Sexto ejercicio problema.

Bioquímica, 23 de mayo de 2018

Universidad Nacional de Colombia, Bogotá D.C
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Daniel José Duarte, Helman Felipe Martínez, Yuly Susana Mesa,, Leyder Yesid Serna, y David
Fernando Yepes
djduarteb@unal.edu.co ; hefmartinezmo@unal.edu.co ; ysmesam@unal.edu.co;
lysernag@unal.edu.co; dafyepesri@unal.edu.co.

Primer punto

Es bastante particular el hecho que una bacteria neutrofílica sea capaz de crecer a valores de pH bajos,
el Helicobacter pylori es único, con respecto a su tolerancia al ácido y la persistencia a largo plazo en
el estómago humano. Mecanismos que permiten al H. pylori para hacer frente a condiciones
frecuentes de pH deben ser esenciales, especialmente durante la infección primaria, con el fin de
superar la barrera de ácido gástrico (6). Dentro de las proteínas importantes que permiten que esta
bacteria sobreviva ​se encuentra la ureasa, que transforma la urea en amoniaco y agua, alcalinizando
así el medio ácido circundante; también se encuentran lipasas, adhesinas, factor activador plaquetario,
la proteína Cag A, Pic B (que induce a citocinas) y la proteína vacuolizante Vac A. (7).

Figura 1.​ Estructura de la Ureasa presente en H. Pylori

Existen muchas controversias acerca del mecanismo por el cual la ureasa ayuda a la supervivencia de
la bacteria. Originalmente, se asumió que la actividad enzimática es intracitoplasmática ya que la
protección en el estómago se produce debido a la creación de una nube de amoniaco alrededor de las
células. Esta hipótesis, en que la actividad externa de la ureasa protege al H. pylori del estrés ácido,
fue recientemente reconsiderado, basado en la observación de una solución no agitada para la cual la
ureasa estaba presente, se exhibió alguna actividad residual a pH 3. (4) Sin embargo, se ha demostrado
que la ureasa citoplasmática y que el transportador (UreI) influye en la actividad de la ureasa por la
mediación de la absorción de urea-ácido. la hipótesis consiste en que el amoniaco producto de la
reacción de la ureasa sale del citoplasma en su forma neutral y neutraliza el pH periplásmico por
protones de unión en ese entorno transformándose en amonio. Este proceso se produce porque todos
los procariotas, incluyendo acidófilos, poseen una membrana citoplasmática con cierta permeabilidad
para los protones (3).
Además de esta protección, el Helicobacter pylori logra sobrepasar la barrera de moco que el
estómago posee para protegerse de la propia acidez, adhiriéndose al moco, área debajo de la mucosa,
donde la acidez es mucho menos intensa. Por lo tanto, además de producir sustancias contra la acidez,
el H. pylori logra penetrar el estómago hasta partes donde el ambiente es menos agresivo (1).
A continuación se presenta las características de la proteína asignadas a una secuencia, a partir de esta
se podrá discutir sobre qué aminoácidos presentes pueden influir en el mecanismo descrito
anteriormente.

Figura 2.​ Secuencia de aminoácidos de la proteína Ureasa presente en H. Pylori. Tomado de:
https://www.rcsb.org/pdb/protein/P69996#

La barra de color verde indica un fragmento de esta proteína en términos de sus aminoácidos, se
aprecia abundancia de ácido glutámico E y ácido aspártico D sus puntos isoeléctricos son 2,77 y 2,88
respectivamente esto indica que al pH fisiológico estos estarán cargados negativamente dado que sus
puntos isoeléctricos son inferiores al pH, de igual forma todo el conjunto de aminoácidos descritos en
la figura 1, asignan un punto isoeléctrico de 5,0 a la proteína, esta tendrá entonces una carga negativa,
pues el PI es inferior al pH de esta manera hidroliza la urea presente en el estómago en amonio y
dióxido de carbono y a la vez el amonio producido aumenta el pH, elevándolo hasta 6 o 7 en su
entorno y neutralizando el ácido (3).
Datos importantes de la sobrevivencia de H. Pylori; se mantiene en un pH entre 4.0 y 8.0 , su síntesis
proteica a pH entre 6,0 y 8,0 y no se multiplica en pH entre 4,0 y 6,0, y de esta manera, no sería
susceptible a antibióticos como claritromicina o amoxicilina, que para ejercer su efecto, necesitan que
la bacteria se replique.

Segundo punto
La ureasa es la enzima más abundante producida por H. pylori y su actividad depende del pH
alrededor de la bacteria. El hábitat natural de H. pylori se encuentra por debajo de la capa mucosa,
donde el pH se aproxima a la neutralidad.

Figura 3.​ reacción catalizada por la ureasa.

Su EC es ​ ​3.5.1.5​ donde :

● El primer número define que tipo de reacción cataliza la enzima; en este caso, el número 3 se
refiere a que esta forma dos moléculas a partir de un sustrato por medio de la hidrólisis
(utiliza el agua para catalizar la reacción).
● El segundo número, da información acerca de en qué enlace actúa la enzima, en este caso al
ser 5, aquellas ​hidrolasas que actúan hidrolizando enlaces ​carbono​-​nitrógeno diferentes a los
enlaces peptídicos​.
● El tercer número da cuenta sobre qué tipo de molécula actúa, al ser este 1, nos dice que la
enzima actúa sobre enlaces amida lineales.
● El cuarto número dice sobre qué molécula actúa, en este caso al ser 5, nos dice que actúa
sobre la úrea.

El mecanismo que utiliza la bacteria para protegerse de pHs ácidos durante la colonización se basa en
acumular una gran cantidad de ureasa en el citoplasma. La ureasa como vimos anteriormente, es una
metaloenzima que hidroliza la urea presente en el estómago en amonio y dióxido de carbono,
(necesitando de iones de níquel Ni​2+​ para su acción).

Figura 4.​ Formación del cloruro de amonio.

El amonio producido aumenta el pH, llevándolo hasta 6 o 7 en su entorno y neutralizando el ácido

clorhídrico del estómago, lo que ocasiona de manera transitoria aclorhidria​. De este modo puede
alcanzar la superficie de las células de la mucosa propiciando un microambiente que le permite
sobrevivir mientras se mueve para llegar al epitelio gástrico​. De cualquier manera la bacteria trata de
minimizar el tiempo de exposición al medio ácido del lumen estomacal; gracias a la motilidad que le
brindan sus flagelos, nada a través del viscoso mucus hasta alcanzar el ambiente casi neutro cercano al
epitelio gástrico que es rico en nutrientes.

La ureasa se regula puesto que un aumento excesivo de la alcalinidad debida al NH​4​+ producido,
mataría a la bacteria. La regulación se produce mediante un transportador dependiente de pH. El
transportador UreI permite la entrada de urea pero una vez que el pH alcanza el valor de 6-7, se
inactiva. El NH​4​+ liberado va a producir una serie de daños que afectan a la microcirculación y a las
células epiteliales superficiales. Origina una necrotización del tejido profundo; colabora en el
desarrollo de gastritis atrófica crónica humana y facilita el incremento de infecciones virales y la
carcinogénesis.

Tercer punto

3- a) ​H. pylori tiene la habilidad de resistir pHs ácidos debido a que es capaz de establecer un
potencial de membrana positivo. El cambio en la polaridad de la membrana provee una barrera
eléctrica que previene la entrada de protones (H​+​). El interior positivo de la célula es creado por la
activa extrusión de aniones o por difusión del potencial de protones.

3- b) La difusión del potencial de protones requiere que la permeabilidad de aniones en la membrana

citoplasmática sea bajo y aunque se han identificado tres transportadores de aniones es necesario
determinar si la conductancia de estos está asociada con otras proteínas. También se ha sugerido que
el transporte de protones puede estar mediado por ATPasas tipo P que podrían mediar la
supervivencia en condiciones ácidas por extrusión de protones del citoplasma. Esta idea no es
soportada por los genes de los transportadores identificados ya que las secuencias de ATPasas tipo P
del microorganismo se relacionan más con transportadores de cationes divalentes que con ATPasas
específicas por protones o cationes monovalentes. Adicionalmente, en respuesta al estrés generado por
el pH ácido H. pylori puede inducir la expresión de algunos genes que codifican para ciertos factores
de virulencia, proteínas externas de membrana y proteínas sensoras y reguladoras de respuesta.

Cuarto punto

4- b) Tomando en cuenta el diagrama de integración metabólica presentado en el punto anterior, y

comparándolo con el del ser humano, podemos ver que una de las grandes diferencias a nivel
metabólico del H. Pylori es la conversión de piruvato a acetil-CoA por medio de la enzima piruvato
ferrodoxin-oxidorreductasa, proceso que en humanos se lleva a cabo por la enzima piruvato
deshidrogenasa. Tomando lo anterior en cuenta, este se podría tomar como un punto de inhibición del
crecimiento bacteriano sin afectar el metabolismo del huésped. El acetil-CoA es un importante
intermediario metabólico, por lo que la ausencia de este interrumpiría el crecimiento de la batería. Es
importante mencionar, que, aunque bien el piruvato es la fuente principal de acetil-CoA, también
existen otros mecanismos biosintéticos para la obtención del mismo, tal es el caso de los aminoácidos
Ile, Leu, Thr y Trp, que, aunque bien pueden ser materiales de partida para la síntesis de este
importante intermediario metabólico, la obtención de este necesitaría la degradación de proteínas por
parte de la bacteria. Con el fin de lograr inhibir el crecimiento de esta bacteria, es indispensable
encontrar antibióticos que inhiban la enzima piruvato ferrodoxin-oxidorreductasa. En la literatura se
han presentado varias pruebas que muestran que el antiparasitario Nitaxozanida, tiene un mecanismo
de inhibición competitivo con la enzima, estas investigaciones además sugieren que, este puede ser un
fármaco que puede ser muy útil, no solo por el hecho de que interviene en el metabolismo de una gran
variedad de microorganismos anaeróbicos, sino también porque hasta el momento no se han
identificado resistencia por parte del H. pylori.

4 - a)

Figura 4.​ Diagrama que integra las rutas metabólicas en el ciclo de la bacteria.

Referentes Bibliográficos.
Primer punto

1. Bayona-Rojas, Gutiérrez-Escobar (2013). BIOPELÍCULA: UN MECANISMO DE

SUPERVIVENCIA DE ​Helicobacter pylori. Revista UDCA actualidad y divulgación
cientifica.​http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-422620130002
00007
2. Fig 1. Secuencia de aminoácidos de la proteína-enzima Ureasa. ENZYME DATABASE
BRENDA.​https://www.brenda-enzymes.org/ecexplorer.php?browser=1&browser=1&f[nodes
]=170,231&f[action]=open&f[change]=213&ec_id=3050#3050
3. McGowan, C. C., T. L. Cover, and M. J. Blaser. 1996. Helicobacter pylori and gastric acid:
biological and therapeutic implications. Gastroenterology 110: 926–938.
4. Meyer-Rosberg, K., D. R. Scott, D. Rex, K. Melchers, and G. Sachs. 1996. The effect of
environmental pH on the proton motive force of Helicobacter pylori. Gastroenterology
111:886–900.
5. Otero Regino, MD, Trespalacios, MSc, Otero ( 2009).Helicobacter pylori: Tratamiento
actual Un importante reto en gastroenterología. Revista de
gastroenterologia.​http://gastrocol.com/file/Revista/v24n3a10.pdf
6. Rottenberg, H. 1979. The measurement of membrane potential and delta pH in cells,
organelles, and vesicles. Methods Enzymol. 55:547–569.
7. Scott, D. R., D. Weeks, C. Hong, S. Postius, K. Melchers, and G. Sachs. 1998. The role of
internal urease in acid resistance of Helicobacter pylori. Gastro- enterology 114:58–70.
8. Ha,N.C.,S.T.Oh,J.Y.Sung,K.A.Cha,M.H.Lee,andB.H.Oh.2001. Supramolecular assembly and
acid resistance of Helicobacter pylori urease.Nat. Struct. Biol. 8:505–509.

Segundo punto

9. ENZYME DATABASE BRENDA. Urease enzyme.< ​https://www.brenda-enzymes.org/ >.[en

línea]. citado el 22 de mayo de 2018.
10. UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID. Estudio molecular de los factores de
virulencia y de la resistencia a claritromicina en la infección por Helicobacter pylori.
<​http://eprints.ucm.es/11520/1/T32212.pdf​ >.[en línea]. citado el 22 de mayo de 2018.

Tercer punto

11. PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA. Prevalencia de los genotipos de virulencia de

Helicobacter pylori cagA, vacA, babA2 e iceA en pacientes colombianos con dispepsia
funcional.<​https://www.researchgate.net/profile/Azucena_Arevalo_G/publication/49175653_
Prevalencia_de_los_genotipos_de_virulencia_de_Helicobacter_pylori_cagA_vacA_babA2_e
_iceA_en_pacientes_colombianos_con_dispepsia_funcional/links/580ee80408aef766ef10eb0f
/Prevalencia-de-los-genotipos-de-virulencia-de-Helicobacter-pylori-cagA-vacA-babA2-e-ice
A-en-pacientes-colombianos-con-dispepsia-funcional.pdf​>.[en línea]. citado el 22 de mayo de
2018.

Cuarto punto
12. ESSENTIAL BIOCHEMISTRY PRATT- CORNELY. THIRD EDITION.
<​https://trixiesolis.files.wordpress.com/2015/02/essential-biochemistry-third-edition-charlotte
-w-pratt.pdf​ >​.[en línea]. citado el 22 de mayo de 2018.
13. Drs. DiRusso, Wilson and Markham .BIOC431/831 Exam 4. citado el 22 de mayo de 2018.
14. Hoffman, P. S., Sisson, G., Croxen, M. A., Welch, K., Harman, W. D., Cremades, N., &
Morash, M. G. (2007). Antiparasitic Drug Nitazoxanide Inhibits the Pyruvate
Oxidoreductases of Helicobacter pylori, Selected Anaerobic Bacteria and Parasites, and
Campylobacter jejuni. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 51(3), 868-876.