños)
70. Santa Elena poco semilla piquete de víbora (se come la semilla)

76
Continuación
71. Sauco abundante rama ojead, mal de aire
Planta Cantidad ¿Cómo se reproduce? ¿Para qué sirve?
72. Sempualxochit poco semilla bilis
73. Suape abundante rama cólicos
74. Tabardillo abundante rama heridas
75. Tacechinolxihuit abundante semilla / raíz sarampión, viruela
76. Talamat poco / abundante raíz bronquitis, baños (exprimido crudo),
disentería (te)
77. Talocma abundante rama ataques
78. Tepocihyac abundante raíz / semilla disentería (raíz en te)
79. Te cedrón poco rama diarrea
80. Tiricia poco tallo susto
81. Tzopelitcxihuil poco raíz dolor de estómago
82. Violeta abundante rama estreñimiento
83. Xalcuahuit abundante semilla infección intestinal
84.Xalxocot tzinaca abundante semilla disentería
85. Xomet abundante tallo mal aire
86. Yoloxochit poco semilla dolor de corazón
87. Zacapale abundante susto
88. Zanahoria semilla la vista
89. Zapote blanco poco semilla presión (te)
90. Zapote negro por rollo semilla sarna

77
III. FORMULACIONES

Medio MEM
1 Frasco de medio MEM (para 1 lt)
2.22 g de NaHCO3
3.3 g de Buffer HEPES
100 µg/ml de Streptomicina
100 U/ml de Penicilina
pH = 7

Buffer de fosfatos (PBS)


0.2 g de KH2PO4
8.0 g de NaCl
2.16 g de Na2HPO4:7H2O
1 lt deH2O bidestilada
pH = 7.2

Buffer Dulbecco para Tripsina


0.2 g de KCl
0.2 g de KH2PO4
8.0 g de NaCl
2.16 g de Na2HPO4·7H2O ó 1.1 g de anhidro
1 lt de H2O
pH= 7.2

Tripsina – EDTA 0.25%


La tripsina y el EDTA se pesan (dependiendo del volumen a preparar, tomando en
cuenta la concentración) y se disuelven en el buffer Dulbecco para tripsina, se ajusta el
pH de la solución a 7.2 y se deja clarificar toda la noche a 4 ºC, posteriormente se filtra
en membrana de 0.22 µm y distribuye en alícuotas, conservándose en refrigeración.

78

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