U.N.M.S.M.

FQeIngQuímica Toxicología de Alimentos

Prácticas de Laboratorio N° 04
BIOTOXINAS MARINAS Y DETERMINACIÓN DE NITRÓGENO VOLÁTIL

1. OBJETIVOS

 Extraer biotoxinas marinas y realizar su determinación por el bioensayo

del ratón.
• Toxina paralítica de los mariscos (VPM)
• Toxina diarreica de los mariscos (VDM)
• Toxina neurotóxica de los mariscos (VNM)
• Toxina amnésica de los mariscos (VAM)
• Tetrodotoxina (*)
• Ciguatera (*)

 Determinar el estado de conservación de un producto marino mediante el

ensayo de determinación del Nitrógeno Básico Volátil (N.B.V)

2. INTRODUCCIÓN

DETERMINACION DE LAS TOXINAS

En algunos países, la vigilancia de las aguas permite dar el primer aviso de

mariscos potencialmente tóxicos. Esto se consigue mediante la observación
directa del color del agua (“marea roja”), examen microscópico del fitoplancton
para identificar las especies sospechosas e incluso monitoreo de manchas
marinas con tecnología satelital.

Desde el punto de la salud pública, la clave de la determinación es la

concentración de toxinas en los pescados o en los mariscos. Esto requiere el
muestreo y el análisis de animales indicadores o de animales
representativos. Los mejillones (“choros”) son con frecuencia los animales
indicadores de elección ya que manifiestan una captación de toxinas más rápida,
pero se puede analizar otro marisco por razón de su importancia comercial o por
la especificidad de la toxina implicada.

La prueba más universal es el bioensayo del ratón y en la mayoría de los casos

es la única prueba legalmente admisible para la suspensión de la captura. En los
últimos años, los análisis químicos han adquirido una gran aceptación porque
son más rápidos, más exactos y, desde el punto de vista social, menos
censurables que las pruebas con animales.

Los métodos específicos de análisis de la toxina paralizante y neurotóxica, se

encuentran en la AOAC (1984) y en la FDA (1989). Estos métodos suponen la
extracción de las toxinas del marisco, la separación de las proteínas y otras
sustancias interferentes y la inyección del extracto por vía intraperitoneal a
ratones. Los resultados se evalúan como unidades ratón μg/100 g del tejido del
marisco.

Q.F. Oscar Santisteban Rojas 1 Bioensayo del ratón – Determ N volátil

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Prueba en ratones (Respuesta biológica- SOMMER- MAYER 1957)

 Extracto ácido de moluscos: pH 3 – 4

 Unidad Ratón: Cantidad de toxina para matar un ratón de 20 gramos de

peso en 15 minutos

 Estandarización: tiempo de muerte 5-7 minutos

 Se utilizan ratones sanos, hembras, de 19- 21 gramos, cepa CF1. Si

pesan menos de 19 o más de 21 se aplica el factor de corrección de masa
del mismo (tabla de SOMMER)

 Vía intraperitoneal: 1 ml de extracto ácido. Se anota el momento de

inoculación y el tiempo de muerte (último movimiento respiratorio).

 Si el tiempo de muerte es menor a 5 minutos de varios ratones, se diluye

con solución fisiológica acidulada pH 3 para obtener un tiempo de 5 a 7
minutos.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

Materiales Reactivos Equipos

Ratón HCl 5N Licuadora
Beaker x 250 mL HCl 0,1 N Centrífuga
Probeta x 250 mL NaOH 0,1 N
Cuchillo
Tabla de picar

4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL RESUMEN

100 gramos de material se
Experiencia N° 1: bioensayo del ratón (Moluscos bivalvos) coloca en un colador para dejar
escurrir 5 minutos. El líquido
filtrado se desecha. Licuar tal
Preparación de la muestra como está (no añadir agua o
algún otro). Trabajar en
proporción.
• Lavar cuidadosamente el exterior del marisco con agua dulce. Se le puede añadir 100 mL de
HCl 0,1N y licuar.
Se hierve suavemente durante
• Abrir cortando el músculo aductor 5 min. Enfriar. Ajustar el pH a
un valor menor a 4,5
• Se lava el interior con agua dulce, (añadiendo HCl o NaOH, según
se necesite). Completar a 200
para eliminar arena y otras sustancias extrañas mL con HCl 0,1N. Homogenizar
con una bagueta.
Centrifugar. O filtrar a través
• Se separa la carne de las valvas. de papel de filtro fino
(alternativamente se puede
• Se recoge de 150 a 200 gramos y se coloca en un tamiz emplear tela organza)
El líquido a inyectar debe ser
para dejar escurrir 5 minutos. El líquido filtrado se desecha completamente transparente.

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• Se procesa en una licuadora hasta consistencia homogénea

Preparación del extracto ácido

• Se coloca 100 gramos del material bien mezclado en un recipiente resistente

al calor.

• Se añade solución acuosa de HCl 0,1 N, 100 mL

• Se calienta la mezcla y se hierve suavemente durante 5 minutos

• Se deja enfriar

• Se toma pH del líquido. Debe ser menor de 4.5 con papel medidor del pH

• Si se necesita disminuir el pH: utilizar una solución 5,0 N HCl gota a gota

• Si se necesita aumentar el pH: utilizar una solución 0,1 N NaOH gota a gota

• Se traslada la mezcla a una probeta graduada y se completa a 200 ml con agua

pura o levemente acidulada

• Se agita, se coloca en tubos de centrífuga y se centrifuga a 3000 rpm durante

5 minutos

• El líquido sobrante es el extracto ácido

Cálculo de toxicidad

• Determinar tiempo medio de muerte de los ratones y usar tabla de SOMMER

• Cálculo para determinar unidades ratón

VALOR TIEMPO MUERTE x FACTOR DE CORRECCIÓN DE PESO x 200 =

U.R. (si se realizan diluciones se agrega el FACTOR DE DILUCIÓN)

Toxina Tolerancia Método de análisis

Ciguatera No es posible el control Ningún método es confiable

PSP 80 ug/100 g o 400 UR Bioensayo con ratones HPLC

DSP 0- 60 ug/100 g Bioensayo con ratones HPLC

NSP cualquier nivel detecctable /100 g es inseguro Bioensayo con ratones

ASP 20 ug /g de ácido domoico HPLC

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Experiencia N° 2: Determinación del estado de frescura de los productos

de la pesca por medio de la determinación del Nitrógeno Básico Volátil
(N.B.V.) a través del Método de Antonacopoulus

MATERIALES REACTIVOS EQUIPOS

ampolla para la muestra agua destilada
refrigerante oxido de magnesio P. A.
manto calefactor antiespumante de silicona
trozos de material porosos solución de ácido bórico al
erlenmeyer de 250 ml de cuello 2%
ancho ácido sulfúrico al 0,1 N
cuchillo para extraer muestra de Indicador
filete Mezclar un volumen de
taladro con sacabocado con rojo de metilo 0,2% más 3
mecha de 10 mm. (para volúmenes de verde de
congelado) bromocresol
tabla de acrílico 0,1%, o en su defecto
vaso de precipitado pequeño Tshiro (mezcla de
varilla de vidrio colorantes)
pipetas
balanza de 0,1 g
microbureta de 5 cc o bureta
común

Procedimiento

1. Ensayo en blanco

2. Preparación de muestra:

a) si se trata de filete se raspa el músculo por el tercio medio inferior hasta llegar
a la piel. Deben obtenerse unos 50 gramos de muestra que se los mezcla lo
mejor posible.

b) si se trata de pescados enteros se corta un filete del tercio medio y se raspa

como se indicó en el paso anterior.

c) si se trata de pescado congelado se sacan 3 cilindros con el sacabocado,

empleando el taladro eléctrico a no menos de 10 cm. de los bordes y luego se
cortan en pedazos no mayores de 1 mm. Deben obtenerse 50 gramos de
muestra.

3. Proceso

a) pesar 10 gramos de pescado.

b) preparación para la destilación: se vierte en el balón 10 gramos de pescado

ayudados por una varilla, 2 gramos de óxido de magnesio y 1 - 2 gotas de

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antiespumante de silicona. Luego se hace arrastre con agua destilada con

ayuda de una piceta.

c) se coloca en un erlenmeyer 50 ml de ácido bórico al 2%, un ml de indicador y

100 ml de agua destilada.

4. Destilación:

a) se calienta el balón con la llave del embudo del balón abierta, para evitar la
condensación de agua en el aparato.

b) se lleva a ebullición dejando la llave abierta hasta que salga un chorro continuo
de vapor

c) se cierra la llave del embudo y se comienza a contar el tiempo

d) se destila durante 17 minutos con el vástago del refrigerante sumergido en el

erlenmeyer y 3 minuto más con el vástago si sumergir. La regulación del
calentamiento debe ser tal que recoja un volumen de destilado de 130 a 150 ml
en los 20 minutos de destilación.

e) se desconecta y se retira el manto calefactor

f) se abre la llave del embudo del balón

g) se desarma el equipo aún caliente

h) se lavan exteriormente el tubo de conexión, el refrigerante y el extremo exterior

del vástago del mismo con agua destilada, recogiendo el agua de lavado en el
Erlenmeyer

5. Valoración:

a) se valora con la solución de ácido sulfúrico agitando el Erlenmeyer

continuamente

b) en la cercanía del punto final deben lavarse las paredes del erlenmeyer y el
pico de la bureta con chorros de agua destilada, valorando gota a gota hasta
alcanzar el punto final

6. Punto final:

Se considera que se ha llegado a este cuando el color de la solución vira de

verde a gris azulado. Si llega a rojo violáceo es índice que se ha pasado el punto
final

7. Cálculos
0,01401= mili equivalentes del nitrógeno
V= volumen de la solución valorada de ácido sulfúrico 0,1 N gastado en la
titulación (ml).

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N: normalidad de la solución de Ácido sulfúrico.

m: masa de pescado (gramos)

RESULTADOS

CONCLUSIONES

(Generalice sus observaciones y resultados según el tipo de experiencia

realizada)

SUGERENCIAS

CUESTIONARIO

1.- Que métodos, empleando instrumentos se encuentran autorizados

oficialmente para la detección de biotoxinas marinas
2.- Que ventajas y desventajas tiene el bioensayo del ratón
3.- Que relación se produce entre el estado de descomposición o no frescura y
la cantidad de Nitrógeno volátil.

BIBLIOGRAFIA
ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/008/y5486s/y5486s00.pdf

http://www.vet.unicen.edu.ar/html/Areas/Documentos/Trabajo%20Practico%203.pdf

http://ocw.um.es/cc.-de-la-salud/higiene-inspeccion-y-control-alimentario/practicas-1/tema-4.pdf

Q.F. Oscar Santisteban Rojas 6 Bioensayo del ratón – Determ N volátil