COLORANTES Y COLORACIONES

INTRODUCCIÓN:
Para la observación microscópica de microrganismos se puede realizar por montaje
húmedo o coloraciones, estos facilitan la observación de diversas estructuras (Beishir,
L., 1991). Los procedimientos de coloración requieren la preparación de un tendido
frotis de cultivo en bacterias o levaduras, se deja secar al aire y se realiza su fijación por
medio de calor, para evitar que la muestra sea retirada al momento de aplicar los
colorantes y otros líquidos(Case, C.L. y T.R. Johnson., 1984). Esto nos permite el
reconocimiento y observación más nítida de constituyentes celulares, tales como
flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria,
etc(Claus, GW., 1989)
En la práctica realizada empleamos diferentes métodos y reactivos para la fijación de
color en las bacterias, identificando que existen diferencias tanto estructurales como
cromáticas en diferentes especies microbianas observadas (Collins, C.H. y P.M. Lyne.,
1985)

OBJETIVOS:
Que el alumno aprenda las técnicas de preparación de frotis, fijación y coloraciones
más utilizadas en el estudio microbiológico ya sea a partir muestras directas o de
cultivos bacterianos
Identifique las diferentes formas bacterianas y de importancia clínica
Conocer el fundamento de las respectivas coloraciones, así como la aplicablidad de las
mismas.

MATERIALES:
COLORANTES:
A) NATURALES: CARMÍN, Hematoxilina, Tornasol.
B) ARTIFICIALES: Éstos a su vezpueden ser:
a. Básicos: como la tionina, violeta de genciana, fucsina básica.
b. Ácidos: ácido pícrico, fucsina ácida, cosina.
c. Neutros: Eosinato azul de metileno.
d. Indiferentes: Sudán III

SOLUCIONES EMPLEADOS EN COLORACIONES COMUNES:

Azul de metileno de Loeffler:

Azul de metileno …………………………………………… 0.31 gr

Alcohol etílico ……………………………………………….. 30 ml

Solución de KOH al 0.01 % …………………………….. 100 ml

Violeta de Genciana Fenicada:

Violeta de Genciana …………………………………………. 1 gr

Ácido fénico criwstalizado ………………………………… 2 gr

Alcohol etílico …………………………………………………… 10 ml

Agua destilada ………………………………………………….. 100 ml

Violeta de Genciana de Huckel:

Cristal Violeta Oxalato de amonio

Cristal violeta ……………………………………………………. 2 gr

Alcohol etílico …………………………………………………… 20 ml

Oxalato de amonio ……………………………………………. 0,8 gr

Agua destilada …………………………………………………… 80 ml

Fucsina fenicada de Ziehl:

Fucsina básica ……………………………………………………. 0,3 gr

Acido fénico ………………………………………………………. 5 gr

Alcohol etílico ……………………………………………………. 10 ml

Agua destilada …………………………………………………… 100 ml

Solución Yodo – yodurada (Lugol débil):

Yodo ………………………………………………………………….. 1 gr

Yoduro de potasio ……………………………………………… 2 gr

Agua destilada …………………………………………………… 200 ml

Solución acuosa saturada de ácido pícrico

Solución de Safranina:

Safranina O )Sol. Al 2,5 % en alcohol etílico) ……………….. 10 ml

Agua destilada ……………………………………………………………. 100 ml

Alcohol éter (Licor de Hoffman):

Mezcla a partes iguales de alcohol de 95 % con éter

Alcohol acetona:

Alcohol 95 % ………………………………………………………………. 80 ml

Acetona ……………………………………………………………………… 20 ml

Alcohol clorhídrico:

Acido clorhídrico ………………………………………………………… 3 ml

Alcohol etílico ……………………………………………………………… 97 ml
PROCEDIMIENTO:
a) Extensión en lámina porta objeto con asa bacteriológica (nicrom) u otro
instrumento: El asa debe ser esterilizada al rojo en el mechero, antes y después
de su empleo.
b) Fijación: Su objeto es adherir firmemente la preparación sobre la lámina. Se
emplea para éste fin el calor suave o el alcohol éter, éste último es
indispensable cuando se trata de muestras serosas.
c) Tinción: Con el colorante o con el grupo de colorantes elegidos
d) Lavado a chorro
e) Secado: Puede utilizarse el calor suave o el aire a presión
f) Observación(nota): Nunca observe una lámina coloreada, antes de que se
seque, sobre todo cuando va a utilizar lente de inmersión.
RESULTADOS:
COMENTARIOS:
Al final de la coloración, como se vio al microscopio; los gérmenes quedaron teñidos
de violeta o rojo. Los que toman el color violeta, se llaman Gram positivos y los que
toman color rojo, se llaman Gram negativos.
Los gérmenes Gram negativos, son los que han cedido al color violeta por acción del
alcohol acetona y por haber quedado sin coloración, han estado aptos para tomar el
segundo colorante que es el rojo.
La acción del Lugol en ésta coloración, es conseguir una mayor fijación del Violeta por
parte de los gérmenes Gram positivos, por unión del colorante con el yodo del Lugol.
En términos generales, son Gram positivos todos los cocos a excepción de las Nefsseria
y son Gram negativos todos los bacilos a excepción de los esporulados, los
Mycobacterium y Corynebacterium.
La técnica original de Gram ha sufrido muy diversas modificaciones, pero su
fundamento es siempre el mismo. Una de las modificaciones consiste en el empleo de
la Safranina como colorante de fondo en vez de Ziehl.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS:

 Beishir, L. “Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course”.5ª

Ed. Harper Collins Pub. Inc., 1991.
 Case, C.L. y T.R. Johnson. “Laboratory experiments in Microbiology”. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984.
 Claus, GW. “Understanding microbes: A laboratory textbook for microbiology”.
1ª Ed. W.H. Freeman and Co. New York, 1989.
 Collins, C.H. y P.M. Lyne. “Microbiological methods”. Butterworth & Co. (Pub)
Ltd., 1985.