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CO-DIRECTOR DE TESIS:
DR. JULIO ROBERTO REYES LEYVA
(CIBIOR-IMSS, METEPEC)
ASESORES DE TESIS:
DR. ARTURO NAVARRO OCAÑA
(UNAM)
DR. FRANCISCO RUÍZ TERÁN
(UNAM)
DR. EDUARDO SAN MARTÍN MARTÍNEZ
(CICATA-LEGARIA, IPN)
M. en C. CLAUDIA MONTALVO PAQUINI
(CIBA-TLAXCALA, IPN)
3
AGRADECIMIENTOS
A Dios por ser la razón de mi existencia, por ser la constante de mi vida y por ser todo en
todo, gracias…..mi amado Señor.
A la Dra. Martha D. Bibbins Martínez y al Dr. Julio R. Reyes Leyva por la confianza, el
afecto, el apoyo y el conocimiento brindados a lo largo de todo este tiempo.
A mis revisores de tesis: Dr. Arturo Navarro Ocaña, Dr. Francisco Ruíz Terán, Dr.
Eduardo San Martín Martínez y M. en C. Claudia Montalvo Paquini; por haber dedicado
su tiempo y atención a la presente tesis y hacerme de manera amable y comprensiva las
correcciones pertinentes.
Al biólogo José Luís Contreras, responsable del Herbario de la BUAP, por su amable
colaboración en la clasificación taxonómica de los especimenes.
A mis maestros y compañeros del CIBA y CIBIOR, por lo mucho que he aprendido de
ellos, por la ayuda y convivencia que hicieron este trabajo más fácil y llevadero.
A mis padres, por el amor que me expresan día a día a través de su apoyo, comprensión,
cariño, confianza, respeto y todo lo demás para lo que no tengo palabras. Los amo.
4
A mi familia (hermanos, cuñadas, sobrinos), porque gracias a su amor, compañía y
ayuda, llenan mi vida de alegría y movimiento, por hacerme feliz cada momento, mil
gracias. Los amo.
A mis amigos, de aquí, de allá, de hace mucho o recientes (cuyos nombres no escribo
por no creerlo necesario) por el tiempo en el que compartimos ideas, consejos, alegrías y
tristezas y porque a pesar de la distancia y las ocupaciones continúan a mi lado, los
quiero mucho.
Se que estas palabras son muy cortas para expresar la importancia que cada ser,
persona y acontecimiento han tenido y seguirán teniendo en mi vida y en mi crecimiento
tanto personal como profesional, así que a todos y por todo, simplemente: GRACIAS.
5
RESUMEN
6
ABSTRACT
In this work five plants used for the traditional medicine of Cuetzalan, Puebla, were
selected, aqueous and hydroalcoholic extracts were produced and their capacity to
inhibiting the proliferation of SiHa cells derived of cervical cancer was evaluated. The
five evaluated plants were: Costus pulverulentus, Sechium sp, Tabernaemontana sp,
Verbesina persicifolia and Vernonia patens. The assays were performed with two types
of SiHa cells cultures: a) SiHa cells monolayer was cultured with liquid medium and b)
SiHa cells tumoral clones were cultivated on semisolid medium. Addition of the C.
pulverulentus, Sechium sp, V. persicifolia and V. patens aqueous extracts increased
proliferation of SiHa cell monolayers; V. patens. induced the highest activity (48% at 10
µg/ml) in comparison with other extracts. Tabernaemontana sp aqueous extract inhibited
16% cell proliferation at the maximal concentration (100 µg/ml). In contrast, the
hydroalcoholic extracts of the same plants inhibited cellular multiplication. Sechium sp
and V. persicifolia extracts showed the biggest activity at their smallest concentrations
(IC50 value of 16.5 and 27.7 µg/ml, respectively). V. patens and Tabernaemontana sp
aqueous extracts were used on tumoral clones of SiHa cells cultured on semisolid
medium, results were similar to that obtained with monolayer cultures; (111 and 13.6%,
respectively).
7
GLOSARIO
8
Metástasis. Migración o diseminación de las células cancerosas desde su origen
primario a otros tejidos donde crecen como tumores secundarios.
Microtúbulos. Estructuras celulares formadas por la proteína tubulina, importantes en el
citoesqueleto y en la división celular.
Mutación. Cambio estable en la estructura del DNA de un gen.
Neoplasia. Tejido nuevo, proceso que cursa con la proliferación excesiva o anormal de
células.
Neutropenia. Disminución en la cuenta normal de neutrófilos circulantes, se dice que en
valores menores a los 1500 neutrófilos/mm3
Oncogén. Gen cuyo aumento en la expresión puede provocar la transformación tumoral.
Quimiotaxonomía. Relación existente entre las plantas pertenecientes a un mismo
grupo taxonómico con respecto a su producción de metabolitos secundarios.
Virus oncogénico. Virus cuya infección puede inducir la transformación maligna de las
células, pueden ser virus DNA o virus RNA.
Té, infusión o tisana. Se preparan vertiendo agua caliente sobre hojas, flores, tallos y
raíces, donde la planta no debe ser hervida debido a la pérdida o alteración de esencias
y principios activos.
Cocimientos. Consiste en cocer hirviendo la combinación de las diferentes partes
vegetales, donde se pueden incluir semillas, raíces y cortezas. Se recomienda para
extraer el máximo de los componentes no volátiles.
Pomadas y ungüentos. Formas de aplicación externa, donde la parte activa vegetal se
encuentra incluida en un vehículo o excipiente generalmente graso.
Cataplasmas. En este tipo de preparación, la planta puede colocarse fresca
directamente sobre la zona afectada, o bien en polvo con algún vehículo como harina o
salvado.
Tinturas. La planta triturada se mantiene en alcohol de caña, vino o solución
hidroalcohólica durante diez o quince días, bien tapada, protegida de la luz.
Baños. La preparación de los baños se realiza a partir del cocimiento de una o varias
plantas, aplicándose en las zonas afectadas.
9
ÍNDICE
Página
1. Marco Teórico 14
1.1 Investigación Etnobotánica en plantas medicinales. 14
1.1.1 La Etnobotánica y su importancia. 14
1.1.2 Formas de preparación de las plantas medicinales. 15
1.2 Metodología para la investigación de actividades antitumorales. 16
1.3 Cáncer. 19
1.3.1 Mecanismos celulares involucrados en el desarrollo del cáncer. 19
1.3.2 Factores genéticos y ambientales que pueden originar el cáncer. 20
1.3.3 Incidencia del cáncer en el mundo y en México. 21
1.3.4 Cáncer cervicouterino. 23
1.3.5 Tratamiento del cáncer cervicouterino. 23
1.4 Características de las plantas seleccionadas para este estudio. 24
1.4.1 Caña de venado. 24
1.4.2 Cojón de gato. 25
1.4.3 Espinoso. 27
1.4.4 Huichin y Ocma. 28
3. Justificación. 32
4. Objetivos. 33
4.1 Objetivo general. 33
4.2 Objetivos específicos. 33
5. Hipótesis. 33
6. Material y métodos. 34
6.1 Selección del material a evaluar. 34
6.2 Recolección y manejo de ejemplares. 34
6.3 Obtención de los extractos. 35
6.4 Determinación de las condiciones óptimas de experimentación. 35
6.4.1 Cuantificación celular con azul tripano. 36
6.4.2 Curva de crecimiento celular. 36
6.4.3 Ensayo para la evaluación de viabilidad celular. 36
6.4.3.1 Curva de concentración celular contra densidad óptica. 36
6.4.3.2 Curvas dosis-respuesta para sulfato de bleomicina y etanol. 37
6.4.4 Cultivo celular en medio semisólido para la formación de colonias
tumorales. 37
6.5 Pruebas para determinar la actividad biológica de los extractos. 39
6.5.1 Ensayos para la evaluación de la actividad antiproliferativa. 39
6.5.2 Ensayo para evaluar la actividad de los extractos en la formación de
colonias tumorales. 40
6.6 Análisis estadístico. 41
6.7 Cálculo de los Índices de citotoxicidad al 50% (IC50). 41
7. Resultados. 42
7.1 Selección del material a evaluar. 42
7.2 Extractos obtenidos. 44
7.3 Condiciones óptimas de experimentación en cultivos celulares. 44
7.3.1 Curva de crecimiento de células SiHa. 44
7.3.2 Determinación de la viabilidad celular con MTT y curva de concentración
celular contra densidad óptica. 45
10
Página
7.3.3 Curva dosis-respuesta para sulfato de bleomicina . 45
7.3.4 Curva dosis-respuesta para etanol. 46
7.3.5 Formación de clonas tumorales en un medio semisólido. 47
7.4 Efecto sobre la proliferación celular. 48
7.4.1 Extractos acuosos. 48
7.4.2 Extractos hidroalcohólicos. 50
7.4.3 Efecto de los extractos acuosos en la formación de colonias tumorales. 54
8. Discusión de resultados. 57
8.1 Extractos acuosos. 57
8.2 Colonias tumorales. 58
8.3 Extractos hidroalcohólicos. 58
9. Conclusiones. 62
11. Bibliografía. 64
Anexos. 74
I. Encuesta. 74
II.Plantas medicinales recomendadas por la Cooperativa Tosepan-Titatanisque. 75
III. Formulaciones. 78
11
RELACIÓN DE FIGURAS Y TABLAS
Figuras:
1. Interrelación entre los diversos proyectos de investigación en el descubrimiento de nuevos agentes
contra el cáncer
2. Proceso de carcinogénesis
3. Incidencia del cáncer en hombres y mujeres mexicanos
4. Procedimiento para la selección de colonias tumorales
5. Aislamiento de colonias tumorales
6. Ensayo para la evaluación de la actividad antiproliferativa de los extractos
7. Ensayo para evaluar la actividad de los extractos en el desarrollo de las colonias tumorales
8. Caña de venado (Costus pulverulentus)
9. Espinoso (Sechium sp.)
10. Cojón de gato (Tabernaemontana sp.)
11. Huichin (Verbesina persicifolia)
12. Ocma (Vernonia patens)
13. Curva de crecimiento en células SiHa
14. Curva dosis-respuesta para sulfato de bleomicina
15. Curva dosis-respuesta para etanol
16. Clonas formadoras de colonias tumorales
17. Monocapas de clonas formadoras de colonias tumorales
18. Actividad de los extractos acuosos en la proliferación de las células SiHa (MTT y azul tripano)
19. Actividad de los extractos hidroalcohólicos en la proliferación de las células SiHa
20. Morfología de las células tratadas con los extractos acuosos
21. Morfología de las células tratadas con los extractos hidroalcohólicos
22. Actividad de los extractos acuosos de Tabernaemontana sp. y V. patens en el desarrollo de las
colonias tumorales de células SiHa
23. Morfología de las colonias tumorales tratadas con los extractos acuosos de Tabernaemontana sp. y
V. patens.
12
Tablas:
1. Principios activos extraídos con un solo solvente
2. Eventos bioquímicos responsables de la actividad anticancerígena
3. Mortalidad en México con referencia al cáncer
4. Distribución de los principales tipos de cáncer
5. Actividades farmacológicas de plantas pertenecientes al orden Zingiberal
6. Actividades farmacológicas de la familia Apocynaceae
7. Actividades farmacológicas de la familia Cucurbitaceae
8. Actividades farmacológicas de la familia Compositae
9. Actividad biológica reportada para el género Verbesina
10. Actividades biológicas identificadas para el género Vernonia
11. Concentraciones de sólidos presentes en los extractos obtenidos
12. Viabilidad de células SiHa, después de la administración de sulfato de bleomicina
13. Concentraciones de IC50 de los extractos hidroalcohólicos en la proliferación de células SiHa
13
1. Marco Teórico
14
1.1.2 Formas de preparación de las plantas medicinales
Prácticamente todas las partes de la planta pueden emplearse para curar: la raíz, el
tallo, la corteza, las hojas, las flores, el fruto, la resina o goma y la leche o látex; estos
productos vegetales se emplean en forma de cocimiento, té o tisana, polvos,
ungüentos, emplastos, gotas, sahumerios; mascados, comidos y bebidos en forma de
tinturas. Se reconoce de entre todos éstos a las tisanas, cocimientos, pomadas,
ungüentos, cataplasmas, tinturas y baños como los de uso más corriente (Cifuentes y
col., 1990; Valdez, 1998; Saldierna y col., 2001). Es importante la forma y tipo de
solventes empleados para la preparación de los extractos, así como el tipo de
extracción que de ellas se realiza, ya que de esto dependen los posibles principios
activos que se extraerán y como consecuencia las actividades que de ellos se deriven,
la tabla 1 nos muestra el tipo de compuestos químicos que se obtienen cuando el
material vegetal se extrae con un sólo solvente.
15
1.2 Metodología para la investigación de actividades antitumorales
En la actualidad, cerca de 120 agentes terapéuticos de estructura conocida aislados de
90 especies son utilizados para propósitos comerciales, estos son empleados para el
tratamiento de infecciones (microbianas, parasitarias, virales), desórdenes cardíacos,
hormonales, y para el cáncer; el 74 % de estos 120 agentes han sido descubiertos a
través de investigaciones basadas en listados etnomédicos (Cordell y col., 1991;
McChesney, 1993; Beutler y col., 1995; Cowan, 1999). La selección de las plantas
puede llevarse a cabo por: una investigación al azar dentro del reino vegetal, donde las
especies disponibles son investigadas a pesar de no tenerse conocimientos previos
acerca de ellas; tomarse en cuenta la taxonomía (quimiotaxonomía), donde las plantas
pertenecientes a algún género o familia de interés por los compuestos químicos que
producen son evaluadas; basándose en el conocimiento etnomédico, es decir, a través
del uso medicinal que se les da y en obediencia a bases de datos como NAPRALERT,
USDA EBL Database, DIALOG, etc. (Farnsworth y col., 1983; Cordell y col., 1991;
McChesney 1993).
Para la investigación de principios activos extraídos de plantas con aplicación
terapéutica ante el cáncer se recomienda seguir una serie de estrategias dentro de un
programa de investigación bien establecido, dicha investigación requiere de un esfuerzo
multidisciplinario de expertos en diferentes campos (McChesney 1993). El Instituto
Nacional del Cáncer en Estados Unidos (NCI) resume estas estrategias en 5 proyectos:
Proyecto 1. Adquisición de la muestra; para lo cual se requiere de una fuente natural
confiable, análisis de bases de datos, la recolección, clasificación taxonómica y
literatura especializada. La elección de la especie a evaluar puede basarse en las
metodologías anteriormente mencionadas. Es muy importante verificar de manera
preferente la autenticidad del material que va a ser evaluado, evitando así alguna
confusión debida al uso de nombres comunes en las diferentes comunidades, para lo
que se requiere de una carta de identificación botánica.
Proyecto 2. El material vegetal recolectado tras un proceso de secado, se somete a la
extracción con diferentes solventes, obteniéndose un extracto crudo (completo).
16
Proyecto 3. Evaluación in vitro de los extractos crudos empleando ensayos a corto
plazo, estos resultados deben correlacionarse con los del proyecto 5. La confirmación
de la actividad biológica a través de réplicas es extremadamente importante antes de
invertir en el fraccionamiento y purificación de sustancias sin actividad.
Proyecto 4. Pruebas de inhibición de la carcinogénesis de los extractos crudos, sus
fracciones y compuestos purificados en cultivos de órganos o modelos animales.
Proyecto 5. Síntesis y modificación de los principios activos aislados después de los
proyectos anteriores, una vez que haya sido elucidada su estructura química,
preparando una serie de compuestos derivados y observando la relación entre
estructura y actividad (McChesney, 1993; Pezzuto, 1995). También debe evaluarse la
toxicidad de los compuestos, su aplicación en tratamientos clínicos, su comercialización
y estudios agronómicos si es que se desea establecer el cultivo del vegetal. La figura 1
nos muestra la interrelación existente entre cada uno de los cinco proyectos
anteriormente expuestos.
Proyecto 1
Selección,adquisición,
e información acerca
de la planta
Proyecto 2 Proyecto 5
Extracción y Síntesis
aislamiento
Proyecto 3
Bioensayos
in vitro
Proyecto 4
Cultivo de órganos y
bioensayos in vivo
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actividad puede deberse a una inhibición de la progresión del ciclo celular, a un efecto
hormonal o antihormonal, según el tipo de cáncer de que se trate. La tabla 2 muestra
los principales eventos bioquímicos involucrados en las actividades antitumorales.
18
Existen diferentes modelos para evaluar la actividad antitumoral de productos naturales,
encontramos los cultivos celulares, en los que las células se hacen crecer en presencia
de los extractos o de los principios activos a corto o largo plazo, al final del cual puede
medirse la actividad de los mismos determinando el índice de citotoxicidad 50 (IC50), lo
que puede realizarse de diferentes maneras: cuenta con hemocitómetro de células
viables teñidas con algún colorante vital, medición de apoptosis celular por evaluación
de la integridad del ADN mediante southern blot o tinción nuclear con fluorocromos,
evaluación de la expresión de algunos metabolitos importantes, expresión de proteínas
a través de electroforesis o bien actividad enzimática (Badu y col., 1995; Price y col.,
1997; Kurokawa y col., 1999; Kuo y col., 1999; Quintero y col., 1999; Alfaro y col.,
2000). También pueden probarse los extractos en modelos animales (generalmente
ratas) implantadas con algún tumor sólido o no para posteriormente serles
administrados los extractos completos o bien fracciones de los mismos y con el paso
del tiempo medir el volumen y peso del tumor implantado, así como algún otro
parámetro que permita corroborar el estado fisiológico de los animales (Badu y col.,
1995; Palani y col., 1999). El NCI recomienda que la investigación realizada, inicie con
la experimentación in vitro, para lo cual se requieren pocas cantidades de material
vegetal y sobre todo, permite hacer observaciones preliminares para continuar con el
fraccionamiento y su aplicación en los modelos animales cuyo costo es mayor.
1.3 Cáncer
19
interrumpir su crecimiento y diferenciarse en el tipo celular que les corresponde de
acuerdo a su herencia genética. Cuando las células pierden su capacidad de respuesta
adecuada continúan dividiéndose sin limitaciones originando así las neoplasias
(Maldonado y col., 1996). Las células tumorales, aumentan su proliferación,
incrementan su tendencia a invadir formándose metástasis (Figura 2), tienden a
optimizar los procesos anabólicos implicados en la proliferación tales como la síntesis
de DNA y RNA, economizando las funciones catabólicas (catabolismo de pirimidinas);
también pueden sintetizar proteínas fetales consideradas como marcadores tumorales
como el antígeno carcinoembrionario (DiSaia y col., 1999; Lodish y col., 1999). De
manera natural, las células que han sufrido un daño en su material genético son
susceptibles de corrección, de lo contrario sufren una muerte celular programada mejor
conocida como apoptosis, donde a diferencia de la necrosis no hay liberación del
contenido citoplasmático y por consiguiente no genera inflamación, el DNA es
degradado al igual que algunas proteínas y se producen cuerpos apoptóticos (Torriglia
y col., 1999; Pacher, 2000).
20
ejemplos de virus oncogénicos son: virus del papiloma humano (HPV), virus de Epstein-
Barr, Hepadnavirus y virus de la leucemia de linfocitos T humanos, entre otros (DiSaia y
col., 1999; Howley y col., 2000).
21
En México, el cáncer es también la segunda causa de muerte después de las
enfermedades cardiovasculares. El número de decesos por este padecimiento se ha
incrementado en las últimas décadas (tabla 3), tan sólo en el 2002 ocurrieron 58,360
decesos, es decir, un promedio de 159 muertes diarias por cáncer (Abdulllaev y col.,
2004); el cáncer es más frecuente en mujeres que en hombres (Figura 3) y el primer
lugar lo ocupa el cáncer cervicouterino (tabla 4). La OMS reporta que México ocupa el
primer lugar en mortalidad por cáncer cervicouterino (en mujeres mayores de 25 años),
por lo que se considera actualmente como un problema de salud pública y se necesitan
métodos de detección oportuna y tratamientos más eficaces (Martínez y col., 2004).
Próstata 5%
Como su nombre lo indica este tipo de cáncer se desarrolla en el cérvix o cuello del
útero de las mujeres, se asocia fuertemente con la presencia del virus del papiloma
humano, principalmente los tipos 16 y 18, aunque existen otros tipos oncogénicos
menos frecuentes, y existen también aquellos que sólo promueven el crecimiento de
neoplasias no malignas; además de la presencia viral, el CaCu, presenta otros factores
de riesgo como son el tabaquismo, la edad temprana en las relaciones sexuales, un
número alto de parejas sexuales y desnutrición, principalmente (Eifel y col., 2000;
Moura y col., 2002). El papilomavirus es un virus de ADN capaz de integrar su genoma
en el genoma de la célula infectada, al integrarse se inactiva la región de los genes
E1/E2, que mantienen bajo control la expresión de dos oncogenes virales E6 y E7. El
producto proteico de E6 se une al producto proteico del gen celular p53 promoviendo de
esta manera su degradación, p53 es un supresor de tumores, es responsable de
detener el ciclo celular para la reparación de ADN dañado y de llevar a la célula a
apoptosis. La proteína de E7 se une e inactiva a diferentes proteínas celulares,
incluyendo pRB (gen de susceptibilidad a retinoblastoma), esto detiene el ciclo celular
en la fase S de síntesis de ADN, lo que induce proliferación excesiva de las células que
han integrado al ADN viral (DiSaia y col., 1999; Howley y col., 2000; Bernard, 2004).
23
cuatro se emplean en la terapeútica clínica: adriamicina (antraciclina microbiana),
bleomicina (glicopéptido microbiano), mitomicina C (alcaloide pirrolizado microbiano) y
la vincristina (alcaloide de origen vegetal), (Moura y col, 2002). No existe ninguna
publicación que avale la terapéutica de este cáncer mediante formulaciones o
recomendaciones de medicina tradicional.
24
tratamiento de problemas en la vejiga y uretra, así como para expulsar piedras renales,
además se han identificado saponinas esteroidales que causan hemólisis ligera y
flavonas glicosidadas obtenidas de las hojas que han inhibido la producción de óxido
nítrico por macrófagos, en base a esto. En extractos acuosos de los tallos se
identificaron tres fracciones de polisacáridos neutros de glucosa, que poseen actividad
antiinflamatoria e inmunomoduladora ya que estimulan la fagocitosis y modifican la
permeabilidad capilar en el inicio de la inflamación (Pereyra da Silva y col., 2003).
25
congestivo cardíaco, pero que de forma tradicional se emplea para los epiteliomas, el
herpes, psoriasis, entre otras; la fracción no polar fue probada para identificar su
actividad citotóxica sobre la línea celular BRO de melanoma humano, siendo su IC50 de
1.6 µg/ml, tal parece que los responsables de dicha actividad fueron los glicósidos
cardíacos oleandrín y oleandrigenín (Newman y col., 2001); Willughbeia
cochinchinensis, empleada en la medicina tradicional thaiwanesa cuyos extractos
acuoso y alcohólico se probaron en células de cáncer de pulmón (COR-L23),
adenocarcinoma de colon (LS-174T), adenocarcinoma de mama (MCF-7 y
keratinocitos (SVK-14), siendo más activo el extracto alcohólico sobre la línea COR-L23
con un 48 % de sobrevivencia (Itharat y col., 2004). Con respecto a plantas del mismo
género han sido investigadas T. catharinenesis y T. divaricata; de la primera se
comprobó la actividad de tres fracciones del extracto acuoso en cáncer de mama (SK-
BR-3), su mayor actividad fue del 66.3 % de citotoxicidad; análisis químicos de las
fracciones indican que su naturaleza es de alcaloides indol terpénicos (Almeida y col.,
1999); el extracto metanólico de T. divaricata suprimió la proliferación de células
mesangiales activadas con dos interleucinas (IL-1B y IL-6), siendo su IC50 de 50 µg/ml
(Kuo y col., 1999).
26
1.4.3 Espinoso (Sechium edule (Jacq.) Swartz). Perteneciente a la familia
Cucurbitaceae y conocida también como chayote, es una planta comestible subtropical,
trepadora, pubescente, de hojas cordadas, de raíz acuosa (camote) de color café claro.
El tronco de la guía es semileñoso y posee flores pequeñas amarillentas y dispersas;
fruto ovoide con espinas. Se emplea en la medicina popular para bajar la presión
sanguínea, como diurético y para las piedras del riñón al combinarse con matasano
(Mártínez, 1979; Cifuentes y col., 1990; Flora Medicinal de México, 1994; Diré y col.,
2003). Algunos miembros de esta misma familia (tabla 7) han demostrado poseer
actividad antitumoral, tal es el caso de Cucurbita andreana, de la que después de ser
extraída con agua y metanol se obtuvieron cuatro triterpenos tetracíclicos altamente
oxigenados llamados cucurbitacinas, que redujeron la proliferación de líneas de cáncer
de colon (HCT-116), mama (MCF-7), pulmón (NCI-H460) y sistema nervioso central
(SF-268) a dosis de 0.4 µM, siendo la cucurbitacina B la de mayor actividad (desde un
96% - 87% de inhibición) (Jayaprakasam y col., 2003).
La formulación herbolaria de Muthu Marunthu ha sido empleada para el tratamiento del
cáncer, está compuesta de ocho diferentes plantas, de las cuales Collarocarpus
epigaeus Hk.f (Cucurbitaceae) representa el 5 %; el extracto acuoso de esta fórmula se
administró oralmente a ratas trasplantadas con células tumorales y se midió el tamaño y
peso del tumor con respecto al tiempo, observándose una disminución en el desarrollo
tumoral de casi 50 % en las ratas tratadas (Palani y col., 1999). Específicamente
hablando de S. edule, existen dos reportes acerca de su actividad biológica, en uno se
extrae el fruto con solución salina y se le administra oralmente a ratas que han
consumido también marcadores radiactivos detectables en plasma, así se demostró que
el chayote es capaz de alterar el marcaje radiactivo ya que genera metabolitos
radiactivos con propiedades oxidantes (Feliciano y col., 2003); en el otro, se obtienen
extractos alcohólicos de esta planta y se prueba su actividad antimicrobiana contra
Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus coagulasa negativa,
Streptococcus pyogenes y Streptococcus agalactie (gram positivos) por ensayo de
difusión en disco, encontrándose las mayores actividades para los extractos alcohol-
agua al 90 % (semillas) y al 80 % (hojas), las dosis mínimas inhibitorias son de 8.32-
16.64 µg/ml y 4.16 - 8.32 µg/ml respectivamente (Ordoñez y col., 2003).
27
Tabla 7. Propiedades farmacológicas de la familia Cucurbitaceae
Actividad Especie Referencia
Antitumoral C. andreana Jayaprakasam y col., 2003
C. epigaeus Palani y col., 1999
Antimicrobiana S. edule Ordoñez y col., 2003
Oxidante S. edule Diré y col., 2003
28
aéreas de Mikania hirsutissima generó 11 compuestos que mostraron actividad
citotóxica en células de leucemia (L 1210) a una dosis de 25 µg/ml (Ohkoshi y col.,
1999). En Rusia, se evaluaron 45 plantas por su actividad antiproliferativa en la misma
línea celular (L 1210), como resultado los extractos de cloruro de metileno de once
plantas asteraceas fueron activos entre el 80 - 100 % a una dosis de 10 µg/ml, la
naturaleza química de los extractos fue principalmente de taninos, terpenos, flavonas,
saponinas y glucósidos (Goun y col., 2002).
Un estudio similar en Brazil demostró la actividad citotóxica de los extractos acuosos y
orgánicos de Baccharis coridifolia, B. ochracea, Eupatorium macrocephalum, E.
pedunculosum y Stenachaenium riedelli sobre tres líneas celulares de glioblastoma
humano ( HT29, NCI-H460 y U373) a dosis menores de 5 µg/ml (Monks y col., 2002);
de las flores de Chrysanthemum morifolium y Ligularia nelumbifolia, se han aislado
triterpenos dioles y sinafil alcoholes activos sobre cáncer de colon, de pulmón,
melanoma, sistema nervioso central, ovario, riñón, nasofaringe y leucemia (Ukiya y col.,
2002; Zhao y col., 2002).
29
El género Verbesina (tabla 9), ha sido investigado por la actividad antiinflamatoria e
hipotensiva (V. turbacensis y V. caracasana, respectivamente) de extractos
metanólicos, de estos se ha podido aislar cinamatos y derivados de guanidina (Lobitz y
col., 1998; Botta y col., 2003).
30
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La OMS reporta que México ocupa el primer lugar en muertes por cáncer
cervicouterino, por lo que se considera a este como un problema de salud pública. Los
esquemas terapéuticos empleados para el tratamiento de este problema de salud son
caros y la mayoría ocasionan en las pacientes severos efectos colaterales que
menguan la calidad de vida de las mismas; aunado a esto se ha observado que muchos
pacientes pueden presentar resistencia a los quimioterápicos, por lo que se requiere de
la investigación de nuevos principios activos que puedan ser útiles en tales casos.
31
3. JUSTIFICACIÓN
32
4. OBJETIVOS
4. 2 Objetivos específicos
1.- Seleccionar con base en los conocimientos tradicionales y bibliográficos plantas con
potencial actividad antitumoral.
2.- Producir extractos etanólicos y acuosos de C. pulverulentus, Sechium sp.,
Tabernaemonatna sp., Verbesina persicifolia y Vernonia sp.
3.- Evaluar el efecto de los extractos acuosos sobre la proliferación y viabilidad de
monocapas de células SiHa.
4.- Evaluar el efecto de los extractos hidroalcohólicos en la proliferación y viabilidad de
monocapas de células SiHa
5.- Evaluar el efecto de los extractos acuosos en la formación y proliferación de colonias
tumorales de células SiHa.
5. HIPÓTESIS
33
6. MATERIAL Y METODOS
34
Para realizar la clasificación taxonómica, los ejemplares fueron depositados en el
herbario de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla (BUAP).
35
observaciones morfológicas se realizaron con un microscopio invertido de contraste de
fase y con un microscopio estereoscópico.
36
neonato bovino (SNB) y 10 µl de la solución de MTT en placas para cultivo celular de 96
pozos; muestras similares se incubaron a diferentes tiempos (1 h y 1.5 h) para
determinar el tiempo en el que había una adecuada formación de cristales de formazan.
Al finalizar el tiempo de incubación los cristales de formazán se disolvieron con 90 µl de
una solución de Tritón X-100 al 10% e isopropanol anhidro ácido (HCl al 0.1 N); la
lectura de la reacción se realizó en un espectrofotómetro para microplacas a una
longitud de onda de 570 nm para la lectura y de 630 nm como referencia (Quintero y
col, 1999). Este experimento se efectuó dos veces, cada una con cuatro réplicas.
37
2. Las células de una monocapa se resuspenden con tripsina, se lavan y se
cuentan como ya se mencionó. Se toma el volumen necesario para obtener
concentraciones finales de 10000, 50000 y 100000 células/2 ml. Las células se
diluyen en 1 ml del medio MEM 2X preparado previamente.
3. Las células en MEM 2x se mezclan con un volumen igual de CMC precalentada y
se colocan sobre la base de agar en las placas de 6 pozos. Las placas se
incuban en atmósfera húmeda con 5% de CO2 a 37ºC.
4. Las colonias se forman en la interfase entre el agar y la CMC
5. Se adicionó medio fresco cada tercer día
Las células se incubaron durante dos semanas hasta observar la formación de colonias
tumorales. Las colonias que podían observarse a simple vista se retiraron con la ayuda
de una micropipeta y se depositaron en otra placa bajo tres condiciones diferentes de
cultivo: mezcla 1:1 de MEM-CMC, mezcla 1:2 de MEM-CMC y MEM solo (Figura 5).
38
Suspensión celular
Focos tumorales
39
10,000 células SiHa
Cultivo por 24 h
MEM 5 % SFB, 37 ºC, 5
Placa de 96
% CO2
pozos
Evaluación de la actividad
metabólica por el ensayo
colorimétrico MTT y conteo de
células teñidas con azul de Cambio de medio: MEM con
tripán extracto por 72 h, 5 % SFB, 37
ºC, 5 % CO2
Figura 6. Esquematización de la prueba para evaluar la actividad de los extractos sobre
la proliferación celular, las dosis probadas fueron: 0, 0.1, 1, 10, y 100 µg/ml, en el caso
de los extractos hidroalcohólicos, se probaron también las dosis de 0, 6.25, 12.5, 25, 50,
75 y 100 µg/ml.
40
Agarosa al 2 % CMC al 2.72% + DMEM 2X con
10 % SFB y
extracto
4ºC
Figura 7. Ensayo realizado para probar el efecto de los extractos acuosos en el desarrollo
de las colonias tumorales, la concentración empleada fue de 10 000 clonas tumorales/ ml
de medio semisólido.
41
7. RESULTADOS
42
Sólo fue posible realizar la clasificación taxonómica hasta especie de Caña de venado
(Costus pulverulentus) con número de registro 12211 (Figura 8), Huichin (Verbesina
persicifolia) con número de registro 12130 (Figura 11) y Ocma (Vernonia patens) con
número de registro 12129 (Figura 12). Cojón de gato (Tabernaemonata sp.; Figura 10)
y Espinoso (Sechium sp.; Figura 9) sólo pudieron ser clasificadas hasta género debido
a que no se contó con ejemplares con flor.
Figura 10. Cojón de gato (Tabernaemontana Figura 11. Huichin (V. persicifolia),
sp.), empleada tradicionalmente para la empleada para la diabetes, élceras y
mordedura de capulín, los granos, y las llagas riñones
200000
Número de células
150000
100000
50000
0
0 24 48 72 96 120
Tiempo (hr)
44
7.3.2 Determinación de la viabilidad celular con MTT y curva de concentración
celular contra densidad óptica. Las condiciones óptimas para la realización de estos
ensayos son la incubación de las células con MTT disuelto en PBS con 5% de SNB
durante una hora a 37ºC, tiempo en el cual existe la suficiente actividad mitocondrial
como para dar una señal detectable en el espectrofotómetro. También se determinó
que las mejores lecturas para el ensayo de MTT se obtienen a longitudes de onda de
550 nm utilizando el filtro de 620 nm como referencia. Los volúmenes de reactivos
empleados fueron: 90 µl de PBS con 5% de SNB, el 10% de este volumen de MTT
diluido en PBS, al finalizar el tiempo de incubación, los cristales de formazán se
disolvieron con 100 µl de isopropanol ácido. La curva de concentración celular contra
absorbancia mostró que un inóculo inicial de 5,000 células es suficiente para dar una
señal detectable en el espectrofotómetro; también se encontró que las concentraciones
celulares mayores (125,000 y 250,000 células) no mostraron un patrón de saturación de
color. Esto permitió realizar los ensayos en un rango de concentración celular amplio.
120
% Viabilidad celular
100
80
60
40
20
0
0 0.1 1 10 100
Conc. (µg/ml)
45
Tabla 12. Viabilidad de células SiHa, después
de la administración de bleomicina por 72 h.
7.3.4 Curva dosis-respuesta para etanol. Como los extractos hidroalcohólicos fueron
administrados a las células utilizando etanol como vehículo, fue necesario demostrar
que la adición de diferentes volúmenes de alcohol etílico al 70 % sin extracto no
afectaba la multiplicación celular, pudo observarse que no hay efecto significativo
(p<0.05), (Figura 15).
0.150
O.D. 550
0.100
0.050
0.000
0 0.1 1 10 100
Etanol (µl)
46
7.3.5 Formación de clonas tumorales en un medio semisólido.
Es común observar en los cultivos de células SiHa en monocapa grupos de células que
forman cúmulos (Figura 16-A, B); esto nos hizo pensar que estas células podrían ser
capaces de formar tumores, por lo que procedimos a cultivarlas en un medio semisólido
que asegurara la formación del tumor in vitro. La multiplicación en este medio es lenta y
se pueden observar diferentes fases en la formación de las clonas o colonias tumorales.
Entre las 24 y 48 h de incubación algunas células comenzaron a multiplicarse (Figura
16-C), a las 96 h se observaron clonas formadas por 10-20 células, mezcladas con
células aisladas (Figura 16 D); a las 192 h (8 días) cada colonia tumoral está formada
por más de 100 células y se observan al microscopio como racimos de uvas (Figura 16-
E); a los 15 días las clonas pudieron observarse a simple vista o con un microscopio
estereoscópico a bajo aumento (Figura 16-F).
Para facilitar su manipulación las clonas fueron separadas de las células que no
formaron colonias tumorales y se incubaron con medio líquido (MEM con 5% de SFB),
las clonas volvieron a sedimentarse y a proliferar formando una monocapa (Figura 17).
E F
47
A B
C
D D
C
48
A
180
160
140
% viabilidad celular
120
100
80
60
40
20
0 0.1 1 10 100 B
B Concentración (µg/ml)
180
160
% Número de células
140
120
100
80
60
40
20
0
0 0.1 1 10 100 B
Concentración (µg/ml)
Figura 18. Viabilidad celular determinada con MTT (A) y número de células
cuantificado con azul tripano (B) después del tratamiento por 72 h con los extractos
acuosos de: C. pulverulentus ( ), Sechium sp. ( ), Tabernaemontana sp.
( ), V. persicifolia ( ), V. patens ( ) y Bleomicina 100 µg/ml ( ).
49
El extracto acuoso de C. pulverulentus fue el de menor actividad, pues sólo incrementó
la proliferación celular en un 11% a la dosis máxima (Figura 18-A); las células tratadas
con este extracto no mostraron alteraciones morfológicas (Figura 20-B).
El extracto acuoso de Sechium sp mostró diferente actividad dependiendo de la
concentración probada, de tal manera que las dosis comprendidas entre 0.1 y 10 µg/ml
estimularon el crecimiento celular, alcanzando un 43 % de aumento con 10 µg/ml; no
obstante a 100 µg/ml disminuyó la proliferación en un 11% (Figura 18-A), las células no
presentaron cambios apreciables al microscopio (Figura 20-C). Cuando se empleó azul
de tripano para observar el efecto, la dosis de 10 µg/ml incrementa la proliferación en
10%, pero al aumentar a 100 µg/ml esta decae en 25% (Figura 18-B).
El extracto acuoso de Tabernaemontana sp. fué el único que mostró un efecto
inhibitorio constante en todas las dosis evaluadas, aunque el porcentaje de inhibición
fue bajo (16%) a la dosis máxima (100 µg/ml) (Figura18-D). Las células tratadas con
este extracto se hacen redondas y se desprenden de la superficie del pozo (Figura 20-
D), el IC50 calculado para este extracto fue de 337.9 µg/ml. Cabe destacar que con el
azul tripano, la actividad reportada se incrementa hasta un 50% de inhibición con la
concentración de 100 µg/ml.
El extracto acuoso de V. persicifolia. incrementó en el 30% con respecto al testigo la
reproducción celular a la dosis de 100 µg/ml (Figura 18-A), la morfología celular
aparece sin modificaciones (Figura 20-F).
El extracto acuoso de V. patens indujo la máxima actividad proliferativa, incrementando
48% la proliferación celular a la dosis de 10 µg/ml (Figura 18-A); las células aparecen al
microscopio sin alteración alguna (Figura 20-G).
50
A B
120 120
% viabilidad celular
100 100
% viabilidad celular
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 0.1 1 10 100 B 0 6.25 12.5 25 50 75 100 B
51
Tabernaemontana sp. Alcanzó un máximo de inhibición de 88.3 % a 100 µg/ml (Figura
19 B), la gráfica de dosis-respuesta reveló un IC50 de 54.8 µg/ml (tabla 13). Las células
tratadas muestran cambios en la morfología normal, la mayoría de ellas se encuentran
fragmentadas en pequeños sacos rodeados de membrana celular (Figura 21-D).
V. persicifolia. Mostró actividad desde la dosis de 12.5 µg/ml, y fue el más efectivo de
todas las plantas a la dosis de 100 µg/ml, disminuyendo la viabilidad celular hasta el 91
% (Figura 19-B), las células se mostraron redondeadas y desprendidas del fondo del
pozo (Figura 21-E, F). El cálculo del IC50 reveló la dosis de 27.7 µg/ml (tabla 13).
V. patens. Redujo el crecimiento celular hasta un 84. 2 % cuando se aplicó a 100
µg/ml, sin embargo una actividad inhibitoria importante la comenzó a tener a partir de
los 25 µg/ml (Figura 19-B); algunas células se observaron desprendidas de la
monocapa, mientras que otras se hallaron con la membrana celular rota (figura 21-G).
El IC50 para este extracto fue de 69.1 % (tabla 13).
52
A B C D
E F G H
Figura 20. Células SiHa tratadas con los extractos acuosos de C. pulverulentus (B); V.
persicifolia (F) y V. patens (G) no muestran cambios aparentes en la morfología celular;
mientras que los cultivos tratados con Sechium sp. (C) y Tabernaemontana sp (D y E, 10 y
100 µg/ml respectivamente) muestran una menor densidad y desprendimiento celular. En A
y H se muestran los testigos negativo (sin extracto) y positivo (bleomicina 100 µg/ml)
(200X).
A
A B C D
E F G H
53
7.4.3 Efecto de los extractos acuosos en la formación de colonias tumorales
En base a los resultados obtenidos en la proliferación celular, aquellas plantas cuyos
extractos mostraron una actividad más marcada y definida, fueron seleccionadas para
evaluar el efecto de sus extractos acuosos en el desarrollo de colonias tumorales,
siendo estas Tabernaemontana sp. y V. patens, la primera porque actúa inhibiendo la
proliferación celular y la segunda porque la promueve. El comportamiento de los
extractos sobre las colonias tumorales, fue semejante al que desarrollaron sobre las
células en monocapa, en este caso se hicieron dos tipos de observaciones una
cualitativa, donde las colonias se fueron observando cada 24 h para ver el patrón de
proliferación y estado de las células, al finalizar las 96 h de incubación se hizo además
la cuantificación del número de células presentes en los focos en cada pozo a través
del ensayo MTT.
Tabernaemontana sp. A las dosis menores que se probaron, el extracto de esta planta,
parece no tener un efecto, de hecho la dosis de 1 µg/ml presenta un incremento en el
desarrollo celular del 27 %, las colonias incrementan su tamaño; sin embargo a la dosis
de 100 µg/ml, se halla una reducción de la proliferación de 13.6 % (Figura 22), a las 24
h de haber sido aplicado el extracto, existe multiplicación celular, pero conforme el
tiempo de exposición aumenta se observa que las células que forman a las colonias
mueren presentando una morfología en forma de sacos vacíos, puede observarse
también que a esta concentración prácticamente todas las células que conforman al
foco son dañadas por el extracto, también es importante destacar que el extracto actúa
de afuera hacia dentro del foco, afectando inicialmente a las células de la periferia para
posteriormente matar a las centrales. Algunas células son afectadas por el extracto
durante las primeras 48 h de exposición y presentan una coloración diferente a las que
no se afectan (Figura 23-C), estas pueden seguirse reproduciendo, sin embargo al
finalizar el tiempo del experimento se observan muertas (Figura 23-D).
54
250
% viabilidad celular
200
150
100
50
0
0 0.1 1 10 100 B
µg/ml
V. patens. El efecto del extracto acuoso de esta planta en la proliferación de las clonas
tumorales, si bien sigue un patrón semejante al hallado en las células en monocapa se
incrementa, ya que el número de células es 111 % mayor al del testigo; de la dosis 0.1 -
1 µg/ml, el efecto no parece tan importante, sin embargo después de los 10 µg/ml la
actividad se incrementa considerablemente (Figura 22). Al igual que en la monocapa,
no se observan diferencias morfológicas en las células, sin embargo si puede verse que
la reproducción de las clonas a partir de las 48 h (Figura 23-E) es mayor y que las
colonias alcanzan un mayor tamaño (Figura 23-F).
55
Figura 23. Efecto de los
extractos acuosos de
Tabernaemontana sp. (C y D) y
V. patens (E y F) a diferentes
tiempos de exposición (48 y 96
h, respectivamente) en el
desarrollo de las colonias
A B tumorales. En A observamos al
testigo negativo y en B el efecto
de la bleomicina, ambos a las
96 h. Puede observarse en C
poco desarrollo de las colonias
además de células que se ven
dañadas por el extracto; en D
muchas células han muerto
C D tanto individualmente como en
colonia. En E se observa una
mayor proliferación con respecto
a C, mientras que en F, las
colonias se han desarrollado a
tal grado que es difícil
diferenciarlas. La concentración
evaluada fue de 100 µg/ml.
E F (200X).
56
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
57
que pudo ocasionar pérdida o disminución en la concentración de algunos principios;
por otra parte las líneas celulares empleadas pueden presentar diferentes
susceptibilidades al tipo de compuestos contenidos en los extractos, además
dependiendo de los parámetros medidos por el método de evaluación empleado
pueden originar variaciones en el cálculo de la actividad.
Un caso especial en nuestro trabajo, lo representa el extracto acuoso de Sechium sp.,
ya que los resultados obtenidos difieren según el método de evaluación; por MTT
observamos que a la concentración de 10 µg/ml la reproducción celular aumenta en 43
%, mientras que cuando se incrementa a 100 µg/ml el efecto es contrario, es decir,
reduce la proliferación celular en 11 %; cuando el efecto es evaluado con la tinción de
azul tripano, a 10 µg/ml la reproducción celular se incrementa en 13 % y a 100 µg/ml se
reduce en 34.2 %. Estas mismas variaciones con ambas metodologías se presentan
para Tabernaemontana sp, ya que con MTT se observa una reducción celular del 16 %
a 100 µg/ml, mientras que con azul tripano se empieza a observar afectación de las
células desde la concentración de 1 µg/ml y cuando se emplean 100 µg/ml la inhibición
de la proliferación es del 50 %. Estas diferencias pueden deberse a que cuando las
células son conducidas a apoptosis, las mitocondrias siguen activas (Alfaro y col., 2000;
Pacher, 2000); sin embargo, estas células al ser contadas al microscopio ya no se
toman como vivas.
8.2 Colonias tumorales
En las colonias tumorales, el extracto de V. patens a la concentración de 100 µg/ml tuvo
un mayor efecto en la proliferación celular (111 %) en comparación a lo observado en
las células en monocapa (48 %), tomando en cuenta que la colonias crecen en
suspensión, la superficie de contacto que estas tienen con el medio (extracto) es mayor
y por lo tanto podría tenerse una mayor estimulación.
Para el extracto de Tabernaemontana sp. se obtuvieron resultados semejantes tanto
para las clonas tumorales como para las monocapas, siendo la inhibición de la
proliferación celular de 13.6 % y 16 % respectivamente a la dosis de 100 µg/ml. Dadas
las características de resistencia observadas en las clonas a lo largo de los
experimentos, podría pensarse que estas células no se ven tan afectadas por una
mayor difusión del extracto hacia su interior y por lo tanto no se potencia su efecto.
58
8.3 Extractos hidroalcohólicos
El etanol puede extraer taninos, polifenoles, poliacetilenos, flavonoles, terpenoides,
esteroles, alcaloides y própolis (Cowan, 1999); y entre estos compuestos, muchas
lactonas sesquiterpénicas, saponinas triterpénicas, taninos, polifenoles y alcaloides,
han demostrado que inhiben la reproducción celular (Brielman, 1999; Scarpato y col.,
1998; Marles y col., 1995; Ikeda y col., 2003). En nuestro estudio, todos los extractos
hidroalcohólicos inhibieron la proliferación celular, los más efectivos fueron los de
Sechium sp. (Cucurbitaceae), V. persicifolia (Compositae) y Tabernaemontana sp.
(Apocynaceae) y es muy probable que su actividad se deba a la presencia de los
compuestos anteriormente mencionados.
El extracto hidroalcohólico de Sechium sp. (Cucurbitaceae) mostró la mejor actividad
antiproliferativa de todos, siendo su IC50 de 16.5 µg/ml; otros miembros de la familia ya
han sido valorados y los compuestos activos aislados son triterpenos tetracíclicos
(cucurbitacinas) en Cucurbita andreana (Jayaprakasam y col., 2003), y proteínas
inhibidoras de ribosomas en S. edule, Momordica charantia, y Luffa cylindrica (Wu y
col., 1998; Ibrahim y col., 1999; Poma y col., 1999), no podemos comparar en cuanto a
efectividad de extractos, puesto que estos ya son compuestos puros; sin embargo cabe
destacar que las cucurbitacinas fueron extraídas con una mezcla de metanol-
diclorometano (1:1, v/v) de los frutos de C. andreana, lo que daría un valor de polaridad
cercano a nuestros extractos hidroalcohólicos; a diferencia, las proteínas inhibidoras de
ribosomas se extrajeron con agua de las semillas, razón por la cual no podríamos
pensar que fueran igualmente responsables de nuestros resultados. Los modelos
experimentales también difieren del nuestro.
Para C. pulverulentus de la familia Costaceae (orden Zingiberal) se obtuvo un IC50 de
90.2 µg/ml, en nuestro estudio esta planta fue la que presentó la dosis de IC50 mayor;
el NCI establece que en los ensayos in vitro las dosis de IC50 a seleccionar sean
menores o iguales a los 100 µg/ml (Pezzuto, 1995), razón por la cual C. pulverulentus
sería la planta de menor actividad. En el orden Zingiberal se han reportado
curcuminoides, pironas gingeroles, y compuestos fenólicos que poseen actividades
antifúngicas, antioxidantes, insecticidas, bactericidas, inmunoestimulantes,
59
antiinflamatoria y de diferenciación celular (Martínez, 1979; Cifuentes, y col., 1990; Flora
Medicinal de México, 1994; Habsah, y col., 2000; Luk y col., 2002), además en C.
spicatus se han aislado de los rizomas saponinas esteroidales y de las hojas flavonoles
glicosidados (Pereyra da Silva y col., 2002) que por orden y género podrían estar
presentes también en nuestros extractos siendo responsables de la actividad citotóxica;
sin embargo, no existen otros reportes acerca de la actividad antitumoral de plantas
pertenecientes a este orden o género.
Con respecto a V. persicifolia y V. patens que pertenecen a la familia Compositae se
tuvieron IC50 de 27.7 µg/ml y 69.1 µg/ml, respectivamente; esta familia se considera
dentro de las principales en la medicina tradicional a nivel mundial (Whelan y col.,
2003), algunas de sus actividades terapéuticas son atribuidas a la presencia de
flavonoides, sesquiterpenos, triterpenos, saponinas y sinafil alcoholes (Marculescu y
col., 2001; Marukami y col., 2001; Yoshikawa y col., 2001; Ukiya y col., 2001; Halike y
col., 2002; Ukiya y col., 2002; Zhao y col., 2002; Barrett, 2003). El género Verbesina, ha
sido investigado por la actividad antiinflamatoria, hipotensiva y antimolusquicida
(Lobitz y col., 1998; Mendes y col., 1999; Botta y col., 2003); pero no es posible la
comparación de nuestros resultados, ya que no se encuentran reportes de actividad
citotóxica de este género en la bibliografía. En comparación con otros estudios
realizados con miembros de esta familia (y género en el caso de V. patens) V.
persicifolia y V. patens tuvieron IC50 mayores. Los extractos alcohólicos de Mikania
hirsutissima presentaron IC50 de 25 µg/ml en células de leucemia L 1210, (Ohkoshi y
col., 1999); los extractos acuosos y orgánicos de Baccharis coridifolia, B. ochracea,
Eupatorium macrocephalum, E. pedunculosum y Stenachaenium riedelli presentaron
IC50 menores a 5 µg/ml sobre las líneas celulares HT29, NCI-H460 y U373 de
glioblastoma humano, (Monks y col., 2002). Goun y colaboradores en el 2002
reportaron que las extracciones con cloruro de metileno de 11 plantas asteraceas
presentaron IC50 menores a 10 µg/ml en la línea celular L 1210. El extracto metanólico
de Vernonia anthelmintica impidió la proliferación de keratinocitos a dosis de IC50 de
21.6 µg/ml (Pires y col., 2002), mientras que el extracto hidroalcohólico inhibió la
proliferación de las líneas celulares MCF7 y MDA-MB-231 (cáncer de mama) a dosis
menores de 2.5 µg/ml (Lambertini y col., 2004).
60
La familia Apocynaceae es fuente importante de indol alcaloides, alcaloides
quinolínicos, triterpenos y esteroides (Beek y col., 1984; Cardoso y col., 1998; Lien y
col., 1998; Kam y col., 2001; Whelan y col., 2003). En este estudio se observó que
Tabernaemontana sp. (Apocynaceae) tuvo un IC50 de 54.8 µg/ml, su actividad fue
semejante a la reportada para el extracto metanólico de T. divaricata que suprimió la
proliferación de células mesangiales a un IC50 de 50 µg/ml (Kuo y col., 1999). Así
mismo es similar al extracto alcohólico de Willughbeia cochinchinensis, (inhibición del
52 % a 50 µg/ml) en la línea celular COR-L23 (pulmón); sin embargo fue mayor cuando
dicho extracto fue probado en las células LS-174T (adenocarcioma de mama) y MCF-7
(adenocarcinoma de colon), donde W. cochinchinensis tuvo el 7 % y 26 % de inhibición
respectivamente a la dosis de 50 µg/ml (Itharat y col., 2004), lo que nos demuestra la
resistencia que las diferentes líneas celulares pueden tener hacia cierto tipo específico
de principios activos y por consiguiente de extractos.
Finalmente, podemos decir que las diferencias observadas entre nuestros resultados y
los reportados por la bibliografía pueden deberse a la presencia de diversos factores,
entre ellos, la familia y género de las plantas, el método de extracción, el origen del
extracto y el tipo de línea celular en el que se probó (Cordel y col., 1991; McChesney,
1993; Pezzuto, 1995).
61
9. CONCLUSIONES
62
10. TRABAJO A FUTURO
63
11. BIBLIOGRAFÍA
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72
ANEXOS
I. ENCUESTA
1. Fecha:_____________________
3. Nombre de la
Comunidad:_____________________________________________________
5. Descripción física:
Rastrera ( ) Hierba ( ) Arbusto ( )
Árbol ( )
Otros:______________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________
7. Descripción de usos:______________________________________________
8. Modo de preparación:______________________________________________
9.Otros:________________________________________________________________
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
_____________________________________________________
73
II. LISTADO DE PLANTAS MEDICINALES RECOMENDADAS POR LOS MIEMBROS
DE LA COOPERATIVA TOSEPAN - TITATANISQUE, CUETZALAN DEL
PROGRESO, PUEBLA.
74
Continuación
75
Continuación
susto
Planta Cantidad ¿Cómo se reproduce? ¿Para qué sirve?
48. Mejorana poco vara cólicos, resfriado del estómago
49. Menta por ramito plantita diarrea y cólicos
50. Mirto abundante rama dolor de oído y cabeza, bilis, baño para
parturientas
51. Mozote, Mozote abundante semilla susto
morado
52. Muite poco / abundante tallo / rama alferecía
53. Nopal nopal diabetes
54. Ocma abundante semilla disentería
55. Omequelite abundante vara, raíz y semilla quemadas, después del parto, tos,
resfriado, baños, detener hemorragia
nasal (tallado), vapores vaginales
56. Orégano abundante vara / semilla bronquitis (té), mal de ojo (con sauco,
aguardiente y chipotle untado))
57. Pagua poco semilla paperas (se muele el hueso y se echa
en aguardiente)
58. Peonia poca camote alferecía en té con rosa blanca
59. Pimienta abundante semilla bronquitis
60. Pimienta abundante semilla bronquitis
61. Plátano gineo poco camote alforre de los niños
62. Poleón
63. Raíz de milpa semilla curar la abrecia
morada
64. Ravita
65. Romero por ramita vara para somar
66. Rosa de Castilla abundante tallo fiebre (té), purga, dolor de cabeza,
limpiar la vista y derrame en los ojos
(gotitas de pétalos)
67. Ruda abundante rama bilis, detención, tos, aire, cólicos
68. Sábila poca camote desinflamar, erisipela, cicatrización,
principios de cáncer, diabetes (con
nopal), caída de pelo
69. Sacapala poca guías susto (baños)
70. Santa Elena poco semilla piquete de víbora (se come la semilla)
76
Continuación
71. Sauco abundante rama ojead, mal de aire
Planta Cantidad ¿Cómo se reproduce? ¿Para qué sirve?
72. Sempualxochit poco semilla bilis
73. Suape abundante rama cólicos
74. Tabardillo abundante rama heridas
75. Tacechinolxihuit abundante semilla / raíz sarampión, viruela
76. Talamat poco / abundante raíz bronquitis, baños (exprimido crudo),
disentería (te)
77. Talocma abundante rama ataques
78. Tepocihyac abundante raíz / semilla disentería (raíz en te)
79. Te cedrón poco rama diarrea
80. Tiricia poco tallo susto
81. Tzopelitcxihuil poco raíz dolor de estómago
82. Violeta abundante rama estreñimiento
83. Xalcuahuit abundante semilla infección intestinal
84.Xalxocot tzinaca abundante semilla disentería
85. Xomet abundante tallo mal aire
86. Yoloxochit poco semilla dolor de corazón
87. Zacapale abundante susto
88. Zanahoria semilla la vista
89. Zapote blanco poco semilla presión (te)
90. Zapote negro por rollo semilla sarna
77
III. FORMULACIONES
Medio MEM
1 Frasco de medio MEM (para 1 lt)
2.22 g de NaHCO3
3.3 g de Buffer HEPES
100 µg/ml de Streptomicina
100 U/ml de Penicilina
pH = 7
78