APROBACIÓN

Los miembros del comité designado para revisar la tesis de la C. LILIANA

SOTO CASTRO, la han encontrado satisfactoria y recomiendan que sea
aceptada como requisito parcial para obtener el grado de MAESTRO EN
CIENCIAS.

__________________________________
Dra. Josefina León Félix
Director de tesis

__________________________________
Dr. Cristóbal Chaidez Quiroz
Asesor

__________________________________
Dra. Nohelia Castro del Campo
Asesor

__________________________________
Dr. Bruno Gómez Gil Rodríguez Sala
Asesor
 DECLARACIÓN INSTITUCIONAL

Se permiten y agradecen las citas breves del material contenido en esta

tesis sin permiso especial del autor, siempre y cuando se dé el crédito
correspondiente. Para la reproducción parcial o total de la tesis con fines
académicos, se deberá contar con la autorización escrita del Centro de
Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C. (CIAD).

La publicación en comunicaciones científicas o de divulgación popular de

los datos contenidos en esta tesis, deberá dar créditos al CIAD, previa
autorización escrita del director o directora del trabajo de tesis.

__________________________________

Dr. RAMÓN PACHECO AGUILAR

Director General
 “El éxito consiste en obtener lo que se desea. La felicidad, en

disfrutar lo que se obtiene”.

Ralph Waldo Emerson

 DEDICATORIA

A mis padres, Julio César y Bertila, por su interminable apoyo en mi vida,

por darme sus mejores enseñanzas, consejos y por su eterna paciencia… Los
amo.

A mi hermano, Christian, por apoyarme en todo momento y sacarme

siempre una sonrisa… Te quiero mucho.

A mi sobrina, Emilia, por ser mi pequeño resplandor y mi alegría.

 AGRADECIMIENTOS

Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD), por sus

facilidades otorgadas para continuar con mis estudios.

Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) por su apoyo

económico.

A la Dra. Josefina León Félix, por ser mi directora de tesis, por su

confianza, su tiempo, sus consejos, por brindarme sus conocimientos. Muchas
gracias.

A la Dra. Nohelia Castro del Campo y al Dr. Cristóbal Chaidez Quiroz, por
aceptar ser parte de mi Comité de Tesis, por brindarme sus aportaciones, su
invaluable tiempo y su apoyo en la realización del trabajo.

Al Dr. Bruno Gómez Gil Rodríguez Sala, por compartir sus conocimientos
y por la oportunidad de participar en este trabajo.

Al Dr. José Benigno Valdéz Torres por sus acertadas asesorías y por todo
su apoyo.

A la Dra. Ofelia Yadira Lugo Melchor, por su apoyo incondicional, por

compartir sus conocimientos y sobre todo por su valiosa amistad.

A todos mis profesores de maestría por compartir sus conocimientos:

Dra. María Dolores Muy Rangel, Dr. Raymundo Saúl García Estrada, Dr. Raúl
Allende Molar, M.C. José Armando Carrillo Fasio, Dr. Miguel Ángel Angulo
Escalante, Dr. José Basilio Heredia, Dra. Josefa Adriana Sañudo Barajas, Dr.
Tomás Osuna Enciso, Dra. Maribel Jiménez Edeza, Dr. Osvaldo López Cuevas.
M.C. Verónica Pérez Rubio, M. C. Cosme Bojorquez.
 A la Q.F.B Célida Isabel Martínez Rodríguez, la I.B.T. Martha Gabriela
Gaxiola Landeros, por el apoyo técnico otorgado.

A la M.C. Bianca Anabel Amézquita López, por su gran apoyo, por

escucharme, por aconsejarme y por su valiosa amistad.

Al M.C. José Roberto Guzmán Uriarte, por darme ánimos, por su apoyo y
su amistad.

A mis compañeros de generación, M.C. Rosalía Sarai Flores Ceballos,

M.C. Luis Alfonso Amarillas Bueno, Biol. Julio César Astorga Guzmán, I.Q.
Anabel Altamirano Aguilar, I.I.S. Ana Belinda Corrales Bañuelos, Biol. José Luis
Alcaráz Medina, por todos los buenos momentos que pasamos juntos y porque
consolidamos una gran amistad.

A la L.B. María Magdalena Vallejo, por proporcionarme gran parte de la

bibliografía que se necesito para este trabajo, así como por su apoyo.

A la L.C.P.F. Mayra Ibarra I.B. Evelia Araiza y al Sr. Víctor Arana por su
disposición y amabilidad.

Al Ing. Marco Cesar Martínez, Raúl Reyes y Jorge Manjarrez, por su

apoyo técnico y disponibilidad.

A la Q.F.B Aurora Alicia Gastelum Martínez, la M.C. Mitzi Dayanira

Estrada Acosta, la M.C. Talia Fernanda Martínez Bastidas, Q.F.B. Celina Sarahy
Viera Pérez, M.C. José Andrés Medrano Félix, M.C. Gloria Marisol Castañeda
Ruelas, M.C. Carlos Alberto Rodríguez Mascareño por amistad y su importantes
consejos.

Agradezco a América Jazmín Cota Álvarez, Areli Burgueño Román, Juan

Diego Aguilasocho Leyva por su apoyo técnico, el cual fue de gran importancia
para la realización de este trabajo.
 El presente trabajo se realizó en el
Laboratorio de Microbiología Ambiental y
de Alimentos del Centro de Investigación
en Alimentación y Desarrollo A. C., bajo la
dirección de la Dra. Josefina León Félix y
el financiamiento de los donativos de
CONACYT No. 335520 y al Fondo
Sectorial de Investigación en Salud y
Seguridad Social No. 0114024.
 ÍNDICE

ÍNDICE DE CUADROS............................................................................................xii
ÍNDICE DE FIGURAS.............................................................................................xiii
ABREVIATURAS.....................................................................................................xiv
RESUMEN.............................................................................................................xviii
ABSTRACT..............................................................................................................xx
INTRODUCCIÓN.......................................................................................................1
REVISIÓN DE LITERATURA....................................................................................4
Producción de Ostión ..........................................................................................4
Generalidades del Ostión.....................................................................................4
Clasificación y Nomenclatura..........................................................................4
Fisiología..........................................................................................................5
Especies de Ostión..........................................................................................5
Bacterias Patógenas en Ostión............................................................................6
Indicadores de Contaminación Fecal en Ostión...................................................7
Género Vibrio........................................................................................................8
Especies de Vibrio................................................................................................9
Vibrio parahaemolyticus.....................................................................................10
Caracteristícas Principales............................................................................10
Antecedentes de Brotes Infecciosos.............................................................14
Vibrio cholerae....................................................................................................16
Características Principales............................................................................16
Antecedentes de Brotes Infecciosos.............................................................20

ix
 x

Vibrio vulnificus...................................................................................................21
Características Principales............................................................................21
Antecedentes de Brotes Infecciosos.............................................................22
Detección de Patógenos por Métodos Microbiológicos y Moleculares..............23
Normativas para la Regulación de Coliformes Fecales y Vibrio spp. en
Moluscos Bivalvos................................................................................................24
PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN.......................................................................26
HIPÓTESIS..............................................................................................................28
PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN..........................................................................30
OBJETIVOS.............................................................................................................31
Objetivo General.................................................................................................31
Objetivos Específicos.........................................................................................31
MATERIALES Y MÉTODOS....................................................................................33
Estrategia Experimental......................................................................................33
Estrategia de Muestreo.......................................................................................34
Toma de Muestra................................................................................................36
Procesamiento de la Muestra.............................................................................36
Detección y Cuantificación de Coliformes Fecales............................................36
Cultivo en Placa.............................................................................................37
Conteo de Coliformes Fecales......................................................................37
Detección y Cuantificación de Vibrio por NMP-PCR..........................................38
Número Más Probable Acoplado a la Reacción en Cadena de la
Polimerasa (NMP-PCR).......................................................................................38
Lisis Celular...................................................................................................38
Identificación de Especie por PCR................................................................39
Condiciones para PCR..................................................................................39
 xi

Electroforesis.................................................................................................40
Detección de Genes de Toxicidad de V. pahaemolyticus y V. cholerae por
PCR......................................................................................................................44
Serotipificación....................................................................................................44
RESULTADOS.........................................................................................................47
Detección y Cuantificación de Coliformes Fecales............................................47
Detección y Cuantificación de Vibro parahaemolyticus por NMP-PCR.............49
Detección y Cuantificación de Vibrio cholerae por NMP-PCR...........................51
Detección y Cuantificación de Vibrio vulnificus por NMP-PCR..........................53
Identificación de Genes que Codifican para Toxinas en Vibrio spp...................56
Identificación del Serotipo O3:K6 de Vibrio parahaemolyticus..........................58
DISCUSIÓN.............................................................................................................59
CONCLUSIONES....................................................................................................65
LITERATURA CITADA.............................................................................................66
ANEXO I..................................................................................................................85
Preparación de Medios y Soluciones.................................................................85
Preparación de Medios de Cultivo.................................................................85
Preparación de Soluciones............................................................................86
Preparación de Soluciones para la Electroforesis de ADN...........................86
Contenido de los Estuches Comerciales.......................................................87
ANEXO II.................................................................................................................88
Análisis de Secuencia Nucleotídica....................................................................88
ANEXO III................................................................................................................90
Regiones de Origen de las Muestras de Ostión Analizadas..............................90
 ÍNDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Límites permisibles para la regulación de moluscos bivalvos frescos

(FDA y NOM-242-SSA1-2009).............................................................................25
Cuadro 2. Ubicación y coordenadas de los establecimientos de mariscos que
cuentan con la venta de ostión de placer en la ciudad de Culiacán, Sinaloa......35
Cuadro 3. Iniciadores para genes especie-específico de Vibrio.............................41
Cuadro 4. Preparación de mezcla madre para las reacciones de PCR para la
identificación de especie, toxinas y serotipos de Vibrio.......................................41
Cuadro 5. Condiciones de termociclador para realizar PCR..................................42
Cuadro 6. Cepas de Vibrio utilizadas como controles positivos de los
experimentos de PCR..........................................................................................42
Cuadro 7. Manual Bacteriológico Análitico (BAM). Apéndice 2. Número Más
Probable de Diluciones en Serie..........................................................................43
Cuadro 8. Iniciadores para genes de toxicidad para V. cholerae y V.
parahaemolyticus.................................................................................................45
Cuadro 9. Condiciones de PCR para detección de genes que codifican para
toxinas..................................................................................................................45
Cuadro 10. Iniciadores utilizados para identificar serotipos O3:K6 de V.
parahaemolyticus y los serogrupos O1 y O139 de V. cholerae...........................46
Cuadro 11. Condiciones de PCR para caracterización de serotipo y serogrupo....46
Cuadro 12. Concentración de coliformes fecales en ostión de placer....................49
Cuadro 13. Presencia de Vibrio parahaemolyticus en ostión de placer.................51
Cuadro 14. Concentración de Vibrio parahaemolyticus en ostión de placer..........51
Cuadro 15. Presencia de Vibrio cholerae en ostión de placer................................53
Cuadro 16. Concentración de Vibrio cholerae en ostión de placer.........................53
Cuadro 17. Presencia de Vibrio vulnificus en ostión de placer...............................55
Cuadro 18. Concentración de Vibrio vulnificus en ostión de placer........................55

xii
 ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Posibles factores que favorecen el aumento de la carga bacteriana de

ostiones (Fica, 2007...............................................................................................7
Figura 2. Comportamiento biológico de Vibrio spp, mecanismo de transmisión al
humano y al ambiente acuático..............................................................................9
Figura 3. Fenómeno de Kanagawa (Zamora et al., 2005)......................................13
Figura 4. Representación esquemática de TCP.....................................................18
Figura 5. Diagrama general de la estrategia experimental empleada en la
investigación.........................................................................................................33
Figura 6. Porcentaje de muestras positivas para coliformes fecales en el periodo
1............................................................................................................................48
Figura 7. Porcentaje de muestras posiitvas para coliformes fecales en el periodo
2............................................................................................................................48
Figura 8. Porcentaje de muestras positivas para colifoformes fecales en el
periodo 3...............................................................................................................49
Figura 9. PCR para identificar la especie parahaemolyticus de Vibrio...................50
Figura 10. PCR para identificar la especie cholerae de Vibrio................................52
Figura 11. PCR para identificar la especie vulnificus de Vibrio...............................54
Figura 12. PCR para identificar el gen tdh que codifica para la toxina TDH de V.
parahaemolyticus.................................................................................................56
Figura 13. PCR para identificar el gen trh que codifica para la toxina TRH de V.
parahaemolyticus.................................................................................................57
Figura 14. Muestras positivas con los genes tdh y/o trh que codifican para las
toxinas TDH y TRH, respectivamente..................................................................57
Figura 15. PCR para identificar el serotipo O3:K6 de Vibrio parahaemolyticus.....58

xiii
 ABREVIATURAS

 % Porciento

 ºC Grados centígrados

 AMPc Adenosín Monofosfabo Cíclico

 APW Alkaline Peptone Water (Agua Peptonada Alcalina)

 ADN Ácido Desoxirribonucleico

 BAM Bacteriological Analytical Manual (Manual Bacteriológico Analítico)

 Ca Calcio

 CAIM Collection of Aquatic Important Microorganisms (Colección de

Microorganismos Acuáticos Importantes)

 CDC Center of Disease Control and Prevention (Centro para el Control y

Prevención de Enfermedades)

 CFSAN Center for Food Safety and Applied Nutrition (Centro para la
Seguridad Alimentaria y Nutrición Aplicada)

 CHX Toxina CHOLIX

 CIAD Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo

 COFEPRIS Comisión Federal para la Protección contra Riesgos

Sanitarios

 CONAOS Consejo Nacional Ostrícola

 CONAPESCA Comisión Nacional de Acuacultura y Pesca

xiv
 xv

 CTX Toxina Colérica

 DNTPs Desoxinucleótidos de trifosfatos

 EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Ácido etilendiaminotetracético)

 et al y colaboradores

 EUA Estados Unidos de América

 FAO Food and Agriculture Organization (Organización para la Agricultura

y la Alimentación)

 FDA Food and Drug Administration (Administración de Drogas y

Alimentos)

 FSIS Food Safety and Inspection Service (Servicio de Inocuidad

Alimentaria e Inspección)

 g Gramos

 h Horas

 H Antígeno Flagelar

 INDRE Instituto de Diagnóstico y Referencia Epidemiológico

 INEGI Instituto Nacional de Estadística y Geografía

 K Antígeno Capsular

 L Litros

 LMAA Laboratorio de Microbiología Ambiental y de Alimentos

 mFC Method for Fecal Coliforms (Método para Coliformes Fecales)

 xvi

 mg Miligramos

 MgCl2 Cloruro de Magnesio

 min Minutos

 mL Mililitro

 mM Milimolar

 Mn Manganeso

 Na Sodio

 NaCl Cloruro de Sodio

 ng Nanogramos

 NMP Número Más Probable

 O Antígeno Somático

 OMP Outer Membrane Proteins (Proteínas de Membrana Externa)

 OPS Organización Panamericana de la Salud

 pb Pares de bases

 PBS Phosphate Buffered Saline (Buffer de Fosfato Salino)

 PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

 SSA Secretaría de Salud

 spp Especies

 TAE Tris-Ácido Acético-EDTA

 xvii

 TCP Toxina Correlacionada al Pilus

 TDH Thermostable Direct Hemolysin (Hemolisina Directa Termoestable)

 TLH Thermolabile Hemolysin (Hemolisina Termolábil)

 Tm Melting Temperature (Temperatura de Alineamiento)

 TRH Thermostable Direct Hemolysin Related Hemolysin (Hemolisina

Relacionada con TDH)

 UFC Unidades Formadoras de Colonias

 USA United States of America

 UV Ultra Violeta

 V Voltios

 X g Gravedad

 L Microlitro
 RESUMEN

Las especies de Vibrio se encuentran naturalmente en el medio marino,

costero y estuarino. Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus se han
asociado principalmente con infecciones transmitidas por el consumo de
mariscos, tales como los moluscos bivalvos. Este estudio consistió en identificar
mediante métodos microbiológicos y moleculares la presencia y concentración
de indicadores de contaminación fecal así como de especies toxigénicas de
Vibrio en ostiones de placer Crassostrea cortiziensis (Hertlein) que se destinan
al consumo humano en la ciudad de Culiacán. Para ello, se realizaron
muestreos en tres periodos (de octubre a diciembre de 2010, de enero a marzo
de 2011 y de abril a mayo de 2011). Se determinó la presencia y cuantificación
de coliformes fecales por conteo en placas en agar mFC, encontrando la
presencia de estos indicadores de contaminación fecal en más del 50% de las
muestras, llegando a concentraciones de hasta 6.33 log 10 g-1. De igual manera
se determinó la presencia y concentración de V. parahaemolyticus, V. vulnificus
y V. cholerae utilizando el Número Más Probable acoplado a la reacción en
cadena de la polimerasa (NMP-PCR), resultando el 77.9% de las muestras
positivas para V. parahaemolyticus. V. cholerae se identificó en el 8.8% de las
muestras de ostión, mientras que V. vulnificus estuvo presente en el 32.3%. El
5.8% de las muestras positivas para V. vulnificus rebasaron los límites
permisibles. Cabe señalar el hecho que tanto V. cholerae como V. vulnificus
deben estar ausentes en este tipo de alimentos según lo indica la NOM242-
SSA1-2009 y lo establecido por la FDA. Las muestras positivas para las
especies de Vibrio se caracterizaron con respecto a la presencia de toxinas así
como serotipo correspondiente. Se determinó por PCR, la presencia de genes
tdh y trh, que codifican para las toxinas de V. parahaemolyticus: hemolisina
directa termoestable (TDH) y hemolisina relacionada a TDH (TRH),

xviii
 xix

encontrándose positivas para tdh en el 23.5% de las muestras, el gen trh en el

2.9%, mientras que ambos genes (tdh/trh) se presentaron en el 5.8%. Se evalúo
la presencia de los genes que codifican para las toxinas de V. cholerae: la
toxina colérica y la toxina cholix, sin embargo, los resultados fueron negativos.
Se encontró la presencia del serotipo pandémico V. parahaemolytcus O3:K6 en
una de las muestras de ostión de placer. En este estudio se observó que las
tres especies de Vibrio se encuentran presentes en ostión de placer crudos, y
que estos no son aptos para su consumo ya que no cumplen los límites
permisibles por las autoridades sanitarias de México y EUA. Los resultados
demuestran que es necesario mejorar el control sanitario de los ostiones que se
consumen crudos, por lo que se sugiere mejorar las prácticas de extracción,
distribución, transporte, almacenamiento y venta, así como reforzar los
programas de verificación sanitaria con el monitoreo de microorganismos como
las especies de Vibrio.
 ABSTRACT

Vibrio species are found naturally in marine, coastal and estuarine

environments. Vibrio parahaemolyticus, V. cholerae and V. vulnificus outbreaks
have been associated with contaminated seafood seafood consumption,
including bivalve mollusks. The arm of this study was to identify the presence
and concentration of indicators of fecal contamination and toxigenic Vibrio
species by molecular methods in oysters Crassostrea corteziensis (Hertlein) that
is intended for human consumption in the city of Culiacan. For this, oysters
samples were taken in three periods (October to December 2010, January to
March 2011 and April to May 2011). We determined the presence and quantity of
fecal coliform by the spread plate technique into agar mFC, finding the presence
of fecal coliforms in more than 50% of the samples, reaching concentrations up
to 6.33 log10 g-1. Also, the presence and concentration of V. parahaemolyticus, V.
vulnificus and V. cholerae was determined by the Most Probable Number
methodology coupled with the polymerase chain reaction (MPN-PCR), resulting
that 77.9% of the samples were positive for V. parahaemolyticus. V. cholerae
was identified in 8.8% of oyster samples, while V. vulnificus was present in
32.3%. The 5.8% of samples positive for V. vulnificus exceeded permissible
limits. It should be noted the fact that both, V. cholerae as V. vulnificus should be
absent in such foods as indicated by the NOM242-SSA1-2009 and by the FDA.
Positive samples for Vibrio species were characterized by detecting genes
encoding toxins and serotype. It was determined the presence of tdh and trh
genes by PCR, which encode for toxins of V. parahaemolyticus: thermostable
direct hemolysin (TDH) and TDH-related hemolysin (TRH), tdh positive finding in
23.5% of the samples, the trh gene in 2.9%, while both genes (tdh / trh) were
presented at the 5.8%. We evaluated the presence of genes encoding toxins of
V. cholerae: cholera toxin and cholix toxin, however, the

xx
 xxi

results were negative. We found the presence of the pandemic serotype V.

parahaemolytcus O3:K6 in oyster samples of pleasure. In this study we
observed that the three Vibrio species are present in raw oyster, and that they
are unfit for consumption because it does not meet the allowable limits by the
authorities in Mexico and the United States. The results demonstrate the need to
improve the sanitary control of oysters eaten raw, so it is suggested to improve
logging practices in the extraction, distribution, transportation, storage and sale,
as well as strengthening health check programs with monitoring of
microorganisms as Vibrio species.
 INTRODUCCIÓN

Hoy en día se han descrito más de 250 enfermedades transmitidas a

través de los alimentos (ETA’s), producidas por bacterias, virus y parásitos. Los
síntomas de las ETA’s se producen por la presencia de los microorganismos o
toxinas que se introducen en el cuerpo a través del tracto gastrointestinal,
ocasionando diarrea, vómito y calambres abdominales (CDC, 2005). Las ETA’s
constituyen un problema importante de salud pública y traen como
consecuencia, la disminución de la productividad económica (Quevedo, 2002).
El Centro para Control de Enfermedades (CDC, siglas en inglés) estima que las
ETA’s generan 325,000 hospitalizaciones y 5,000 muertes cada año en los EUA.
El CDC indica que los consumidores pueden reducir el riesgo de contraer
alguna ETA evitando el consumo de alimentos crudos o mal cocinados de
origen animal como huevos, carne de res, aves de corral, leche no pasteurizada
e inclusive productos del mar como ostiones crudos o poco cocinados (CDC,
2010).

El ostión es un gran recurso económico con un valor de $13,100 millones

de USD (FAO, 2009), y un recurso alimenticio cuya composición química es de
primera calidad, por su riqueza en minerales (2%), entre las que hay que
destacar el calcio, hierro, potasio, fósforo, magnesio y yodo; glúcidos (4%),
lípidos (2%), vitaminas, C, B1, B2, A y D, y un 10% de proteínas para las
sociedades humanas, cuya inocuidad se ve afectada dependiendo de las
características del agua donde se desarrolla (Rosas et al., 1985). Se ha
demostrado que existe una relación entre la contaminación de las áreas donde
se desarrolla el ostión y la incidencia de enfermedades gastrointestinales
(Rosas et al., 1985) y esto se debe a que las bacterias de origen fecal, así como
algunas especies de Vibrio pueden concentrarse en el ostión convirtiéndolo en
un vehículo que transmite bacterias u otros microorganismos patógenos al

1
 2

hombre (Volterra et al., 1980). En algunos países como Japón, Chile y EUA se
han registrado brotes de gastroenteritis por el consumo de ostión crudo (Miwa
et al., 1988; Leyton & Riquelme, 2008). La presencia de coliformes fecales en
ostiones representa un indicador importante para la evaluación de la calidad
sanitaria, debido a la relación directa de los coliformes fecales con bacterias
potencialmente patógenas (Rosas et al., 1985). Las especies del género Vibrio
son la principal causa de la perdida de la inocuidad de los ostiones; estas
incluyen Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus y Vibrio vulnificus (Quevedo,
2002), las cuales son reportadas comúnmente como la principal causa de
enfermedad debido al consumo de productos del mar contaminados (Young,
1998).

Vibrio cholerae se transmite a través de alimentos y agua contaminados

con materia fecal humana. Es el agente del cólera, que provoca una infección
intestinal aguda caracterizada por la pérdida excesiva de agua y electrolitos a
través del recto, y si no es tratada a tiempo puede provocar la muerte
(Nwachuckwu, 2006). El cólera ha ocasionado muertes desde su aparición en la
primer década del siglo XIX, pero ocasionó el mayor número de defunciones en
los 90’s. El brote de cólera más reciente está registrado en Haití, que comenzó
a finales de octubre de 2010. Para abril de 2011, ocasionó el fallecimiento de
4,835 personas y la hospitalización de más de 20,000 (Talkington et al., 2011).

Por otra parte, V. parahaemolyticus es uno de los principales patógenos

que causan gastroenteritis transmitida por pescados y mariscos en todo el
mundo, incluyendo a países desarrollados como EUA y Japón (Nair et al.,
2007).

V. vulnificus puede causar gastroenteritis y septicemia, esta última con

una alta tasa de mortalidad (50%) entre los pacientes inmunocomprometidos,
principalmente asociado a personas que consumen ostiones crudos o poco
cocinados (Jones & Oliver, 2009).
 3

Los factores que pueden estar asociados en la contaminación del ostión

son la recolección en zonas prohibidas debido a una alta contaminación fecal, el
almacenamiento del producto a temperaturas inapropiadas, el tiempo que
transcurre entre su recolección y su distribución, así como la exposición al
medio ambiente (Rosas et al., 1985).

En virtud de los riesgos implícitos desde su cultivo hasta su consumo, las

autoridades mexicanas establecieron la Norma Oficial Mexicana para moluscos
frescos, refrigerados y congelados, la cual es de carácter obligatorio y
(establece que estos productos pesqueros se deben de mantener a una
temperatura menor a 7.2 ºC para su transporte y conservación (NOM-242-
SSA1-2009). Sin embargo, aun contando con una NOM obligatoria, la
recolección, los ostiones son transportados en seco y a temperatura ambiente
hasta los centros de distribución, pasando horas e inclusive días para llegar
hasta su destino final creando un ambiente propicio para la proliferación de
bacterias potencialmente patógenas (Guzmán-García et al., 2005).

En las costas de Sinaloa, una de las especies de mayor volumen de

captura es el ostión de placer, el cual se consume exclusivamente en Sinaloa
(CONAPESCA, 2010) existiendo en la ciudad de Culiacán más de cien
establecimientos de mariscos (H. Ayuntamiento de Culiacán, 2010). Debido a
esto, se planteó como objetivo general de este trabajo cuantificar coliformes
fecales como indicador de contaminación fecal, así como de especies
toxigénicas de Vibrio en ostiones que se destinan al consumo humano en la
ciudad de Culiacán, Sinaloa.
 REVISIÓN DE LITERATURA

Producción del Ostión

El principal componente en la producción de moluscos en 2009 fueron

los ostiones, con el 31.8% de la producción mundial, alcanzando la cifra de
4,435,911 toneladas en el año 2009, a la cual contribuyeron principalmente
países como Japón, Francia, Chile, España, Australia y México. La producción
de moluscos en su conjunto aumentó a un ritmo anual del 3.7% en el período
2000-2009 (FAO, 2009). Durante el año 2008 se produjeron en México 44,452
toneladas (CONAPESCA, 2010).

En el estado de Sinaloa se produjeron 443 toneladas de ostión,

destinadas exclusivamente al consumo regional generando ganancias de $350,
630 pesos.

Generalidades del Ostión

Clasificación y Nomenclatura

El género Crassostrea pertenece al filo Mollusca de la clase Bivalvia, el

cual es uno de los grupos más antiguos y numerosos del reino animal. Existen
aproximadamente 8,500 especies de bivalvos marinos. Además de los ostiones
(Crassostrea), existen otros moluscos bivalvos como las almejas (Mercenaria),
mejillnes (Mytilus), berberechos (Cerastoderma) entre otros (Potasman et al.,

4
 5

2002). El ostión está conformado de dos valvas de forma irregular con aspecto
áspero en el exterior y lisa en su interior. La valva inferior se fija al sustrato y
forma un hueco donde se aloja la masa del cuerpo, que es lo que se consume
(Cifuentes et al., 1997).

Fisiología

Los ostiones se encuentran comúnmente en áreas donde hay altos

niveles de nutrientes, tales condiciones prevalecen en aguas poco profundas.
Estos se alimentan de fitoplancton suspendido a través de un par de branquias
especializadas. El aparato digestivo de los ostiones se encuentra adecuado
para filtrar hasta 150 L de agua al día, estos grandes volúmenes de agua se
bombean a través de las branquias por acción de los cilios. Los ostiones
cuentan con dos sifones, que son dos tubos encargados de la circulación del
agua dentro de la concha del molusco (Cifuentes et al., 1997).

Los ostiones poseen un régimen alimentario, que consiste en concentrar

a través del bombeo del agua, gran cantidad de partículas en suspensión, entre
ellas, fitoplancton, bacterias patógenas, toxinas marinas y trazas de metales
que pueden afectar la salud quien lo consume (Lee et al., 2001).

Especies de Ostión

Ostión de Roca (Crassostrea iridescens). Esta especie se puede encontrar a lo

largo de las costas del océano pacífico, desde las cosas de Baja California Sur
hasta el norte de Perú. Esta especie alcanza un gran tamaño (entre 15 y 25
cm), por lo que se ha convertido en un recurso importante para las poblaciones
 6

de la costa del océano pacífico (CONAOS, 2009). Se encuentra en zonas

rocosas localizadas en la rompiente de las olas y en profundidades de hasta 15
m, crece a temperaturas entre los 29 y 31 ºC (Barnes, 1989). En Sinaloa, la
explotación comercial de esta especie se realiza principalmente en los
municipios de Mazatlán y San Ignacio, al sur del estado, llevándose a cabo por
medio de buceo libre (Melchor-Aragón et al., 2002).

Ostión de Mangle (Crassostrea rhizophorae). Esta especie se puede encontrar

adherida a las raíces de los mangles (Rhizophora mangle), crece a
temperaturas entre 25 y 31ºC, teniendo una enorme importancia económica y
comercial en México (CONAOS, 2009).

Ostión de Placer (Crassostrea corteziensis). Es una especie nativa de las

costas del Golfo de California y se puede encontrar adherida a las rocas. El
crecimiento óptimo de esta especie ocurre de 28 a 30ºC (Castillo-Durán et al.,
2010). Además, esta especie se desarrolla dentro de la acuacultura comercial,
cultivándose en la región noroeste de México y representa una especie con alto
potencial acuícola para la zona del Pacífico mexicano ya que puede ser
cultivado todo el año (Pérez-Enriquez et al., 2008; Castillo-Durán et al., 2010).

Bacterias Patógenas en Ostión

Existen dos grupos de bacterias que contaminan los productos marinos

como el ostión y que están relacionados a afectaciones a la salud pública: las
bacterias que habitan naturalmente el medio marino, tales como Aeromona
hydrophila, Clostridium botulinum, Vibrio parahemolyticus, Vibrio cholerae,
Vibrio vulnificus y Listeria monocytogenes, y enterobacterias procedentes de la
contaminación del agua con residuos humanos como Salmonella sp, Shigella
sp y Escherichia coli (Pereira et al., 2006). Los organismos acuáticos filtradores,
 7

como los ostiones, que se consumen crudos, son conocidos vectores de Vibrios
patógenos para el humano (Potasman et al., 2002).

La concentración del patógeno aumenta en los estuarios durante los

meses cálidos facilitando el crecimiento bacteriano. Los factores que pueden
estar asociados a la proliferación de bacterias dentro del ostión, son el
almacenamiento a temperaturas inadecuadas, así como el tiempo prolongado
entre su extracción o recolección hasta su distribución y consumo (Fig. 1) (Fica,
2007).

Figura 1. Posibles factores que favorecen en el aumento de la carga bacteriana en

ostiones (Fica, 2007).

Indicadores de Contaminación Fecal en Ostión

Las bacterias que se encuentran con mayor frecuencia en el agua y los

alimentos son las entéricas, las cuales colonizan el tracto gastrointestinal del
hombre y animales de sangre caliente, y son expulsadas a través de la materia
fecal. Debido a que su detección y cuantificación a nivel de laboratorio son
 8

laboriosos y requieren de mucho tiempo, hoy en día se busca un grupo

alternativo de indicadores que sean de más fácil y rápida detección. En este
sentido, el grupo de las bacterias coliformes es el más utilizado (Campos,
2003). Los coliformes fecales son miembros de la familia Enterobacteriaceae y
se definen como bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas en forma de
bacilos capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h a
45ºC (Camacho et al., 2009). Estas bacterias conforman el 10% de los
microorganismos en el intestino humano y otros animales de sangre caliente.
Los coliformes fecales incluyen a géneros como: Escherichia, Klebsiella y
Citrobacter (Martínez, 2007), cuyo origen puede no ser el tracto intestinal
(Prescott et al., 2002). La presencia de estos indicadores de contaminación
fecal representa una medida de posibilidad de que existan patógenos entéricos
en una muestra (Vásquez & Cabral, 2001).

Género Vibrio

El género Vibrio está formado por bacterias Gram negativas, curvadas

(con forma de coma), anaerobios facultativos, presentan un único flagelo polar y
se encuentran difundidos ampliamente en ambientes acuáticos marinos (Austin,
2009). El rango de distribución y las preferencias por un hábitat entre las
diferentes especies está asociado por características ambientales dominantes
en la zona y, en especial, con los niveles de salinidad y las variaciones de
temperatura que van a modular su ciclo de vida en estos sistemas naturales
(Fig. 2). Las infecciones causadas por estos patógenos tienen gran importancia
en salud pública debido a que han incrementado su incidencia a nivel mundial
durante las últimas décadas (Morris, 2003; Nair et al., 2007). Muchas especies
de Vibrio causan enfermedad en animales acuáticos como peces, moluscos, y
mamíferos marinos pero también en humanos. (Morris, 2003).
 9

Figura 2. Comportamiento biológico de Vibrio spp, mecanismo de transmisión al

humano y al ambiente acuático.

Especies de Vibrio

Se reconocen 73 diferentes especies del género Vibrio, de las cuales

trece se consideran patógenas para los humanos, ocho de las cuales pueden
causar, o estar asociadas con enfermedades transmitidas por alimentos (Drake
et al., 2007).

La mayoría de las ETA’s son causadas por Vibrio cholerae, Vibrio

parahemolyticus o Vibrio vulnificus, las cuales generan mayores repercusiones
en la salud pública y en el comercio de pescados y mariscos (Oliver & Kaper,
1997). Algunas especies se asocian con enfermedades gastrointestinales (V.
cholerae y V. parahaemolyticus), mientras que otras pueden estar relacionadas
con enfermedades extraintestinales, como la septicemia (V. vulnificus) (Morris,
2003).
 10

Las dosis infectivas para V. parahaemolyticus y V cholerae son de 105 y

104 microorganismos respectivamente, las cuales son concentraciones
relativamente altas (Colwell, 1996), para el caso de V. vulnificus, la dosis
infectiva para presentar los síntomas de gastroenteritis en individuos sanos es
desconocida, pero en personas susceptibles o inmunocomprometida,
posiblemente pueda presentarse septicemia con dosis de al menos 100
organismos (FDA-BBB, 2000). Los peces recién pescados y los moluscos
recién cosechados como los ostiones, generalmente presentan una carga
menor de la necesaria para infectar al hombre. Es por eso que se presume que
la carga mayor se debe al manejo de estos productos marinos, que permite la
multiplicación de las especies de Vibrio en los alimentos. El tiempo de
generación de V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus es de 12 min, 24
min y 3 h, respectivamente (Mancilla, 2005; Hoshino et al., 1998; Jonesn and
Oliver, 2008), y basta la exposición del alimento a la temperatura ambiente por
unas horas para que la carga bacteriana pueda producir la intoxicación en el
hombre (Mancilla, 2005).

Vibrio parahaemolyticus

Características Principales

Distribución. Vibrio parahaemolyticus es un habitante natural de los ambientes

marinos de las zonas costeras y los estuarios alrededor del mundo. La
presencia de este microorganismo se ha limitado a las zonas geográficas
cálidas y templadas (DePaola et al., 2000). Sin embargo, la aparición de
 11

infecciones causadas por V. parahaemolyticus en zonas de Europa y América

ha revelado la presencia del microorganismo en regiones donde nunca se había
informado con anterioridad (Fuenzalida et al., 2006). La dispersión progresiva
de V. parahaemolyticus y la colonización de nuevas áreas se han relacionado
con el incremento de la temperatura en las aguas costeras (González-Escalona
et al., 2005). A pesar de esto, hay poca información disponible sobre las
variables ambientales que rigen la dinámica de las poblaciones de V.
parahaemolyticus (Martínez-Urtaza et al., 2008).

Sintomatología. Vibrio parahaemolyticus se puede aislar de una gran variedad

de productos pesqueros crudos, particularmente en moluscos bivalvos como los
ostiones, cuyo consumo produce el contagio al humano (DePaola et al., 2003).
El periodo de incubación de esta especie de Vibrio puede ser de cuatro hasta
96 horas, con un promedio de 15 horas. El cuadro clínico que se presenta se
considera de gravedad moderada y puede tener una duración de tres días en el
humano. La diarrea que ocasiona puede ser acompañada de sangre. Además
del cuadro de gastroenteritis, V. parahaemolyticus puede causar infecciones en
heridas y septicemia (FAO, 2002; OMS, 2002; OPS, 2008).

Patogenicidad. La patogenicidad de esta bacteria en los humanos está

asociada con la producción de la hemolisina directa termoestable (TDH) y la
hemolisina relacionada con TDH (TRH) (Rojas et al., 2011). Sin embargo, no
todas las cepas de Vibrio parahaemolyticus son patógenas (Deepanjali et al.,
2005). Otra hemolisina termolábil (TLH), la cual es codificada por el gen tlh, es
considerada como un marcador especie específico. Este gen ha sido detectado
en todas las cepas de V. parahaemolyticus (Rojas et al., 2011).

TLH (hemolsisina termolábil) es lábil al calor (60 ºC durante 10 min). El

gen de la TLH (tlh) contiene un marco de lectura abierta (ORF) de un tamaño de
1254 kb. A partir de la secuenciación de nucleótidos del gen tlh se reveló que la
 12

pre proteína y la proteína madura consisten en 418 y 398 aminoácidos con un

peso molecular que corresponde a 47.5 y 45.4 kDa, respectivamente (Shinoda
et al., 1991). El contendido de G + C en el gen tlh es del 47.6% (Taniguchi et al.,
1985). Este gen se ha encontrado en los genomas de todos los aislamientos de
V. parahaemolyticus examinados, independientemente de su fuente (Taniguchi
et al., 1985; Bej et al., 1999). Sin embargo, el papel que desempeña esta
hemolisina en la enteropatogenicidad de V. parahaemolyticus es aún
desconocida (Shinoda et al., 1991).

Las hemolisinas (TDH y TRH) pueden encontrarse juntas o por separado

en cepas toxigénicas de V. parahaemolyticus, y se han correlacionado
fuertemente con la capacidad de virulencia de las cepas portadoras (Nishibuchi
& Kaper, 1985; Nishibuchi et al., 1989). V. parahaemolyticus adquirió los genes
que codifican estas hemolisinas a través de la transferencia horizontal de genes
(Raimondi et al., 2000; Thompson et al., 2004).

La mayoría de las cepas de V. parahaemolyticus aisladas de casos de

gastroenteritis en humanos producen una beta hemolisina en agar Wagatsuma,
que es un tipo de agar sangre (Iida & Honda, 1997). La capacidad de causar
hemólisis en este medio se denomina fenómeno de Kanagawa (Fig. 3) (KP,
siglas en inglés), y se debe a TDH codificada por el gen tdh, (Kaper et al., 1984;
Nishibuchi et al, 1985). Esta toxina proteínica es un dímero que se compone de
dos subunidades idénticas, cada una con una masa molecular de 21 kDa
(Takeda et al., 1978). La TDH purificada es estable al calor, incluso a una
temperatura de 100ºC durante 10 min, y tiene una secuencia de 165
aminoácidos con un enlace disulfuro cerca del carboxilo terminal (Tsunasawa et
al., 1987). Estos datos están de acuerdo con la secuencia de nucleótidos del
gen tdh. La TDH es hemolítica, citotóxica, enterotóxica y presenta actividad de
cardiotoxicidad. La TDH causa daños a la membrana de los eritrocitos, al actuar
como una toxina que forma poros de alrededor de 2 nm de diámetro, también
 13

posee la capacidad de lisar células eucariotas haciendo agujeros en la

membrana plasmática (Honda et al., 1992). Esta toxina produce hemólisis en
tres etapas sucesivas, es decir, la unión a la membrada de los eritrocitos,
seguido por la formación de un poro transmembranal, y la alteración de la
membrana celular (Honda et al., 1992). La región N-terminal está involucrada
en el proceso de unión, mientras que la región cercana a C-terminal se ha
implicado después de la unión (Tang et al., 1997).

Figura 3. Fenómeno de Kanagawa (Zamora et al., 2005).

En estudios previos, como el desarrollado por Honda et al. (1992), se

han aislado cepas de V. parahaemolyticus KP negativos que producen una
hemolisina relacionada con TDH, llamada TRH, que es considerada también
como un factor importante de virulencia. TRH estimula la secreción de fluidos, lo
que sugiere que la toxina induce la diarrea. Además, se determinó que las
secuencias de aminoácidos de TRH tiene una homología del 67% con TDH. La
TRH se relaciona inmnológicamente con TDH, pero no son idénticos. La TRH
es lábil al calor a 60 ºC durante 10 min y es codificada por el gen trh (Chatterjee
et al., 1984). Ambas toxinas inducen la secreción de cloruro en las células
epiteliales del colon (Iida & Honda, 1997).

Serotipificación. V. parahaemolyticus posee varios serotipos, los cuales son

diferenciados según sus antígeno somático (O), capsular (K) y flagelar (H). El
 14

antígeno H es común a todos los tipos, por lo que la serotipificación se realiza

con base en los antígenos O y K.

Antecedentes de Brotes Infecciosos

Vibrio parahaemolyticus es la principal causa de gastroenteritis asociado

a Vibrio en los Estados Unidos de América (Potasman et al., 2002). Mediante la
PCR múltiple, que amplifica los genes que codifican para TDH, se ha detectado
este microorganismo en EUA, donde lo identificaron como productor de
hemolisina, aislado de muestras de pacientes, mariscos, ambientales,
laboratorios y plantas ostrícolas (Bej et al., 1999). Los brotes en este país son
esporádicos. Entre los años 1973-1998 los Centros para Control y de
Prevención de Enfermedades (CDC) reportaron aproximadamente 40 brotes
(Daniels et al., 2000), de los cuales cuatro se han asociado al consumo de
ostiones crudos, generando alrededor de 700 casos (DePaola et al., 2000). En
2006, ocurrió un brote en el estado de Washington por consumo de ostiones
contaminados que procedían de las costas de Washington y la Columbia
Británica en el cual hubo un total de 177 casos (CDC, 2006).

En los últimos años, V. parahaemolyticus se ha convertido en la causa

principal de gastroenteritis asociada al consumo de productos pesqueros en
países como Japón (Lee et al., 2001), donde fue el causante de un brote con
272 casos de enfermedad y 20 decesos asociado al consumo de sardinas
(Daniels et al., 2000). En China los casos de gastroenteritis por V.
parahaemolyticus representaron el 31.1% de brotes de origen alimentario (Liu
et al., 2004) y es reconocido como una causa común de enfermedad en muchos
países de Asia (Wong et al., 2000).
 15

Los brotes infecciosos que se han presentado a partir de 1996 a nivel

mundial se han atribuido a la aparición de un serotipo con un potencial
pandémico importante, que es el O3:K6, el cual presenta mayor adherencia y
citotoxicidad en cultivos de tejidos que otros serotipos de V. parahaemolyticus,
lo cual contribuye a incrementar su potencial patogénico (Akeda et al., 1997). V.
parahemolyticus O3:K6 es responsable del 50 al 80% de las infecciones por
este microorganismo desde su aparición en Calcuta, India en 1996, incluyendo
epidemias en India, Rusia, el sudeste asiático, Japón y Norte América
(Heitmann et al., 2005).

En México, se ha aislado V. parahaemolyticus de muestras de agua de

mar, pescado y ostiones obtenidos de la laguna de Pueblo Viejo en el estado de
Veracruz, donde se determinó el serotipo, se caracterizó fenotípica y
genotípicamente las toxinas TDH y TRH. Se aislaron un total de 46 cepas de V.
parahaemolyticus, en ninguna de ellas se identificó el gen trh, sin embargo, 4
cepas amplificaron el fragmento correspondiente al gen tdh. Este fue el primer
reporte de la presencia de cepas de V. parahaemolyticus tdh positivas
provenientes de muestras ambientales en México (Cabrera-García et al., 2004).
Cabe resaltar que en años recientes se ha detectado V. parahaemolyticus en
Sinaloa, causando brotes de gastroenteritis ocasionados por la cepa pandémica
O3:K6 de alta toxicidad debido a que presenta toxinas (Cabanillas-Beltrán et al.,
2006).
 16

Vibrio cholerae

Características Principales

Distribución. Vibrio cholerae es un habitante autóctono de los ecosistemas

fluviales, estuarios y aguas salobres.

Sintomatología. Es el causante de las pandemias de cólera, la cual produce un

tipo de gastroenteritis causada por cepas productoras de la toxina colérica que
produce una diarrea acuosa muy abundante, conocida como “agua de arroz”
que puede conducir a la muerte (Morris, 2003).

Serotipificación. V. cholerae, es una especie bien definida sobre las bases de

pruebas bioquímicas y moleculares. Pero la especie no es homogénea en lo
que respecta a su potencial patógenico. La presencia de antígenos somáticos
termoestables O, ha permitido determinar más de 200 serogrupos de V.
cholerae, y solo dos, los serogrupos O1 y O139 se consideran responsable de
epidemias de cólera, siendo los únicos con capacidad para producir la toxina
colérica (Yamai et al., 1997). La proteína de membrana externa OmpW de V.
cholerae se ha descrito como una molécula de 22 kDa (Jalajkumari & Manning,
1990). Esta proteína parece ser conservada en las cepas de V. cholerae, lo que
condujo al desarrollo de un método rápido basado en la PCR para la
identificación del microorganismo (Nandi et al., 2000).

Patogenicidad. La toxina colérica (CTX) produce en el humano síntomas como

diarreas muy acuosas, náuseas, vómito, deshidrataciones que podrían terminar
en la muerte (Blokesch & Schoolnik, 2007); en los serogrupos O1 y O139 se
han desarrollado y evaluado métodos como la PCR múltiple, que permite la
detección rápida de ctxA, que es el gen que codifica para la toxina colérica
 17

(Hoshino et al., 1998). Cada molécula de CTX, está conformada por cinco
subunidades B (de enlace) y una subunidad A (activa). Las subunidades B se
unen a los receptores del gangliósido G M1 en las células epiteliales de la mucosa
intestinal. Después de la unión, se separan la subunidad A1 y el componente
A2, facilitando la entrada del componente A1 a la célula. El componente A1 de
la toxina colérica estimula la producción de la enzima adenilciclasa, involucrada
en la producción del adenosín monofosfato cíclico (AMPc). Concentraciones
intracelulares altas de AMPc alteran el transporte activo de los electrolitos a
través de la membrana de la célula, lo cual impide la adsorción de líquido y
conduce a su secreción en el intestino delgado (Fernández & Alonso, 2009).

V. cholerae es uno de los primeros microorganismos en los que se ha

completado la secuenciación de su genoma, el cual está constituido por dos
cromosomas ciculares de 2,961,146 pb (cromosoma 1) y 1,072,314
(cromosoma 2). En conjunto, ambos cromosomas codifican para 3,885 marcos
de lectura abierta (ORF). El cromosoma 1 se localiza la mayoría de los genes
que son primordiales para las funciones de la bacteria, como la replicación,
transcripción y traducción del ADN, así como de patogenicidad (toxinas y
adhesinas) (Fernandez & Alonso, 2009).

El proceso infeccioso que causa V. cholerae es complejo e involucra

varios factores para colonizar el epitelio intestinal, para lo cual expresa potentes
enterotoxinas. Los genes que actúan como factores de virulencia se encuentran
en grupos, también llamados clusters. Se creía que estos genes formaban parte
del cromosoma de las cepas toxigénicas, pero hoy en día se sabe que estos
son parte del genoma de fagos filamentosos (Kimsey & Waldor, 1998). Cuando
la bacteria se sitúa en el epitelio intestinal produce la toxina colérica (CTX). Los
genes que codifican a esta toxina (ctxA y ctxB) forman parte de un elemento
genético, el cual consiste de al menos seis genes que integra la región del
centro (core) (Karolis et al., 1998). En realidad el elemento genético es el
 18

genoma de un fago filamentoso CTXΦ el cual puede propagarse en cepas

receptoras de V. cholerae, donde el genoma de CTXΦ puede integrase al
cromosoma en sitios específicos, o mantenerse como plásmido. CTXΦ es de
ADN de cadena positiva y está compuesto por una región de 4.5 kb llamado
“core” o centro (elemento génetico) el cual está formado por seis genes: ctxA-
ctxB, codifican para la subunidad A y B de la toxina colérica, respectivamente;
zot, codifica para la toxina zonula occudens; cep, codifica para pilina; ace,
codifica para la enterotoxina accesoria del cólera; y orfU, codifica un producto
cuya función es todavía desconocida (Faruque et al., 1998). La parte central
(core) se encuentra rodeada por copias de la región llamada RS, que es una
secuencia de repetidos que se dividió en RS1 y RS2 de 2.7 y 2.4 kb,
respectivamente Esta región codifica para un sistema de integración sitio-
específico (Kimsey & Waldor, 1998).

Para que CTXΦ se introduzca a las cepas de V. cholerae es necesario la

presencia de TCP (toxina correlacionada al pilus) (Fig 4), que actúa como
receptor del fago y es un factor que promueve la colonización del intestino por
la bacteria; sus genes están localizados dentro de una isla de patogenicidad
que posee un tamaño de 40 kb que también es transferida por otro fago
filamentoso (VPIΦ), el cual es un factor importante de virulencia. VPIΦ posee
ADN de cadena sencilla y positiva (Herrington et al., 1998; Karolis et al., 1998).

Figura 4. Representación esquemática de TCP

En las cepas patógenas, además de los genes que codifican para la

toxina colérica están, también presentes genes que codifican para TCP, el cual
 19

es un factor de colonización, y la ToxR, que es una proteína que co-regula la

expresión de ambos (Herrington et al., 1988). Ambos genes se transfieren de
forma horizontal mediante una infección fágica (el operón ctxAB, de CTX, forma
parte del genoma del fago CTX Φ, el cual esta lisogenizado en V. cholerae) y se
localizan en elementos genéticos compartidos en el cromosoma I (cromosoma
mayor) de la bacteria. Las cepas toxígenicas contienen una o varias copias del
operón ctxAB, TCP es un receptor del fago y promueve la colonización del
intestino por la bacteria; sus genes se localizan en una isla de patogenicidad de
40 kb (Karolis et al., 1998).

La toxina cholix (CHX) presente en los serogrupos no O1 y no O139, la

cual es responsable de detener la síntesis de proteínas en las células
eucariotas (Purdy et. al., 2010), provoca síntomas similares a los que producen
los otros serogrupos, solo que la diarrea en este caso presenta abundante
moco y sangre, y también puede ocasionar septicemia (Jorgensen et al., 2008).
Esta toxina tiene actividad de ADP-ribosiltransferasa, y es activa contra células
de mamíferos y crustáceos, con actividad específica contra el factor ribosomal
de elongación tipo 2. Para su acción requiere de endocitosis mediada por un
receptor, traslocación al citoplasma hospedero, donde produce la inhibición de
la síntesis proteica por modificación específica del factor de elongación. Se ha
propuesto que este factor juega un rol importante en la supervivencia del
microorganismo en el ambiente acuático (Jorgensen et al., 2008). Los
serogrupos no O1 y no O139 suelen aislarse de fuentes ambientales y pueden
producir casos esporádicos de gastroenteritis y de infecciones extra-intestinales
(Colwell et al., 1995).
 20

Antecedentes de Brotes Infecciosos

V. cholerae es responsable de grandes pandemias ya que es la causa

de la enfermedad infecciosa conocida como cólera, que presenta una mayor
incidencia en los países en vías de desarrollo de clima tropical (Olaniran et al.,
2010).

En algunos países, generalmente en vías de desarrollo, la enfermedad

es endémica. En cambio, en los países desarrollados se detectan solo casos
esporádicos, importados de zonas endémicas o en las que existe algún brote de
la enfermedad. A principio de los años 90, se detectó Vibrio cholerae en las
regiones costeras de Perú y se dispersó rápidamente hacia los diferentes
países del continente, formando la llamada séptima pandemia del cólera. La
aparición de la enfermedad en las costas de Perú es un misterio; algunos
estudios sugieren que la fuente fue el transporte marino, mientras que otros
sugieren que la fuente fue local (Tauxe et al., 1994). Siguiendo el primer reporte
en Perú, en enero de 1991, el cólera fue reportado en México. El número de
casos reportados en México incrementó de 1991 a 1993, decreciendo
substancialmente en 1994, pero remontó alcanzando los niveles más altos
registrados en 1995 con un total de 15,526 casos. Posteriormente, los casos de
cólera fueron decreciendo, hasta no ser reportados por el Instituto de
Diagnóstico y Referencia Epidemiológicos (INDRE) desde 2002 (Sepúlveda et
al., 2006).
 21

Vibrio vulnificus

Características Principales

Distribución. Vibrio vulnificus tiene su hábitat natural en los ambientes marinos

costeros de todo el mundo y hasta la fecha se ha aislado de agua, sedimentos y
una variedad amplia de pescados y mariscos, incluyendo peces, camarones,
almejas, ostiones, entre otros (Baffone et al., 2006; Mahmud et al., 2008). Para
su desarrollo necesita temperaturas cálidas por encima de los 20ºC y aguas con
un nivel de sal entre 0.7 y 1.6%. Esta bacteria, al igual que las especies de
Vibrio descritas anteriormente, puede encontrarse en los organismos marinos
que se alimentan por medio de un proceso de filtración (Kumamoto & Vukich,
1998).

Sintomatología. Es considerado un oportunista altamente patogénico y letal

para determinados grupos humanos de riesgo, como lo son aquellas personas
inmunocomprometidas, con una tasa de mortalidad que puede superar el 50%
llegando incluso al 90% en casos de hipotensión grave. En general, V.
vulnificus puede definirse como un microorganismo que posee caracteres
fisiológicos que contribuyen a su supervivencia en los ambientes marinos y en
el humano como hospedero (Jones & Oliver, 2009).

Patogenicidad. La citolisina (VVH) producida por V. vulnificus ha sido el

marcador de virulencia más estudiado (Gray & Kreger, 1985). Esta enterotoxina
tiene un peso molecular de 51 kDa y es codificada por el gen vvhA (Yamamoto
et al., 1990). Tiene la propiedad de lisar los eritrocitos de una gran variedad de
especies animales, mediante la formación de pequeños poros en la membrana
citoplasmática (Yamamoto et al., 1990). Con base en la secuencia del gen
vvhA, que es altamente conservado, se han diseñado técnicas de biología
 22

molecular para usarse como blanco en la identificación del microorganismo a

partir de muestras ambientales, como agua y ostiones (Panicker et al., 2004). V.
vulnificus causa septicemia cuando se aloja en hospederos con enfermedades
del hígado o inmunocomprometidos, también produce infección en heridas y en
individuos sanos ocasiona gastroenteritis ligera (Drake et al., 2007).

Antecedentes de Brotes Infecciosos

La presencia de este microorganismo como patógeno fue identificada en

el año de 1976. Desde ese año, es reconocido como el agente etiológico de
diversos brotes en los Estados Unidos, especialmente en estados como Florida
y California. En Florida, de 1981 a 1992, se reportaron brotes en los que hubo
dos decesos, 237 personas diagnosticadas con gastroenteritis y 102
desarrollaron septicemia. El 49% de los que desarrollaron septicemia tuvieron
consecuencias fatales y se detectó que el 80% de estas muertes fueron
causadas por V. vulnificus (CFSAN, 1993).

V. vulnificus se ha aislado de ostiones en el sur de la Florida en los

Estados Unidos, gracias al método rápido de PCR tiempo real, que además de
detectar el el gen vvhA también cuantifica al microorganismo. Esta técnica se
puede ser de gran ayuda ya que es rápido, sensible y específico (Campbell &
Wright, 2003).

En Israel se han descrito varios brotes de V. vulnificus que se han

relacionado con el aumento de las temperaturas, lo que hace pensar que el
cambio climático podría relacionarse con un incremento de este tipo de brotes
y su distribución en todo el mundo, a pesar de que la tasa de infección sigue
 23

siendo relativamente baja, esto se debe a que V. vulnificus raramente causa

enfermedad grave en individuos sanos (Klontz et al., 1988).

Detección de Patógenos por Métodos Microbiológicos y Moleculares

La detección e identificación rápida de patógenos son los temas

claves en el control de infecciones de origen alimentario. Se ha demostrado que
la reacción en cadena de polimerasa (PCR) puede detectar un bajo número
de bacterias específicas en contra de un gran fondo de otras células
procariotas, eucariotas y de materia orgánica que puede estar presente en las
muestras (Tsai & Olson, 1992). Por lo tanto, la técnica de PCR es un método
particularmente adecuado para el análisis de muestras ambientales (Luan et al.,
2008). Esta técnica se ha convertido en un método de rutina en los laboratorios
de diagnóstico clínico y de alimentos debido a su especificidad, sensibilidad
y por su sistema de detección rápida. Comparación entre las pruebas
microbiológicas convencionales con cultivos y PCR muestra que las técnicas
moleculares tienen el potencial para el ahorro de tiempo y son susceptibles
de tratamiento automatizado de gran número de muestras. PCR ha sido
ampliamente utilizado como una herramienta de diagnóstico en los laboratorios
clínicos de más de una década, pero su aplicación a la industria
alimentaria está recién comenzando (Ramamurthy & Nair, 2005).

El número más probable (NMP) fue desarrollado para la estimación de

los organismos sobre la base de la probabilidad. Los métodos de
detección basados en NMP-PCR se han descrito para la enumeración de
microorganismos específicos en muestras de suelo (Vesa et al., 1997) y de V.
parahaemolyticus (Miwa et al., 2003). La combinación de estos métodos
 24

puede aplicarse fácilmente con cualquier sistema de oligonucleótidos (Vesa et

al., 1997).

Normativas para la Regulación de Coliformes Fecales y Vibrio spp en Moluscos

Bivalvos

Los moluscos bivalvos pueden presentar peligros microbiológicos, que

hacen preciso el establecimiento de normas específicas que permitan garantizar
un elevado nivel de protección de la salud pública. En EUA, la FDA establece
entre sus parámetros microbiológicos la detección y cuantificación de coliformes
fecales y Vibrio parahaemolyticus, así como la detección de Vibrio cholerae, y
Vibrio vulnificus (FDA, 2011). En México, se cuenta con la Norma Oficial
Mexicana NOM-242-SSA1-2009 para la regulación de moluscos bivalvos
frescos, refrigerados y congelados, en la que se determinan las
especificaciones sanitarias que deben cumplir estos productos destinados al
consumo humano. En esta norma se cuentan con parámetros microbiológicos
iguales a los establecidos por la FDA descritos anteriormente (Cuadro1).

El recuento total indiferenciado de V. parahaemolyticus es usado como

indicador para el control de contaminación de alimentos y con el objetivo de
prevenir infecciones. Claramente, es un indicador inadecuado como se ha
comprobado en los brotes epidémicos ocurridos en EUA donde, pese a el
monitoreo bacteriológico en sitios de recolección y a pesar que el número de V.
parahaemolyticus era inferior al permisible (10 4 NMP g-1), los brotes no han
podido ser evitados (Nair et al., 2007).
 25

Cuadro1. Límites permisibles para la regulación de moluscos bivalvos frescos

(FDA y NOM-242-SSA1-2009).

Parámetros
Microorganismo
FDA NOM242-SSA1-2011

230 NMP/100 g
Coliformes Fecales 230 NMP/100 g
0.36 log10

V. cholerae Ausente Ausente

V. parahaemolyticus 104 NMP g-1 104 NMP g-1

V. vulnificus Ausente Ausente

 PREGUNTAS DE INVESTIGACIÓN

1. ¿Cuál será la concentración de coliformes fecales presentes en las

muestras de ostión de placer obtenidas de los establecimientos de mariscos de
la ciudad de Culiacán, Sinaloa?

2. ¿Qué especies de Vibrio (Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus,

Vibrio vulnificus) se encontrarán presentes en muestras de ostión de placer
obtenidas de los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán,
Sinaloa?

3. ¿Cuál será la concentración de especies de V. cholera, V.

parahemolyticus y V. vulnificus en las muestras de ostión de placer obtenidas
de los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa?

4. ¿Cuáles de los genes ctx y chx que codifican para la toxina colérica y
la toxina cholix se detectarán en las muestras positivas para V. cholerae en
muestras de ostión de placer obtenidas de los establecimientos de mariscos de
la ciudad de Culiacán, Sinaloa?

5. ¿Cuáles de los genes tdh y trh que codifican para la hemolisina directa
termoestable y la hemolisina relacionada con TDH se detectarán en las
muestras positivas para V. parahaemolyticus en muestras de ostión de placer
obtenidas de los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán,
Sinaloa?

6. ¿Cuántas de las muestras positivas para V. cholerae, obtenidas de

ostión de placer de los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán,
Sinaloa, corresponden a los serogrupos pandémicos O1 y O139

26
 27

7. ¿Cuántas de las muestras positivas para V. parahaemolyticus,

obtenidas de ostión de placer de los establecimientos de mariscos de la ciudad
de Culiacán, Sinaloa, corresponden al serotipo pandémico O3:K6?
 HIPÓTESIS

1. La concentración de coliformes fecales presentes en las muestras de

ostión de placer obtenidas de los establecimientos de mariscos de la ciudad de
Culiacán, Sinaloa rebasan los parámetros microbiológicos establecidos por la
NOM-242-SSA1-2009 y la FDA-2011.

2. Las especies de Vibrio: parahaemolyticus, vulnificus y cholerae, se

encuentran en las muestras de ostión de placer obtenidas de los
establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa.

3. La concentración de las especies de Vibrio (parahaemolyticus,

vulnificus y cholerae) presentes en las muestras de ostión de placer obtenidas
de los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa exceden
los parámetros microbiológicos establecidos por la NOM-242-SSA1-2009 y la
FDA-2011.

4. Las cepas de V. cholerae presentes en ostión de placer obtenidos de

los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa, no poseen
los genes (ctx y chx) que le confieren toxicidad.

5. Las cepas de V. parahaemolyticus presentes en ostión de placer

obtenidos de los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán,
Sinaloa, poseen los genes (tdh y trh) que le confieren toxicidad.

6. Las cepas de V. cholerae presentes en ostión de placer obtenidos de

los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa, no
corresponden a los serogrupos (O1 y O139) pandémicos.

28
 29

7. Al menos una de las cepas de V. parahaemolyticus presentes en

ostión de placer obtenidos de los establecimientos de mariscos de la ciudad de
Culiacán, Sinaloa, corresponde al serotipo (O3:K6) pandémico.
 PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN

Durante el período de octubre de 2010 a mayo de 2011, en el Laboratorio

de Microbiología Ambiental y de Alimentos del Centro de Investigación en
Alimentación y Desarrollo, se realizó un estudio exploratorio descriptivo, en el
cual se muestrearon ostiones de placer provenientes de establecimientos de
mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa. Se detectó y cuantificó coliformes
fecales, así como V. parahaemolyticus, V. cholerae y V. vulnificus.

La detección y cuantificación de coliformes fecales se determinó por

conteo en placa. Por otro lado, la detección y cuantificación de las especies de
Vibrio antes mencionadas, se determinó por NMP-PCR.

Se efectúo la detección de especies de Vibrio toxigénicas, en aquellas

especies de Vibrio que presentan los genes tdh y trh, los cuales codifican para
toxinas de V. parahaemolyticus; los genes ctx y chx, que codifican para las
toxinas de V. cholerae, así como la identificación del serotipo O3:K6 de V.
parahaemolyticus, y los serogrupos O1 y O139 de V. cholerae.

30
 OBJETIVOS

Objetivo General

Determinar la presencia y cuantificación de indicadores de contaminación

de fecal así como de especies toxigénicas de Vibrio en ostiones que se
destinan al consumo humano en la ciudad de Culiacán, Sinaloa.

Objetivos Específicos

Determinar, mediante conteo en placa, si los ostiones de placer que se

destinaron al consumo humano de octubre de 2010 a mayo de 2011 en la
ciudad de Culiacán, Sinaloa cumplen con los niveles de coliformes fecales
estipulados por la NOM-242-SSA1-2009 y la FDA.

Identificar, mediante PCR, la presencia de Vibrio cholerae, V.

parahaemolyticus y V. vulnificus en las muestras de ostión de placer obtenidos
de los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa.

Determinar, mediante NMP-PCR, si la concentración de las especies de

Vibrio presentes en las muestras de ostión de placer obtenidos de los
establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa cumplen con
los límites establecidos por la NOM-242-SSA1-2009 y la FDA.

Determinar, por PCR, si las especies de V. cholerae y V.

parahaemolyticus presentes en las muestras de ostión de placer obtenidos de
los establecimientos de mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa poseen
genes de toxicidad ctx, chx y tdh, trh, respectivamente.

31
 32

Determinar, mediante PCR, si las especies de V. parahaemolyticus

pertenecen al serotipo pandémico O3:K6 y si las especies de V. cholerae
pertenecen a los serogrupos pandémicos O1 y O139 en las muestras de ostión
de placer obtenidos de los establecimientos de mariscos de la ciudad de
Culiacán, Sinaloa.
 MATERIALES Y MÉTODOS

La presente investigación se realizó en el Laboratorio de Microbiología

Ambiental y de Alimentos (LMAA), del Centro de Investigación en Alimentación
y Desarrollo de Culiacán, Sinaloa, donde se analizaron 68 muestras de ostión
de placer destinados al consumo humano obtenidas de los establecimientos de
mariscos de la ciudad de Culiacán, Sinaloa durante el periodo de octubre de
2010 a mayo de 2011. El diagrama general muestra la estrategia experimental
que se llevó a cabo (Fig 5).

Estrategia Experimental

Figura 5. Diagrama general de la estrategia experimental empleada en la investigación.

33
 34

Estrategia de Muestreo

La localización de los establecimientos de mariscos de la ciudad de

Culiacán, Sinaloa se identificó mediante una lista proporcionada por el
Departamento de Mercados del H. Ayuntamiento de Culiacán (2010) y se
tomaron muestras de aquellos establecimientos que contaban con la venta de
ostión de placer en su concha, estos establecimientos se identificaron de
manera observacional (Cuadro 2).

La toma de muestra se realizó en tres periodos y se clasificaron como:

Periodo 1, de octubre a diciembre de 2010 (Otoño); Periodo 2, de enero a
marzo de 2011 (Invierno); Periodo 3, de abril a mayo de 2011 (Primavera),
además se registró la temperatura ambiental a la cual estaban expuestos los
ostiones el día del muestreo, las cuales se tomaron al momento del muestreo
de la página de internet Clima CIAD Culiacán.

Las muestras provenían de diferentes localidades costeras, las cuales se

dividieron por regiones: Región 1 (Altata), región 2 (El Castillo, Las Puentes y
Las Arenias), región 3 (El Conchal y Cospita) (Anexo III). Estas localidades se
dieron a conocer por medio de una encuesta que se le realizó a la persona que
expendía los ostiones.
 35

Cuadro 2. Ubicación y coordenadas de los establecimientos de mariscos que

cuentan con la venta de ostión de placer en la ciudad de Culiacán, Sinaloa.
Zona Calle Colonia Latitud Longitud
Norte
Martíres del Río Blanco Infonavit Humaya 24º49’15.80”N 107º25’02.76”
O
Álvaro Obregón y Economistas Tierra Blanca 24º49’45.07”N 107º23’44.80”
O
Jose Ma. Cota y Álvaro Obregón 6 de Enero 24º50’18.89”N 107º23’40.47”
O
Teófilo Álvarez Chapultepec 24º49’26.40”N 107º23’30.18”
O
Centro
Nicolás Bravo Centro 24º48’01.13”N 107º24’07.50”
O
Teófilo Noris Centro 24º48’17.14”N 107º24’05.35”
O
Sepúlveda Jorge Almada 24º48’16.52”N 107º23’11.58”O
Francisco Villa Centro 24º48’15.86”N 107º22’58.16”
O
Vicente Guerrero y Rafael Buelna Centro 24º48’43.59”N 107º23’09.43”
O
Vicente Guerrero y Fco. I. Madero Centro 24º48’17.79”N 107º23’06.70”
O
Cristóbal Colón y Rodolfo Robles Centro 24º48’18.19”N 107º24’07.83”
O
Jorge García Granados Centro 24º48’27.99”N 107º23’17.25”
O
Venustiano Carranza Benito Juárez 24º48’12.25”N 107º22’59.34”
O
Constitución Miguel Alemán 24º47’57.35”N 107º23’32.18”
O
Donato Guerra Jorge Almada 24º48’04.46”N 107º23’58.77”
O
Aguilar Barraza Jorge Almada 24º48’00.78”N 107º23’36.34”
O
Jesús Andrade Centro 24º48’26.56”N 107º23’32.07”
O
Sur
Manuel J. Clouthier Salvador Alvarado 24º47’14.52”N 107º25’23.07”
O
Manuel J. Clouthier Libertad 24º47’01.50”N 107º24’56.39”
O
Virreyes Infonavit Cañadas 24º47’01.03”N 107º24’28.35”
O
Revolución Emiliano Zapata 24º47’25.58”N 107º21’57.49”
 43

O
Este
Francisco I. Madero Guadalupe Victoria 24º48’07.45”N 107º21’37.23”
O
Fco. I. Madero y Ejercito Nacional Miguel Hidalgo 24º48’14.00”N 107º22’29.49”
O
Oeste
Villa Castilla Villas del Río 24º48’27.89”N 107º27’02.86”
O
 37

Toma de Muestra

La toma de muestra consistió en recolectar 12 ostiones de cada sitio de

muestreo, el cual se seleccionó de manera observacional. El primer periodo de
toma de muestra se llevó en 24 puntos seleccionados, los cuales también se
visitaron en el segundo y tercer periodo. Los ostiones se depositaron en bolsas
herméticas en una hielera a 4ºC evitando el contacto directo de los ostiones con
el hielo y se transportaron al Laboratorio de Microbiología Ambiental y de
Alimentos del Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD)
Coordinación Culiacán y se procesaron en un periodo no mayor a 6 horas.

Procesamiento de la Muestra

Para el procedimiento de los análisis microbiológicos y moleculares se

lavó la parte externa de los ostiones con detergente neutro libre de fosfatos al
2% (Hycel, México), se desconcharon con la ayuda de un cuchillo estéril y se
depositó el contenido de los 12 ostiones equivalentes a una muestra (carne y
líquido intervalvar) a un frasco de plástico previamente esterilizado.
Posteriormente se depositaron en vasos estériles para licuadora de 500 mL y se
homogenizaron en una licuadora (Osterizer) por 2 min.

Detección y Cuantificación de Coliformes Fecales

Se llevó a cabo la detección y cuantificación de coliformes fecales en las

muestras de ostión de placer, mediante la técnica de extensión en placa. Del
licuado de los ostiones, se pesaron 25 g del ostión previamente licuado y se
 38

homogenizaron en 225 mL de solución amortiguadora de fosfatos (PBS, siglas

en inglés). Se realizaron diluciones seriadas (1:100, 1:1000 y 1:10000)
utilizando la misma solución amortiguadora.

Cultivo en Placa

De cada una de las diluciones seriadas en PBS, se inoculó un volumen

de 100 L por duplicado, con una varilla de vidrio estéril se extendió sobre la
superficie de placas de agar mFC (BD Difco, USA) por duplicado.
Posteriormente, las cajas se incubaron a 45ºC por 24 h.

Conteo de Coliformes Fecales

Después del periodo de incubación, se realizó el conteo de las colonias

bacterianas, con la ayuda de un cuenta colonias (SOL-BAT Q-20, México). Se
tomaron en cuenta aquellas colonias que crecen de acuerdo a las
especificaciones de morfología de acuerdo con el medio de cultivo, en este
caso, se contaron las colonias de coliformes fecales que presentaron un color
azul intenso, el cual se debe a la sal del ácido rosólico. Los resultados fueron
expresados en UFC g-1 de ostión (Flores et al., 1996; Rampersad et al., 1999;
González et al., 2009).
 39

Detección y Cuantificación de Vibrio por NMP-PCR

Número Más Probable Acoplado a la Reacción en Cadena de la Polimerasa

(NMP-PCR)

La estimación de la concentración de V. parahaemolyticus, V. cholerae y

V. vulnificus en las muestras de ostión se realizó usando el método de Número
Más Probable (NMP) acoplado a la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),
el cual, también se utilizó para determinar el número de muestras positivas para
presencia de las bacterias. Se depositaron 200 g del licuado de ostión en un
recipiente estéril, y se homogenizaron con 200 mL de solución amortiguadora
de fosfatos salino (PBSS, siglas en inglés) (Sigma-aldrich, USA), obteniendo
una dilución 1:1. Se depositaron 20 mL de la dilución 1:1 a 80 mL de PBSS en
un frasco estéril, el cual se agitó vigorosamente (dilución 1:10). Posteriormente,
se realizaron diluciones seriadas a partir de la dilución 1:10 en tubos de cristal
con PBSS (1:100 y 1:1000) (Cook, 1994). Se tomaron alícuotas de 100 L de
cada dilución y se pre-enriquecieron en tres tubos con 9.9 mL de agua
peptonada alcalina (BD Difco, USA) + 2 % de NaCl (Fermont, México) (APW,
siglas en inglés) para cada dilución y se incubó a 35°C por 18h (Miwa et al.,
2003; Bej et al., 1999).

Lisis Celular

De cada dilución en APW, se tomó una alícuota de 1 mL y se centrifugó

en una microcentrifuga (Centrifuge 5415D eppendorf) a 16 000 X g por 5 min,
se eliminó el sobrenadante, se agregaron 500 L de agua nanopura y se agitó
 40

en vórtex (Vortex mixed Fisher scientific). Este proceso de lavado se repitió tres
veces y finalmente se decantó el sobrenadante. Después se agregaron 200 L
de agua nanopura y se agitó en vórtex hasta resuspender la pastilla que
formaban las células bacterianas. La suspensión bacteriana fue colocada a en
un baño de agua a 100 ºC durante 5 min para producir la lisis celular (Miwa et
al, 2003; Suzita et al., 2010).

Identificación de Especie por PCR

Se realizaron pruebas moleculares utilizando secuencias de los

oligonucleótidos usados como iniciadores (Cuadro 3) en PCR, para detectar la
proteína de membrana externa ompW (Nandi et al., 2000), los genes tlh (Bej et
al., 1999) y vvhA (Brauns et al., 1991). Los cuales son marcadores específicos
para determinar la especie de Vibrio.

Condiciones de PCR

Las reacciones de PCR se realizaron con un sistema de detección PCR

Core System I (Promega). Se realizó una mezcla de reacción con un volumen
final de 25 L para cada muestra (Cuadro 4). Se utilizaron los iniciadores del
cuadro 4. Se amplificó el ADN bacteriano en un termociclador (Mastercycler
gradient eppendorf), en el cual se programaron las condiciones específicas para
dicha amplificación. El primer ciclo fue para la activación de la enzima a 94 ºC
por 10 min; para la desnaturalización del ADN la misma temperatura por 1 min;
el siguiente ciclo se hizo por 1 min para el alineamiento de los oligonucleótidos,
la temperatura de alineamiento (Tm) varió según la especie de Vibrio (tlh 58 ºC,
 41

ompW 64 ºC y vvhA 60 ºC); la elongación se produjo a 72 ºC por 2 min. La

extensión final se realizó a 72ºC por 10 min para después estabilizar la reacción
a 4ºC (Cuadro 5) (Nandie et al., 2000; Bej et al., 1999; Brauns et al., 1991).

Electroforesis

Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de

agarosa al 1.2%. Para esto se pesaron 1.2 g de agarosa (Promega, USA), los
cuales se adicionaron a 100 mL de Tris Acetato EDTA (TAE) 1X (Eppendorf,
USA) para después disolverse en un horno de microondas (LG). Se agregaron
2 L de bromuro de etidio, se depositó en un molde y se dejó reposar hasta que
solidificara el gel. Se tomó una alícuota de 10 L de producto de PCR y se
depositaron en los pocillos del gel de agarosa. En uno de los pocillos se utilizó
un marcador de 100 pb (Promega, USA) como estándar de peso molecular.
Finalmente, el gel fue sometido a electroforesis por 40 min a 80 V cm -1 (cámara
de electroforesis Termo EC 230) y los fragmentos amplificados fueron
visualizados en un transiluminador de luz UV (Spectroline). La respuesta
positiva se definió observando una banda de 450 pb para Vibrio
parahaemolyticus, una banda de 588 pb para Vibrio cholerae y una banda de
383 pb para Vibrio vulnificus, las cuales se compararon con el marcador de 100
pb.
 42

Cuadro 3. Iniciadores para genes especie-específico de Vibrio.

Tamaño del fragmento

Nombre Secuencia nuleotídica (5’-3’) Gen blanco Referencia
amplificado (pb)

Vibrio cholerae

ompW-f CACCAAGAAGGTGACTTTATTGTG ompW 588 Nandi et al., 2000

ompW-r GAACTTATAACCACCCGCG

Vibrio parahaemolyticus

tl-f AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG tlh 450 Bej et al., 1999

tl-r GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC

Vibrio vulnificus

vvha-f CTCACTGGGGCAGTGGCT vvhA 383 Brauns et al.,

vvha-r CCAGCCGTTAACCGAACCA 1991
f: Forward (iniciadores sentido)
r: Reverse (iniciadores antisentido)

Cuadro 4. Preparación de la mezcla madre para las reacciones de PCR para la

identificación de especie, toxinas y serotipos de Vibrio.

Concentración
Componente Concentración Inicial Volumen(L)
Final

Agua grado PCR - - 10.38

Buffer GoTaq green 5X 1X 5.0

MgCl2* 25 mMol 2.0

dNTPs** 10 Mm 0.2 mM 0.5

Oligonucleótido Sentido 10 mMol 1 mMol 2.5

Oligonucleótido Antisentido 10 mMol 1 mMol 2.5

GoTaq polimerasa 5 U L-1 0.025 0.12

ADN (lisado bacteriano) 50 ng L-1 2 ng L-1 2.0

 43

Volumen de Reacción 25.0

*Cloruro de Magnesio
**Desoxinucleótidos
 44

Cuadro 5. Condiciones de termociclador para realizar PCR

Gen
Etapa Tlh ompW vvhA Ciclos
ºC Min ºC min ºC min
Desnaturalización 94 1 94 1 94 1 1
Alineación 58 1 64 1 60 1
35
Elongación 72 2 72 2 72 2
Extensión Final 72 10 72 10 72 10 1

Cuadro 6. Cepas de Vibrio utilizadas como controles positivos de los

experimentos de PCR.
Colección de Microorganismos Acuáticos Importantes (CAIM por sus siglas en inglés)
CIAD Mazatlán – Unidad de Acuicultura y Manejo Ambiental
www.ciad.mx/caim

Código Especie Fuente País de origen

CAIM 1400 Vibrio parahaemolyticus Heces de humanos con México

gastroenteritis
CAIM 1406 Vibrio cholerae Sedimento México

CAIM 1407 Vibrio cholerae Clínica México

CAIM 1772 Vibrio parahaemolyticus Camarón (Litopenaeus México

sp.)
CAIM 320 Vibrio parahaemolyticus Pacientes intoxicados Japón
por consumo de sardina
CAIM 610 Vibrio vulnificus Sangre humana EUA

En todas las electroforesis se utilizó como control positivo las cepas

proporcionadas por el Dr. Bruno Gómez Gil Rodríguez Sala, del área de
Bacteriología de CIAD Mazatlán (Cuadro 6) y un blanco (mezcla sin ADN) para
el control negativo. Según los resultados obtenidos por PCR de cada una de las
diluciones se determinó la concentración de V. parahaemolyticus, V. cholerae y
V. vulnificus con la ayuda de la tabla del NMP (Cuadro 7) (Blodgett, 2010).

Cuadro 7. Manual Bacteriológico Analítico (BAM). Apéndice 2. Número Más

Probable de Diluciones en Serie (Blodgett, 2010).
 43

Índice MPN y el 95% límites de confianza para varias combinaciones de tubos positivos en
una serie de tres tubos de dilución utilizando cantidades de inoculo de 0,1, 0,01 y 0,001 g
(ml).
Límite 95% de Confianza
Combinación de Positivos Índice NMP por g (mL)
Inferior Superior
0-0-0 <3.0 --- 9.5
0-0-1 3 0.15 9.6
0-1-0 3 0.15 11
0-1-1 6.1 1.2 18
0-2-0 6.2 1.2 18
0-3-0 9.4 3.6 38
1-0-0 3.6 0.17 18
1-0-1 7.2 1.3 18
1-0-2 11 3.6 38
1-1-0 7.4 1.3 20. 7.4 1.3 20
1-1-1 11. 3.6 38. 11 3.6 38
1-2-0 11. 3.6 42. 11 3.6 42
1-2-1 15. 4.5 42. 15 4.5 42
1-3-0 16. 4.5 42. 16 4.5 42
2-0-0 9.2 1.4 38. 9.2 1.4 38
2-0-1 14. 3.6 42. 14 3.6 42
2-0-2 20. 4.5 42. 20 4.5 42
2-1-0 15. 3.7 42. 15 3.7 42
2-1-1 20. 4.5 42. 20 4.5 42
2-1-2 27. 8.7 94. 27 8.7 94
2-2-0 21. 4.5 42. 21 4.5 42
2-2-1 28. 8.7 94. 28 8.7 94
2-2-2 35. 8.7 94. 35 8.7 94
2-3-0 29. 8.7 94. 29 8.7 94
2-3-1 36. 8.7 94. 36 8.7 94
3-0-0 23. 4.6 94. 23 4.6 94
3-0-1 38. 8.7 110. 38 8.7 110
3-0-2 64. 17. 180. 64 17 180
3-1-0 43. 9.0 180. 43 9 180
3-1-1 75. 17. 200. 75 17 200
3-1-2 120. 37. 420. 120 37 420
3-1-3 160. 40. 420. 160 40 420
3-2-0 93. 18. 420. 93 18 420
3-2-1 150. 37. 420. 150 37 420
3-2-2 210. 40. 430. 210 40 430
3-2-3 290. 90. 1000. 290 90 1000
3-3-0 240. 42. 1000. 240 42 1000
3-3-1 460. 90. 2000. 460 90 2000
3-3-2 1100. 180. 1100 180 4100
3-3-3 >110 >1100 420 -
 46

Determinación de genes de toxicidad de V. parahaemolyticus y V.

cholerae por PCR

Las muestras que resultaron positivas para las especies de V. cholerae y

V. parahaemolyticus se analizaron para detectar los genes ctxA y chx de
toxicidad para Vibrio cholerae (Kobayashi et al., 1990; Purdy et al., 2010) y tdh y
trh para Vibrio parahaemolyticus (Bej et al., 1999). Un resultado positivo para el
gen vvh es definitivo para Vibrio vulnificus.

Para las condiciones que se utilizaron en la PCR, se utilizó una mezcla

de reacción, la cual se realizó como se indicó anteriormente en el Cuadro 2,
solo cambiaron las temperaturas de alineamiento porque se utilizaron diferentes
oligonucleótidos (Cuadro 8), debido a que se tenía un diferente fin. La Tm para
ctxA fue de 64 ºC, mientras que para chx fue de 56 ºC (Cuadro 9).

Serotipificación

La serotipificación de las cepas de Vibrio parahaemolyticus y Vibrio

cholerae toxigénicas se llevó a cabo mediante la técnica de PCR (Myers et al.,
2003; Hoshino et al., 1998).

Se utilizaron las mismas condiciones que en las PCR anteriores, a

excepción de las Tm (Cuadro 3). Para el caso del marco de lectura abierta
ORF8 (V. parahaemolyticus O3:K6) la temperatura de fusión (Tm) fue de 60 ºC,
mientras que para los antígenos O1 (V. cholerae O1) y O139 (V. cholerae O139)
fue de 55ºC en ambos casos (Cuadro 11), los iniciadores que se utilizaron se
describen en el cuadro 10.
 47

Cuadro 8. Iniciadores para genes de toxicidad para V. cholerae y V.

parahaemolyticus.
Tamaño del
Secuencia nucleotídica Gen
Nombre fragmento Referencia
(5’-3’) blanco
amplificado (pb)
Vibrio cholerae
ctxA-f CTCAGACGGGATTTGTTAGGCACG ctxA 301 Kobayashi et
ctxA-r ATCTCTGTAGCCCCTATTACG al., 1990
chxA-f2 TGGTGAAGATTCTCCTGCAA chx 439 Purdy et al.,
chxA-r1 CTTGGAGAAATGGATGCGCTG 2010

Vibrio parahaemolyticus

tdh AAAGCGGATTATGCAGAAGCACTG tdh 269 Bej et al., 1999

tdh GCTACTTTCTAGCATTTTCTCTGC
trh TTGGCTTCGATATTTTCAGTATCT trh 500
trh CATAACAAACATATGCCCATTTCCG
f: forward (iniciadores sentido)
r: reverse (iniciadores antisentido)

Cuadro 9. Condiciones de PCR para detección de genes que codifican para

toxinas.
Gen
Etapa Tdh trh ctxA chx Ciclos
ºC Min ºC min ºC min ºC min
Desnaturalización 94 1 94 1 94 1 94 1 1
Alineación 58 1 58 1 64 1 56 1
35
Elongación 72 2 72 2 72 2 72 2
Extensión Final 72 10 72 10 72 10 72 10 1
 48

Cuadro 10. Iniciadores utilizados para identificar el serotipo O3:K6 de V.

parahaemolyticus y los serogrupos O1 y O139 de V. cholerae.
Tamaño del
Secuencia nuleotídica
Nombre Blanco fragmento Referencia
(5’-3’)
amplificado (pb)
Vibrio cholerae O1
O1f2-1 GTTTCACTGAACAGATGGG ctxA 192
O1r2-2 GGTCATCTGTAAGTACAAC
Hoshino et al.,
Vibrio cholerae O139 1998

O139-f2 AGCCTCTTTATTACGGGTGG cholix 449

O139-r2 GTCAAACCCGATCGTAAAGG

Vibrio parahaemolyticus O3:K6

F-O3MM824 AGGACGCAGTTACGCTTGATG ORF8 369 Mayers et al.,

R-O3MM1192 CTAACGCATTGTCCCTTTGTAG 2003

F y f: Forward (iniciadores sentido)

R y r: Reverse (iniciadores antisentido)

Cuadro 11. Condiciones de PCR para caracterización de serotipo y serogrupo .

Gen
Etapa ORF8 O1 O139 Ciclos
ºC Min ºC min ºC min
Desnaturalización 94 1 94 1 94 1 1
Alineación 60 1 55 1 55 1
35
Elongación 72 2 72 2 72 2
Extensión Final 72 10 72 10 72 10 1
 RESULTADOS

Detección y Cuantificación de Coliformes Fecales

Se evaluó la presencia de coliformes fecales (CF) en un total de 24

muestras de ostión de placer en el primer periodo de muestreo, el cual
comprendió de octubre a diciembre de 2010. Los CF estuvieron presentes en el
29.17% (7/24) (Fig. 6) de las muestras de ostión de placer. La concentración
promedio en este periodo fue de 1.4x10 4 UFC g-1.El valor mínimo fue la
ausencia de CF, mientras que el valor máximo alcanzó hasta 1.5x10 -5 UFC g-1.
En este periodo de muestreo, las concentraciones de todas las muestras de
ostión resultaron por debajo de los límites permisibles establecidos por la FDA y
la NOM-242-SSA1-2009 (Cuadro 12).

Los resultados del segundo periodo, de enero a marzo de 2011, se

encontró la presencia de coliformes fecales en el 45.83% (Fig. 7), es decir, 11
de las 24 muestras de ostión analizadas para este periodo de muestreo. La
concentración media fue de 2.7x103 UFC g-1, oscilando desde la ausencia de
CF hasta una concentración máxima de 2x10 4 UFC g-1 (Cuadro 13). Las
concentraciones obtenidas para este periodo fueron por debajo de los límites
permisibles establecidos por la NOM-242-SSA1-2009 y la FDA.

Periodo 3, de abril a mayo de 2011 (Primavera). Se evaluó la presencia

de CF en un total de 20 muestras de ostión de placer, correspondientes a este
periodo de muestreo. Se encontró la presencia de CF en el 80% (16/20) de las
muestras de ostión de placer (Fig. 8), con una concentración promedio de
2.4x105 UFC g-1 y una concentración máxima de 2.16x10 6 UFC g-1 (Cuadro 12).
En este periodo, dos muestras sobrepasaron los límites permisibles
establecidos por la NOM-242-SSA1-2009 y la FDA de 5x10 5 UFC g-1.

49
 50

Figura. 6. Porcentaje de muestras positivas para coliformes fecales en el periodo 1.

Figura. 7. Porcentaje de muestras positivas para coliformes fecales en el periodo 2.

 51

Figura. 8. Porcentaje de muestras positivas para coliformes fecales en el periodo 3.

Cuadro 12. Concentración de coliformes fecales en ostión de placer.

Min - Max Media Desviación NOM/FDA**

Periodo
(log10*) (log10*) Estándar (log10*) No de muestras
Otoño 0 – 5.18 1.46 2.13 0
Invierno 0 – 4.30 1.62 1.83 0
Primavera 0 – 6.33 3.43 2.01 2
*log10, logaritmo base 10
**Número de muestras que rebasaron los parámetros establecidos por la NOM-242-SSA1-2009
y los establecidos por la FDA.

Detección y Cuantificación de Vibrio parahaemolyticus por NMP-PCR

Una vez realizadas las pruebas de PCR se estableció como positiva a

aquellas muestras que presentaron una banda de aproximadamente 450 pb
(Fig. 9), producto de fragmento esperado para el gen tlh de V. parahaemolyticus
en las muestras de ostión de placer analizadas.
 52

Figura 9. PCR para identificar la especie parahaemolyticus de Vibrio. Electroforesis en

gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio: M- Marcador de tamaño
molecular de 100 pb. CN- Control negativo, reacción sin ADN molde. CP- Control
positivo (CAIM 1400). MP- Muestra de ostión positiva. Presencia de Vibrio
parahaemolyticus en Muestras de Ostión de Placer.

La presencia de V. parahemolyticus se evaluó en un total de 24 muestras

de ostión de placer en el primer periodo de muestreo (Cuadro 13), detectándose
la presencia de este microorganismo en el 45.83% (11/24) de ellas. La
concentración mínima fue <3.0 NMP g-1, mientras que la concentración máxima
fue >1100 NMP g-1. La concentración promedio de V. parahaemolyticus fue de
192 NMP g-1 (Cuadro 14). Cuatro muestras presentaron una concentración
mayor a los 1100 NMP g-1.

Se analizaron 24 muestras de ostión de placer en el segundo periodo de

muestreo, en las que se detectó la presencia de V. parahaemolyticus en el
91.66% (22/24) (Cuadro 13), con una concentración promedio de 431 NMP g-1,
oscilando entre concentraciones <3.0 hasta >1100 NMP g -1 (Cuadro 14). En
este periodo, tres de las muestras mostraron concentraciones mayores a los
1100 NMP g-1.
 53

Se evaluó la presencia de V. parahaemolyticus en un total de 20

muestras de ostión de placer en el tercer periodo, de las cuales en el 100% se
detectó la presencia de tal microorganismo (Cuadro 13). La concentración
media para este periodo fue de 532 NMP g -1, con una concentración mínima de
3 NMP g-1 (Cuadro 14), y una máxima mayor a los 1100 NMP g -1. Este periodo
mostró el mayor número de muestras con concentraciones mayores a los 1100
NMP g-1 con nueve muestras.

Cuadro 13. Presencia de Vibrio parahaemolyticus en ostión de placer.

Número y porcentaje de
Periodo Muestras
muestras positivas (%)
Otoño 24 11 (45.83)
Invierno 24 22 (91.66)
Primavera 20 20 (100)

Cuadro 14 . Concentración de Vibrio parahaemolyticus en ostión de placer.

Min – Max Media Desviación NOM/FDA**

Estación
(NMP g-1)* (NMP g-1) Estándar No de muestras
Otoño <3.0 – >1100 192 414.7 0
Invierno <3.0 - >1100 431 461.3 0
Primavera 3 – >1100 532 531.9 0
*NMP, número más probable.
**Número de muestras que rebasaron los parámetros establecidos por la NOM-242-SSA1-2009
y los establecidos por la FDA.

Detección y Cuantificación de Vibrio cholerae por NMP-PCR

En la detección de Vibrio cholerae por NMP-PCR se procedió a designar

como positiva a una muestra, a aquellas en las que se detectó la presencia de
 54

una banda de aproximadamente 588 pb (Fig. 10), producto de fragmento

esperado para la proteína de membrana externa ompW de V. cholerae.

Figura 10. PCR para identificar la especie cholerae de Vibrio. Electroforesis en gel de
agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio: M- Marcador de tamaño molecular de
100 pb. CN- Control negativo, reacción sin ADN molde. CP- Control positivo (CAIM
1406). MP- Muestra de ostión positiva.

Se analizaron 24 muestras de ostión de placer en el primer periodo de

muestreo. Sin embargo, no se encontró la presencia de V. cholerae en las
muestras.

Se evaluó la presencia de Vibrio cholerae en 24 muestras de ostión de

placer, correspondientes al segundo periodo de muestreo, encontrándose en el
12.5% (3/24) de las muestras. La concentración máxima fue de 7.4 NMP g -1,
mientras que la mínima <3.0 NMP g-1. Se obtuvo una concentración media de
3.2 NMP g-1. Las tres muestras positivas no cumplen con las especificaciones
establecidas tanto por la NOM-242-SSA1-2009, como por la FDA, ya que este
microorganismo debe estar ausente en este tipo de alimento.

Se encontró la presencia de V.cholerae en el 15% (3/ 20) de las muestras

de ostión de placer en el tercer periodo de muestreo. La concentración
promedio en este periodo fue de 5.8 NMP g-1, con una mínima
 55

menor a 3.0 NMP g-1 y una máxima de 35.0 NMP g-1. Todas las muestras que se
detectó la presencia de V. cholerae no cumplieron con lo establecido por la
NOM-242-SSA1-2009 y la FDA. Los resultados se pueden apreciar en los
cuadros 15 y 16.

Cuadro 15. Presencia de Vibrio cholerae en ostión de placer.

Número y porcentaje de
Periodo Muestras
muestras positivas (%)
Otoño 24 0 (0)
Invierno 24 3 (12.5)
Primavera 20 3 (15)

Cuadro 16. Concentración de Vibrio cholerae en ostión de placer.

Min – Max Media Desviación NOM/FDA**

Estación
(NMP g-1)* (NMP g-1) Estándar No de muestras
Otoño <3.0 <3.0 0 0
Invierno <3.0 – 7.4 3.2 0.9 3
Primavera <3.0 – 35 5.8 8.8 3
*NMP, número más probable.
**Número de muestras que rebasaron los parámetros establecidos por la NOM-242-SSA1-2009
y los establecidos por la FDA.

Detección y Cuantificación de Vibrio vulnificus por NMP-PCR

En la detección de V. vulnificus por NMP-PCR se procedió a designar

como positiva a aquellas muestras en las que se detectó la presencia del gen
vvhA, cuando se observó una banda de alrededor de 550 pb (Fig. 11). A pesar
de que la literatura señala que se observaría una banda de 383 pb, se
secuenció una muestra positiva a partir de la purificación del producto de
 56

amplificación de un gel de agarosa al 1%. La secuencia se comparó con

secuencias de Vibrio vulnificus reportadas previamente en la base de datos
NCBI, mostrando asociación con V. vulnificus (Anexo II).

Figura 11. PCR para identificar la especie vulnificus de Vibrio. Electroforesis en gel de
agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio: M- Marcador de tamaño molecular de
100 pb. CN- Control negativo, reacción sin ADN molde. CP- Control positivo (CAIM
610). MP- Muestra de ostión positiva.

Se evaluó la presencia de Vibrio vulnificus en 24 muestras de ostión de

placer en el primer periodo de muestreo, encontrándose en el 12.5% (3/24) de
ellas. La concentración media fue de 3.6 NMP g -1, con una concentración
mínima menor a 3.0 NMP g-1 y una máxima de 15 NMP g -1. Las tres muestras
en las que se detectó la presencia de V. vulnificus no cumplieron con las
 43

normativas (NOM-242-SSA1-2009 y FDA), ya que los moluscos bivalvos deben

de encontrarse libres de este microorganismo.

De las 24 muestras de ostión obtenidas en el segundo periodo de

muestreo, 37.5% (9/24) presentó V. vulnificus, las cuales no cumplieron con las
especificaciones de la NOM-242-SSA1-2009 y la FDA. La concentración
 58

máxima registrada fue de 28.0 NMP g -1, con una concentración promedio de 5.9
NMP g-1.

Se evaluó la presencia de V. vulnificus en 20 muestras de ostión de

placer en el tercer periodo de muestreo, encontrándose en el 50% (10/20), las
cuales no cumplieron los parámetros de la NOM-242-SSA1-2009 y la FDA. La
concentración promedio fue de 67.6 NMP g -1, mientras que la concentración
máxima alcanzó 1100 NMP g-1. Los resultados se pueden observar en los
cuadros 17 y 18.

Cuadro 17. Presencia de Vibrio vulnificus en ostión de placer.

Número y porcentaje de
Periodo Muestras
muestras positivas (%)
Otoño 24 3 (12.5)
Invierno 24 9 (37.5)
Primavera 20 10 (50)

Cuadro 18. Concentración de Vibrio vulnificus en ostión de placer.

Min – Max Media Desviación NOM/FDA**

Estación
(NMP g-1)* (NMP g-1) Estándar No de muestras
Otoño <3.0 – 15.0 3.6 2.5 3
Invierno <3.0 – 28.0 5.9 6.4 9
Primavera <3.0 – 1100 67.6 243.6 10
*NMP, número más probable.
**Número de muestras que rebasaron los parámetros establecidos por la NOM-242-SSA1-2009
y los establecidos por la FDA.
 59

Identificación de Genes que Codifican para Toxinas en Vibrio spp (V.

parahaemolyticus y V. cholerae)

En la detección del gen que codifica para toxina TDH por PCR se
procedió a designar como positiva a una muestra, a aquellas en las que se
detectó la presencia de una banda de aproximadamente 269 pb (Fig. 12),
correspondiente al tamaño esperado para el gen tdh de V. paraharemolyticus en
el 35.08 % de las muestras positivas para V. parahemolyticus (20/57). Además,
se detectó la presencia de una banda de aproximadamente 500 pb (Fig. 13), el
cual corresponde al fragmento de tamaño esperado para el gen trh de V.
paraharemolyticus. Se logró identificar este gen en el 10.52 % (6/57) en las
mismas muestras (Fig. 14). Los resultados obtenidos se muestran en figura 14 ,
donde se observa que en el 7% (4/57) de las muestras de ostión de placer se
detectaron ambos genes de toxicidad.

Figura 12. PCR para identificar el gen tdh, que codifica para la toxina TDH de Vibrio
parahaemolyticus. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de
etidio: M- Marcador de tamaño molecular de 100 pb. CN- Control negativo, reacción sin
ADN molde. CP- Control positivo (CAIM 1400). MP- Muestra de ostión positiva.
 60

Figura 13. PCR para identificar el gen trh, que codifica para la toxina TRH de Vibrio
parahaemolyticus. Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de
etidio: M- Marcador de tamaño molecular de 100 pb. CN- Control negativo, reacción sin
ADN molde. CP- Control positivo (CAIM 1772). MP- Muestra de ostión positiva.

Figura 14. Muestras positivas con los genes tdh y/o trh que codifican para las toxinas
TDH y TRH respectivamente.
 61

Identificación del Serotipo O3:K6 de Vibrio parahaemolyticus

Las muestras en las que se detectó la presencia del gen tdh y negativas
para trh fueron analizadas por PCR para la detección del marco de lectura
abierta ORF8, el cual determina de manera molecular el serotipo Vibrio
parahemolyticus O3:K6. Solamente en una muestra se designó como positiva
ya que se detectó la presencia de una banda de aproximadamente 369 pb (Fig.
15). Esta muestra es correspondiente al periodo 1 (de octubre a diciembre de
2010).

Figura 15. PCR para identificar el serotipo O3:K6 de Vibrio parahaemolyticus.

Electroforesis en gel de agarosa al 1.2% teñido con bromuro de etidio: M- Marcador de
tamaño molecular de 100 pb. CN- Control negativo, reacción sin ADN molde. CP-
Control positivo (CAIM 1400). MP- Muestra de ostión positiva.
 DISCUSIÓN

En el presente estudio se determinó la presencia y concentración de

coliformes fecales, V. parahaemolyticus, V. cholerae, V. vulnificus, así como la
identificación de genes codificadores de toxinas y serotipo y serogupos
específicos de las especies de Vibrio en muestras crudas de ostión de placer.

El mayor número de muestras positivas para coliformes fecales se dió en

el tercer periodo de muestreo (primavera), el cual comprendió los meses de
abril y mayo de 2011. Solamente dos muestras que resultaron positivas para CF
rebasaron los límites permitidos por la FDA y la NOM-242-SSA1-2009 en el
tercer periodo, aunque solo el 2.9% de las muestras no cumplieron con los
límites permisibles, es necesario entender que el consumo de ostiones puede
representar un riesgo a la salud de las personas que gustan de consumirlos
crudos (González et al., 2009). El bajo número de muestras de ostión que
sobrepasaron los límites permisibles de coliformes fecales tanto de la FDA
como de la NOM es muy notorio durante los tres periodos de muestreo, ya que
estos se realizaron en época de sequía, por lo que Becerra-Tapia y Botello
(1995) mencionan que en épocas secas y con temperaturas altas es probable
una mayor evaporación del mar, lo que provoca que los coliformes fecales no
puedan permanecer por mucho tiempo en él ni en los organismos que en el
habitan, además, señalan que en época de lluvias se presenta una mayor
concentración de coliformes fecales en el mar así como en los organismos que
en el habitan. Esto concuerda con Hernández-Morga et al. (2008), donde
reportan que las aguas del sistema lagunar costero Huizache-Caimanero
(Sinaloa) destinadas para el cultivo de mariscos, excedían los límites
permisibles para coliformes fecales en época lluviosa, mientras que en época
seca el nivel de indicadores estuvo por debajo de los límites permisibles.

62
 63

Es probable que las muestras hayan resultado positivas debido a que los
ostiones se estén cosechando en aguas con una probable contaminación fecal.
Posiblemente se deba a que los ostiones provenían de zonas costeras
cercanas a poblaciones urbanas y rurales, así como a las bocas de los ríos
Culiacán y San Lorenzo. Anteriormente, Chaidez-Fernández (2006) reportó que
la Bahía de Altata recibe aportaciones de aguas residuales vertidas por 15
drenes, además es cuerpo receptor del río Culiacán, que fluye hacia el interior
de la bahía adoptando características estuarinas, esta zona también recibe
aguas de desecho de uso doméstico de la población y se encuentra cercana a
un área con actividad restaurantera y embarcaciones. Esta reportado que una
de las rutas de entrada de microorganismos patógenos de heces humanas y
animales en aguas costeras, es la descarga de desechos a los ríos y la
subsecuente descarga a éstos a los estuarios y por último a las zonas costeras,
otra ruta es la descarga directa en las zonas costeras de aguas residuales
tratadas o parcialmente tratadas y la descarga de agua de desecho de áreas
urbanas o rurales (González et al., 2009).

Los resultados reflejaron la presencia de V. parahaemolyticus, V.

cholerae y V. vulnificus en ostiones listos para su consumo. En nuestros
resultados se observó un aumento en la presencia de estas especies de Vibrio
conforme aumentaba la temperatura ambiental a la cual estaban expuestos los
ostiones en los establecimientos de mariscos donde se expendían. Estos
microorganismos, habitan de forma natural en aguas marinas cálidas y
encuentra las condiciones ideales para su proliferación en los ecosistemas
marinos y en que en el habitan como los ostiones, que concentran
microorganismos al filtrar agua (Luan et al., 2008).

La presencia de V. parahaemolyticus y V. vulnificus se detectó en el

77.9% y el 32% de las muestras de ostión de placer respectivamente. Algunas
muestras alcanzaron concentraciones por encima de los 1100 NMP g-1. Esto se
 64

pudo deber a que los ostiones se contaminan en el mar de donde son extraídos,
sin embargo, el mal almacenamiento al que se someten los ostiones
exponiéndolos a temperaturas de almacenamiento arriba de los 30 ºC pudiera
dar las condiciones favorables para la proliferación de la bacteria dentro del
ostión. Gooch et al. (2002), demostraron que las poblaciones de V.
parahaemolyticus pueden aumentar de 50 a 700 veces más en ostiones sin
refrigerar expuestos a temperaturas mayores a los 26 ºC. En el primer periodo
(Otoño) se registraron temperaturas ambientales en un rango de 29 a 34ºC, en
el segundo periodo (Invierno) de 32 a 33ºC y en el tercer periodo (Primavera)
de 32 a 35ºC. Franco-Monsreal et al. (2003) reportaron la presencia de V.
vulnificus en el 29.49% (23 de 78) de muestras de alimentos marinos crudos
(ostión, camarón, calamar entre otros) de marisquerías de la ciudad de
Chetumal, Quintana Roo, y señalan que la probabilidad de aislamiento de este
microorganismo es mayor cuando el alimento no ha sido expuesto a la acción
del calor, es decir, que se encuentren en crudo. Pasa de la misma manera para
V. vulnificus, ya que se multiplica rápido cuando los ostiones se encuentran a
temperaturas de almacenamiento ambiental. Cook (1994) sugiere que existe la
necesidad de refrigerar los ostiones inmediatamente después de la cosecha
para así evitar el aumento en el número de V. vulnificus.

En algunas muestras de ostión que se designaron como positivas para V.

parahemolyticus, se detectó la presencia de los genes que codifican para
toxinas (tdh y trh) en el 35.08% y 10.52% de las muestras, respectivamente.
Estos resultados demuestran que es posible que algunas de las muestras son
potencialmente patógenas para el ser humano, pudiendo llegar a ser un
problema para la salud de quien gusta de consumirlos en forma cruda. Es
importante mencionar que las normativas establecidas (NOM-242-SSA1-2009 y
FDA) utilizan la concentración total de V. parahaemolyticus indiferenciado como
indicador de control de la contaminación de alimentos, en lugar de V.
parahaemolyticus virulento, con el objetivo de prevenir infecciones, ya que
 65

algunos alimentos, como los mariscos, con solo un pequeño número de

organismos de V. parahaemolyticus se puede llegar a una dosis infecciosa en
tan sólo unas pocas horas (Luan et al., 2008).

La presencia de ORF8 fue encontrada en una de las muestras de ostión

de placer, el cual es un patrón para la identificación del serotipo pandémico V.
parahaemolyticus O3:K6. Esto marca que probablemente esta cepa ha viajado
por las costas, posiblemente del sur del estado de Sinaloa, donde anteriormente
Cabanillas-Beltrán et al. (2006) reportaron la presencia de una cepa de V.
parahaemolyticus O3:K6, la cual fue indistinguible a una cepa de referencia
aislada en Texas, EUA por DePaola et al. (2000). La cepa pandémica O3:K6 se
reportó por primera vez en 1996 en Calculta, India, sin embargo, se han
encontrado cepas indistinguibles alrededor del mundo en años recientes
(DePaola et al., 2000; Wong et al., 2003). Se han propuesto diferentes hipótesis
acerca de la diseminación de V. parahaemolyticus O3:K6 en diferentes países.
Gavilán y Martínez-Urtaza (2011) proponen que la aparición de este serotipo en
América se deba a que las aguas transportadas por el fenómeno climatológico
de “El Niño”, habrían sido las responsables del transporte desde Asia, y que la
diseminación de este patógeno estaría relacionada con el transporte del
zooplancton por las aguas de “El Niño”. El zooplancton le proporcionaría a los
vibrios, una plataforma para desplazarse por el océano, además de ser una
fuente de nutrientes para Vibrio durante el viaje.

La presencia de V. cholerae se detectó en el 8.8% de las muestras de

ostión de placer. Aunque no se detectaron los genes que codifican para la
toxina colérica y la toxina cholix, es importante reportar la presencia de esta
especie de Vibrio ya que pueden existir otros factores de virulencia como
algunas hemolisinas y hemaglutininas (Fernández & Alonso, 2009). Como se ha
mencionado anteriormente, V. cholera es un microorganismo autóctono de los
ambientes acuáticos, y se encuentra fuertemente asociada con el plancton, por
 66

lo que es posible que los ostiones concentren V. cholerae ya que se alimenta de

plancton (fitoplancton y zooplancton) a través de un sistema de filtración (De
Magny & Colwell, 2009).

Es posible que la presencia como la concentración de V. cholerae sea

menor que las otras dos especies de Vibrio debido a las condiciones tanto
climatológicas como nutrimentales a las que se encuentra sometido en nuestras
costas. Aunque no se tomaron en cuenta en este estudio, algunos factores
como el pH, la radiación solar, salinidad, pudieron no estar en las condiciones
adecuadas para la proliferación de V. cholerae (Lipp et al., 2002).

Según lo publicado por CENAVECE (2011), en los últimos años se ha

reportado la ausencia de V. cholerae en nuestro país. De la Rosa et al. (1995)
reportaron la presencia de V. cholerae no O1 en el 50% (5 de 10) y ausencia de
V. cholerae O1 en muestras de pescado frescado del mercado de la Viga en
México D.F., señalan que V. cholerae no O1 se encuentra con frecuencia en e
agua de los estuarios, así como en pescados y mariscos, más que el serogrupo
O1. Thompson et al. (2004) sugieren que las infecciones por V. cholerae se
encuentran relacionadas con países en vías de desarrollo como resultado de un
deficiente suministro y saneamiento del agua. Esto nos hace pensar que en
nuestro país es posible que tanto el suministro como el saneamiento del agua
son eficientes para evitar infecciones por este microorganismo. En todos los
muestreos se encontraron muestras con la presencia de V. parahaemolyticus,
V. cholerae y V. vulnificus. La concentración inicial de estas especies de Vibrio,
cuando los ostiones se encuentran dentro del mar puede representar un
problema de salud para quien los consume, sin embargo, existe la posibilidad
de que esta carga aumente debido al manejo que reciben los ostiones después
de su extracción. Los comerciantes de este tipo de alimento acostumbran no
someter el producto a condiciones de refrigeración, manteniéndolos al aire libre,
a una temperatura ambiente, lo que favorece el incremento en la concentración
 67

de estos microorganismos. Es por esto que se recomienda que los mariscos de

cualquier tipo, deben almacenarse a temperaturas de refrigeración
inmediatamente después de su extracción o captura, ya que a estas
temperaturas se suprime la reproducción de las especies de Vibrio y así evitar
posibles infecciones. Es recomendable evitar el consumo de pescados y
mariscos en su forma cruda. Además, la mayoría de los establecimientos de
mariscos no cuentan con almacenamiento adecuado de los ostiones. Es
necesario alertar a la SSA y COFEPRIS, organismos responsables de
implementar medidas de prevención adecuadas.
 CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos indican la presencia de coliformes fecales en

las muestras de ostión de placer de establecimientos de mariscos en Culiacán y
su concentración media fue 10.3x103 UFC g-1.

Los resultados demuestran la presencia de las tres principales especies

de Vibrio (Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae y Vibrio vulnificus) en
muestras de ostión de placer.

La especie de Vibrio que presentó mayor concentración fue V.

parahaemolyticus de 5 a >1100 NMP g -1, seguido por V. vulnificus osciló entre 3
y 1100 NMP g-1 y finalmente, V. cholerae con un rango de concentración de 3 a
7.4 NMP g-1.

Los resultados demuestran la presencia de los genes toxigénicos tdh y

trh de V. parahemolyticus en los ostiones, sin embargo, no se detectaron
aquellos que codifican para las toxinas de V. cholerae.

La presencia del marco de lectura abierta ORF8 en una de las muestras

nos indicó que correspondía al serogrupo de V. parahaemolyticus O3:K6. No
fue posible detectar los serogrupos de V. cholerae.

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ANEXO I

Preparación de Medios y Soluciones

Preparación de Medios de Cultivo

 Agar TCBS (Bioxon, México)

Suspender 88 g de polvo en 1 L de agua destilada, calentar con agitación hasta

disolver. No requiere esterilización.

 Agar mFC (BD Difco, EUA)

Suspender 52 g del polvo en 1 L de agua destilada, calentar con agitación

frecuente y hervir durante 1 min. Agregar 10 mL de una solución al 1% de
Ácido Rosólico en 0.2 N NaOH. Calentar durante 10 min. No requiere
esterilización.

 Agua Peptonada Alcalina (BD Difco, EUA; Fermont, México)

Suspender 10 g del polvo en 1 L de agua destilada, añadir 10 g de NaCl.

Mezclar y esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 min. Preparación de
Soluciones
 89

Preparación de Soluciones

 Solución Amortiguadora de Fosfatos

Suspender 34 g de Fosfato dibásico de Potasio (Sigma-Aldrich, EUA) en 500

mL de agua destilada. Se ajusta el pH a 7.2 de solución concentrada con NaOH
1 N (Faga-Lab, México), esterilizar. Se toma 1.25 mL de la solución y aforar a 1
L con agua destilada estéril.

 Solución Amortiguadora de Fosfatos Alcalina

Suspender 0.724 g de Fosfato dibásico de Sodio (Sigma-Aldrich, EUA), 0.21 g

de Fosfato monobásico de Potasio (Sigma-Aldrich, EUA) y 7.65 g de Cloruro de
Sodio (Fermont, México) en 1 L de agua destilada, agitar hasta disolver y
ajustar el pH a 7.2 con una solución de NaOH 1 N (Faga-Lab, México),
esterilizar en autoclave a 121 ºC durante 15 min.

Preparación de Soluciones para la Electroforesis de ADN

 Tris-acetato-EDTA (TAE 10X)

Aforar 100 mL de TAE 10 X (Promega, EUA) en un volumen de 1 L de agua

destilada.

 Gel de Agarosa 1.2%

Agregar 0.36 g de agarosa (Promega, EUA) a 30 mL de solución TAE 1X.

Fundir la solución en un horno de microondas y añadir 1 L de bromuro de
etidio (10mg/mL). Dejar solidificar.
 90

Contenido de los Estuches Comerciales

PCR Core System I (Promega, USA)

Componente Cantidad

Taq AND Polimerasa 250 u

Solución Amortiguadora 5X, libre de Mg 1 mL
Solución 25 mM, MgCl2 1.2 mL
Mezcla de Nucleótidos para PCR, 10 mM 200 L
Protocolo 1
 ANEXO II

Análisis de Secuencia Nucleotídica

Secuenciación de ADN Vibrio vulnificus

Secuencia Nucleotídica del Fragmento de 550 pb del Gen vvhA.

47_vvha-r sequence exported from 47_vvha-r_F12.ab1

GCAGAGATCGTTGTTGCTGAGTGATTGGAGGGTAACGTGTGCTTCG
GCTTCAAACGGGGGATGATTCCAGTCTGTGCGAATACGTTGTTTCACGGTA
CTGCTGTTGGTTGACGAGCCCGCAGAACCATAAACTGAGAAGAGTGCTGAA
GGGATTACCGTACCAAAGCGTGCACGATAGTTGAGTTTCACGCCCATCTCG
AAATCCGTTACGCCGGTTTCAGACACAGGCGCTTCGTACAAAACGTCATAGT
TCGGTTTGAAGTTGGAATAAGAGATTGGGTTGAACTTCGTCTTATCAAATAC
CCAGCCACTGCCCCAGTGAGCGGCGTGAAATAGCATCCAAGCTCTTGGCG
GCGCAGTTCATCACACTCACCAAACTCACGCTCGAATGAAATATCAAAATCA
CTCAGTGATGAGCGGTTGTTGATGCGATAGTCTTTTGTATCAAACACCAAGG
TTTTCGAGTAGTTGTAAGTAAATGAGCCACTGCCCCAGTGAACGGCGGTGA
AATAACATCCAAGCTCTTGGCGGCGCAGTTCATCACACTCACCAAACTCAC
GCTCGAATGAAATATCAAAACCACTCA

91
 92

Homología de la Secuencia Nucleotídica del gen vvhA con el gen que Codifica
para la Citolisina del Fragmento de 1353 pb de V. vulnificus
Vibrio Vulnificus Cytolysin Gene, Partial cds

GenBank: FJ222405.1

LOCUS:FJ222405
SIZE: 1353 bp
DNA: linear BCT 11-OCT-2008
DEFINITION: Vibrio vulnificus cytolysin gene, partial cds.
ACCESSION: FJ222405
VERSION: FJ222405.1 GI:208611726
REFERENCE:1 (bases 1 to 1353)
AUTHORS :Li,Y.T. and Liu,Z.S.
TITLE :Construction and expression of the poly-recombinant fusion toxin
gene of food poisoning Vibrio.
JOURNAL Unpublished
REFERENCE 2 (bases 1 to 1353)
AUTHORS Li,Y.T., Liu,Z.S. and Li,X.T.
TITLE Direct Submission
JOURNAL Submitted (17-SEP-2008) Key Laboratory of Zoonosis, Jilin
University, Xian Road, 5333, Changchun, Jilin 86, China
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/208611726?
report=genbank&log$=nucltop&blast_rank=2&RID=3VBJ5683016
 ANEXO III

Regiones de Origen de las Muestras de Ostión Analizadas

Región 1 – Altata

Región 2 – El Castillo, Las Puentes, Las Arenitas

Región 3 – El Conchal, Cospita

93